免疫接种是预防传染病最有效的方法。然而，识别新疫苗候选的方法通常是费时费力和旷日持久的。虽然表面蛋白是合适的疫苗候选物，并能引起抗菌抗体反应，但从革兰氏阴性中确定表面抗体的系统方法很少成功。在这里，我们开发了一种联合发现驱动的质谱和计算策略来识别细菌疫苗候选物，并使用一种高度流行的革兰氏阴性病原体验证它们的免疫原性，幽门螺杆菌，作为一种模式有机体。我们用酶切法有效地分离了表面抗原，设计了一种实验策略，从细胞浆蛋白中分离出细胞表面。从总共1，153种定量细菌蛋白中，我们识别出72种表面暴露抗原，并通过计算同源性推断在物种内部和不同物种之间进一步确定候选抗原的优先顺序。接下来我们测试候选特异性免疫反应。从感染患者的血清中识别出所有候选抗体，并在接种小鼠后立即诱导抗体应答。在小鼠治疗性免疫研究中，候选基因JHP_0775诱导了特异性B细胞和T细胞应答，并显著降低了定植水平。在受感染的人身上，我们进一步证明jhp_0775具有免疫原性，并能激活外周血CD4的干扰素γ分泌。+和CD8+T细胞我们的策略提供了一个通用的临床前筛选，筛选和验证的新疫苗候选的革兰氏阴性菌，可用于其他革兰氏阴性病原体。

免疫接种被认为是预防传染病最有效的方法。尽管消灭或控制了许多疾病，但针对人类主要病原体的疫苗--尤其是革兰氏阴性--仍然缺乏，其发展的简化方法也是如此。疫苗设计中的关键挑战之一是选择能够诱导针对病原体的保护性免疫的抗原。为此目的，抗原必须对免疫系统容易获得，并且能够激发特定的体液和细胞免疫反应，而不触发对自身抗原或非致病性微生物的免疫反应。蛋白质抗原由于其序列编码的特异性识别而被广泛应用于免疫系统，然而，从数千种表达的蛋白质中，例如在细菌病原体中，只有少数能达到这些标准。因此，对蛋白质疫苗候选基因的筛选具有很高的价值。

为了确定合适的候选疫苗，筛选方法必须根据生物化学/生物物理和功能特性询问病原体的蛋白质组。抗原的物理可获得性是宿主免疫系统识别免疫原表位的关键。因此，外膜蛋白(Omps)被认为是选择疫苗候选的最有希望的靶点，特别是由于它们在细菌表面的物理可获得性，以及能够被光化抗体结合的能力。1,2,3,4...在硅方法的先驱，必胜客等人.5预测了几种具有抗血清B群能力的OMPS脑膜肽，其中一些抗原最终被包括在诺华4CMenB疫苗中。6.

目前最先进的方法是通过耗时的膜提取或标记策略以及随后的质谱(MS)来识别OMPS。虽然这些策略提供了新的疫苗候选，但它们在区分内膜或外膜定位和探测实际表面可达性方面的能力固有地受到限制。为了绘制细菌表面暴露蛋白的图谱，引入了革兰氏阳性细菌的“表面剃须”方法(rodrguez-ortega)。等人...并对革兰氏阴性菌、单细胞真菌以及多细胞生物进行了评价。7,8...在这里，在活细菌培养物中加入一种蛋白酶来释放表面可接触蛋白质的肽，然而，由于现代的质谱可以检测到甚至微量的蛋白质，很少有溶解的细菌细胞的存在妨碍了对表面暴露蛋白的有效和专属的鉴定，这对革兰氏阴性细菌尤其是一个挑战。9...为了克服目前的局限性，我们开发了一种基于流线型MS的表面剃须方法，该方法同时优化多个实验变量，以识别细胞表面暴露的蛋白质，并将它们与细胞死亡产生的蛋白质区分开来。我们进一步通过致病性细菌属内的高同源性和与其他细菌和宿主的低同源性计算出优先排序的蛋白质。

在本研究中，我们重点研究了革兰氏阴性的人类病原体。幽门螺杆菌到目前为止还没有有效的疫苗。幽门螺杆菌感染了世界上一半的人口，是导致胃癌的主要原因10...由于抗生素耐药性的急剧上升，治疗选择受到越来越多的限制。11，增加了对疫苗的需求，以对抗这种感染。在我们的研究中，我们实验测试了通过管道识别的抗原在人体中的免疫原性，以及在小鼠免疫研究中的有效性。由于感染革兰氏阴性菌对人类健康构成重大威胁，世卫组织确定的前十名中有八名是革兰氏阴性，没有疫苗。12我们的方法为简化针对这些病原体的候选人的鉴定制定了一个范例蓝图。

革兰氏阴性病原体疫苗接种管道的建立

我们建立了革兰氏阴性菌试验和计算疫苗联合使用管道。幽门螺杆菌作为一个典型的有机体，可以从数千种表达的细菌蛋白中识别出少数有希望的候选疫苗。我们的策略结合了统计参数优化(实验设计(Doe)13)用定量MS引导表面修整，然后进行计算和功能验证(图1)。1)。首先，我们分析了注释的丰富程度。幽门螺杆菌蛋白质组结构全面，表达的蛋白质接近1，200个，据我们所知，这是迄今为止这种病原体最全面的蛋白质目录(图一)。2A，补充图。1)。我们的蛋白质组学分析涵盖功能蛋白类(平均92%)和80%的所有推定膜相关蛋白(图1)。2B).

新产品的发现和验证工作流程幽门螺杆菌候选疫苗。(1)采用优化的剃须条件进行分离表面暴露蛋白的实验设计。活的文化幽门螺杆菌用胰蛋白酶处理，上清液用.2)定量质谱。重组蛋白生产后，根据蛋白质的富集特征对其表面暴露情况进行评价。(3)根据候选人的保守性和选择性进一步选择候选人。(4) 体内验证：评估候选人在小鼠中的有效性，以及它们在人类中激发B和T细胞反应的潜力。

全尺寸图像

表面暴露蛋白的鉴定和候选人的选择。(A)条形图描述不同条件下量化蛋白质的数量(量化事件的中位数)。误差条表示标准差(Prot：整个蛋白质组量化，ctl：对照，T：胰蛋白酶处理，10，20或30分钟：生物：生物素化)。对照包括不添加胰蛋白酶(ctl 10、20、30)和不加生物素化的样品(ctl生物)。(B)关于本研究中所有量化蛋白质(包括所有条件)的个别功能群的覆盖率(注释，见补充表)。标有“all”的方框图描述了具有组大小的所有注释的覆盖率(整个批注蛋白质的数量)。硅中蛋白质组)>4。C)Venn图描述了至少3个重复(“强度”)中蛋白质的重叠。蛋白质是被过滤的污染物，只有侧面和反向鉴定。“控制”包含所有时间过程控制样本，剃须包含所有时间过程剃须样本，蛋白质组包含所有完整蛋白质组样本。(D)无监督层次聚类和显著相关蛋白热图(复制中位数，z评分)。簇C1(蓝色)和c2(粉红色)显示了蛋白质表面结合和/或分泌的预期模式，并被选定为可能的表面相关疫苗候选，用于随后的分析和排序(E)C_1和C_2簇蛋白的提取谱。胰蛋白酶剃须样品呈绿色。(F)火山图描绘了注释，在簇1和簇2中富集和富集，与在一段时间内发现的所有蛋白质相比较(包括对照样本)。浓缩用Fisher精确检验计算(见补充表聚类富集)。带膜的蛋白质富集p值<0.0001.(G)直方图(对数计数)，显示72名候选细菌与细菌蛋白的身份(不包括细菌蛋白)。幽门螺杆菌)。候选人的身份低于33%。(H)散点图显示72个表面蛋白与人类蛋白质的一致性。所选候选人的身份低于5%，e值[−log 10]小于1。I)剩余候选蛋白质的热图，显示其与所有264种蛋白质的同源性。幽门螺杆菌菌株。通过染色实验进一步表征其表面暴露的蛋白质疫苗候选物(图一)。3)标记为绿色。“集群1/2”注释表示关联的蛋白质集群(D,E).

全尺寸图像

接下来，我们测试了生物化学捕获细菌细胞表面暴露蛋白的实验方法。我们评价了表面蛋白的生物素化和链霉亲和素的纯化。14，这是最常用的冲浪识别技术。15,16,17,18，并鉴定出565种蛋白质(附图)。2)。由于我们的质谱管道检测到微量的蛋白质，我们不能排除在这565种蛋白质中，我们发现了很大一部分细胞质蛋白，例如由于细胞溶解或连接物扩散到细胞中。为了评价生物素化鉴定表面蛋白的效率，我们进行了富集分析。我们没有观察到膜相关蛋白(补充表生物素化)的显著富集，表明检测到的信号中有一部分来自细胞质蛋白的标记，这反映了这种定性读数的局限性。

因此，我们的目的是用胰蛋白酶裂解活菌来定量测定酶释放的蛋白质肽与未用胰蛋白酶处理的细菌相比，来评估蛋白质表面的暴露程度。我们使用了相当温和的缓冲条件和定量富集，因为它已经被用来确定蛋白质与蛋白质的相互作用。19,20...我们开始评估一种类似的策略，使用定量数据而不是定性数据来解释来自胞浆蛋白的背景信号。为了探讨细菌代谢活性的影响，我们将PFA固定在我们的屏幕上。这使得从表面分裂中富集的肽能够从那些与代谢活性细菌分泌的囊泡相关的肽中分离出来。

由于胰蛋白酶的长时间切割与细胞死亡增加和胞浆蛋白的释放有关，我们优化了细胞表面肽的修饰以减少细胞内蛋白的释放(附图)。3)。为此，我们利用荧光标记的细菌，因为细胞内的蛋白质泄漏可以用高通量的形式定量测量。我们模拟了不同的实验变量，如孵化时间和缓冲液成分，同时使用DoE和细胞裂解作为定量读出(补充图)。3).

在我们优化的剃须过程中，即使是背景过程释放的少量蛋白质，我们的质谱仪流水线的高灵敏度也表明了这一点，例如在所有条件下大量量化的蛋白质和定量蛋白质的重叠(见图)。2A、C)。定性的表面候选选择是基于样本中是否存在一个蛋白质来进行背景分析，这是一个概念性的问题。相反，我们的定量无标签蛋白质组工作流程使我们能够确定不同样本之间即使是微小的蛋白质丰度差异。21...基于这个工作流程，我们设计了一个逐步选择的过程，利用一个高的定量精度来区分最有希望的表面疫苗候选蛋白和背景。

表面的蛋白质幽门螺杆菌在整个胰蛋白酶治疗过程中都会增加。在第一步中，我们对1153个量化数据进行了相关分析(见资料和方法：相关分析)。幽门螺杆菌鉴定146个表面蛋白的蛋白质幽门螺杆菌与胰蛋白酶治疗的时间(10 min，20 min，30 min)相关。146个候选蛋白的分层聚类表明，在剃须条件下，73个蛋白质中有两个簇(簇1和2分别以蓝色和紫色表示)，而对于无胰蛋白酶的对照样品来说，它们的信号始终很低(如图所示)。二维空间，补充图。1B)。值得注意的是，许多蛋白质在30分钟前达到最大信号。具有较高代谢失活丰度的蛋白质幽门螺杆菌对照组(无胰蛋白酶)除外(附图)。1B)。在对73种表面蛋白的注释富集分析中，我们观察到膜蛋白的显著富集和胞质蛋白的耗竭(图一)。2F)如预期的表面相关蛋白。

有趣的是，在这73个蛋白质中幽门螺杆菌在胰蛋白酶存在下，只有54种蛋白质被完全富集(图1)。2D，E，第1组)。其余19种蛋白质(簇2)除了表面暴露的强信号(高胰蛋白酶条件)外，还显示代谢活性(pFA、−)控制样品的丰度增加。2D，E，第2组)。在此基础上，我们假设簇2可能包含在囊泡表面分泌的蛋白质。幽门螺杆菌.

进一步缩小候选蛋白质的范围体内疫苗研究，我们优先考虑候选硅中类似莫菲特等人.22...为了尽量减少对其他细菌和人类的交叉反应，我们筛选出的蛋白质与任何其他细菌的氨基酸序列同源性低于33%，与人类蛋白质的同源性低于5%(图一)。2G，H)。支持泛保护幽门螺杆菌，我们确认了264个Uniprot注释的其余22名候选人的身份。幽门螺杆菌蛋白质组(图1.2I和表1).

暴露疫苗候选疫苗的验证离体和体内

作为概念的证明，我们接下来的目标是确认所选疫苗候选的表面暴露和免疫原性。我们选择了5种候选疫苗(JHP_0775、JHP_0173、JHP_0119、JHP_0552、JHP_1103)，并对其进行了重组表达和纯化。大肠杆菌(补充图。4A-J)。我们用重组蛋白免疫小鼠，并使用纯化的多克隆抗血清(附图)。4K)染色CFDA-SE(羧荧光素二乙酸琥珀酸琥珀酸酯)标记细菌(选通策略见附图)。6A)。所有被分析的候选人通过流式细胞术显示出强健的染色频率，远远高于模拟对照或细胞质蛋白，证实了他们的表面暴露(如图所示)。3A)。接下来，我们选择了以前未表征的蛋白jhp_0775作为体内功效实验，因为它显示出与所有人最高的同源性。幽门螺杆菌菌株(98.5%)，是世界上最丰富的200种蛋白质之一。幽门螺杆菌蛋白质组(附图)1)。我们用JHP_0775对小鼠进行免疫治疗，以探讨慢性感染环境中免疫应答的增加程度。为此，我们首先用幽门螺杆菌SS1株以JHP_0775和霍乱毒素(CT)为佐剂进行免疫。免疫后4周，JHP_0775免疫小鼠显著减少。幽门螺杆菌定植水平与对照(模拟/CT)免疫小鼠比较(图)。3B)。用抗原特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定体液免疫应答，免疫后抗原特异性IgG水平明显升高(图一)。3C)。为表征细胞免疫特性和定量Th1、Th17免疫应答，用重组JHP 0775对免疫小鼠脾细胞进行再刺激，流式细胞仪检测CD4+T细胞产生细胞因子IFNγ、TNFα、IL-2和IL-17的频率。三维空间和补充图。6B)。与强烈的细胞免疫反应一致，我们观察到除干扰素γ外，所有细胞因子水平均显著升高。这种细胞免疫反应与对hpa的反应相当，hpa是一种描述得很好的。幽门螺杆菌已知的疫苗候选在HPA免疫小鼠中诱导T细胞反应(见图)。三维空间)23.

疫苗候选物表面暴露的确认及JHP_0775的治疗效果幽门螺杆菌小鼠感染模型。(A)用纯化的抗血清检测疫苗候选物(灰条)和对照组(白条)的染色强度，用纯化的抗血清对候选疫苗进行染色，并用于染色cfda-SE标记的表面。幽门螺杆菌...以HPA免疫小鼠的抗体为阳性对照。这个幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶(HPG)作为附加对照，因为它被确定为周质和分泌蛋白[68]。HPA和HPG分别进行高强度和低强度染色，验证了实验装置的正确性。(B)小鼠被感染幽门螺杆菌SS1用JHP_0775和霍乱毒素(CT)免疫，或单独用CT作为对照。胃幽门螺杆菌定殖率为每毫克胃集落形成单位(CFU)。(C)ELISA法检测JHP_0775抗原特异性血清IgG反应。(D)用流式细胞术(填充、解闷)、JHP_0775免疫小鼠脾细胞再刺激(未填充、静止)、JHP_0775和HPG作为抗原(圆环)以及以CT为佐剂、HPA和HPG为抗原(三角形)免疫小鼠，用流式细胞仪分析CD4~+T细胞产生的细胞因子。数据显示为平均值±SD。P-值分别采用非参数Mann-WhitneyU检验和Šidák多重比较试验，分别测定定殖水平和细胞因子反应。各组间星体差异有显着性(*p<0.0001.0 5，**p<0.0 1，*<0.0 5)。

全尺寸图像

人体免疫原性的确认

为了验证5位候选人的免疫原性，特别是JHP_0775，我们分析了被感染的志愿者的体液和细胞反应。幽门螺杆菌...虽然在慢性感染中对特定抗原的强烈免疫反应可能表明这种反应不能根除病原体，但对保守抗原的免疫反应可能表明候选蛋白在人类中不具有免疫原性，或者没有正确的表达。因此，我们最初通过分析以Luminex为特征的人类患者群体的血清，来量化受感染人中先前存在的体液反应的程度。®基于珠的分析(表)2)。Flid是一种鞭毛相关蛋白，我们的研究小组已经确认它是一种高度敏感和特异的生物标记物。幽门螺杆菌感染，作为阳性对照24，以及hpa，一种经常用作疫苗候选的表面蛋白。25...有趣的是，尽管细菌表面暴露了抗原，但大多数候选疫苗的抗体应答率都很低。在……里面幽门螺杆菌感染，以及许多其他病原体，细胞免疫系统是建立有效的免疫反应和免疫效果的关键。幽门螺杆菌高度依赖于T细胞反应26...因此，我们通过在ELISpot法中检测干扰素γ的分泌，来测试我们选择的候选基因JHP_0775在感染患者外周血单个核细胞中诱导细胞反应的能力(图1)。4A)。经重组JHP_0775再刺激后，4例患者中有1例出现了大量的干扰素γ分泌细胞。该病人对JHP_0775有特异性反应，而对已知含有T细胞表位的蛋白HPA无反应。27...未刺激阴性对照未见斑点，而葡萄球菌肠毒素B(SEB)和MHCⅡ类CD4肽池刺激阳性对照分别证实了免疫细胞和CD4记忆T细胞的功能。因此，作为我们的方法的概念证明，jhp_0775被确认为体内并在感染患者中诱导抗原特异性细胞反应，但在所有感染患者中并不容易检测到。几种细胞在抗原提呈细胞的刺激下都能产生干扰素γ。为了进一步分析JHP_0775触发细胞免疫应答的能力，我们采用细胞内细胞因子染色法分析了人外周血单个核细胞源性干扰素γ分泌的细胞来源。来自ELISpot反应性供体的PBMCs显示产生CD4的干扰素γ的特异性增加。+和CD8+流式细胞术中T细胞与非反应性供体的比较(图一)。4B；选通策略：补充图。6C)。因此，体内，都是CD4+和CD8+T细胞对感染后的JHP_0775抗原表位和疫苗均有反应。

人对JHP_0775的免疫应答。(A)ELISPOT分析显示细胞对HPA和JHP_0775的免疫应答。以葡萄球菌肠毒素B(SEB)和MHCⅡCD4肽库为对照。每口井左上角的数字表示每口井对应的点位数.Neg ctrl，无刺激的阴性对照(B)用高免疫原性JHP_0775刺激感染患者外周血单个核细胞(PBMC)。幽门螺杆菌抗原CagA和PMA/离子霉素为阳性对照，CD4为阳性对照+和CD8+流式细胞术分析干扰素γ产生细胞。干扰素γ产生细胞的百分比在每个小区内显示。阴性对照组不刺激PBMCs，PMA/Ionomycin作为阳性对照刺激，高免疫原性刺激PBMCs。幽门螺杆菌抗原CagA和JHP_0775检测干扰素γ分泌的特异性。

全尺寸图像

总之，我们的新疫苗发现管道，它结合了定量质谱，计算候选特征和选择，以及体内验证，显示有几种蛋白质是有前途的幽门螺杆菌候选疫苗。在小鼠中，JHP_0775在免疫后显著降低定植水平，与体液和细胞免疫应答增加有关。在人类中，jhp_0775能够激发细胞免疫反应，从而导致γ产生CD4。+和CD8+T细胞，这两者都被认为是重要的相关保护。

疫苗的历史是一个成功的故事。疫苗导致了天花的根除，并大大减少了麻疹、破伤风、白喉和百日咳等其他疾病的死亡人数。然而，对于许多具有重大临床和社会经济影响的传染病，仍然缺乏有效的疫苗接种策略。此外，抗生素耐药性的蔓延使有效预防疾病的需求上升，并强调了接种疫苗的重要性。因此，需要有效和快速的策略来筛选新的候选疫苗。这对革兰氏阴性病原体尤为重要，因为这些病原体在世卫组织的优先病原体清单中占主导地位，但没有疫苗可供使用。

为了从数千种细菌蛋白质中筛选出最有希望的靶点，一种很有前途的策略是将重点放在病原体暴露表面的蛋白质上。7或者，在细胞内病原体的情况下，在宿主细胞上。8...多年来，已经开发了各种分离细菌表面暴露的蛋白质的协议。这些方法已被用于确定潜在的疫苗候选。7,28...剩下的挑战是提供一种通用的、适应性强的策略来解释背景裂解，特别是对革兰氏阴性细菌来说，这些细菌对裂解更敏感。9.

高动态范围和高丰度污染的胞浆蛋白需要标记和正交富集策略或生物信息学过滤，例如基于信号肽的预测或定位，以消除来自细胞裂解的蛋白质。7...虽然从背景裂解中提取的蛋白质缺失的实验解剖增加了假阳性(非表面暴露)蛋白的数量，计算过滤通常与假阴性相关，因为许多蛋白质是基于公共领域数据库中不完整或不正确的注释而被排除的。因此，与我们的策略相反，以前的尝试倾向于识别极少数高度丰富的表面蛋白。28,29.

我们的管道方便了一种简单的适应，以筛选其他病原体的疫苗候选。一种基于DoE的优化策略在减少背景分析的同时，一般地改进了系统映射，从而为一般策略提供了概念上的优势。30...此外，通过比较代谢活性细菌(pFA−)和失活蛋白(pFA+)中蛋白质的逐渐增加，我们提出了一种区分表面暴露于分泌蛋白的策略。然而，还需要通过过滤或密度离心分离囊泡的其他研究来验证这一假设。与广泛使用的细胞表面生物素标记相比15,16,17,18，我们的方法得到了较低的胞浆背景检测结果。幽门螺杆菌可能还有其他革兰氏阴性病原体。然而，基于DoE的表面生物素化实验优化与胞浆蛋白的最小共标记可能是一个有趣的未来研究策略。

在我们的表面剃须策略中，我们使用胰蛋白酶来消化细菌表面的蛋白质。胰蛋白酶经精氨酸和赖氨酸残基切割后，产生的肽平均长度为14个氨基酸。优点是这些肽在蛋白质组中很有可能有独特的序列。31...然而，细菌表面的蛋白质组学分析可能偏向于具有胰蛋白酶切割位点的蛋白质，因为精氨酸和赖氨酸--胰蛋白酶裂解后的氨基酸--分布不均匀。32...我们和其他人之前已经证明，多种酶的结合为克服这种偏见提供了一种实验策略。33,34,35...虽然我们的方法不需要完全的蛋白质序列覆盖，因为差异蛋白质丰度是通过对肽的MaxLFQ算法进行比较推断出来的。21对未来的研究来说，使用多种酶来更全面地映射暴露的蛋白质结构域将是很有意义的。

本研究的一个潜在局限性是幽门螺杆菌在宿主的胃中暴露在非常恶劣的条件下，并可能重塑蛋白质组体内...因为我们的覆盖率很高，近80%幽门螺杆菌蛋白质组(80%的膜蛋白)我们不期望错过一大部分候选蛋白质。然而，我们不能排除某些蛋白质，特别是那些在免疫逃避中很重要的蛋白质，只在宿主环境中表达。学习将是非常有趣的。幽门螺杆菌暴露在模仿人类胃的条件下。

菌株间抗原序列保守性和通用性的实验测定是实现广泛交叉保护的共同挑战。我们的计算过滤策略的保护增加了成功的确定合适的疫苗候选，有三个原因。首先，它增加了实现PAN保护的可能性，尤其是对于具有高遗传变异性的病原体，例如幽门螺杆菌36...第二，该属内高度保守的蛋白质可能是特定细菌致病所必需的。第三，与其他物种相比，较低的保守性将降低诱导对共生细菌产生免疫反应的风险。在任何情况下，由于黏液胶囊，多糖侧链和糖脂存在于许多革兰氏阴性菌的表面蛋白的有限可及性应考虑和实验排除，如本报告所做的与特定的抗血清表面染色。

适合临床发展的疫苗候选在动物模型中应该是有效的，并且能够在人类身上触发B和T细胞免疫反应。特别是对于幽门螺杆菌，包括B细胞和T细胞反应在内的广泛免疫反应似乎对保护是必要的。37...我们首次在小鼠免疫研究中发现，抗原JHP_0775诱导了特异性B和T细胞应答，并显著降低了该抗原的定植水平，验证了该抗原的保护能力。然而，针对抗原表面蛋白可能不足以预防或消除感染，因为复杂的宿主免疫反应，疫苗候选的有效性将取决于宿主免疫细胞，抗体，复制生物体，以及逃避宿主防御的病原体在慢性感染。必须指出的是，啮齿动物不是自然宿主。幽门螺杆菌，而“人工”定植需要较高剂量的细菌来适应老鼠。38...因此，在免疫研究中，不孕症几乎从未被观察到，而减少1对数的定植通常被认为是一种保护。39...本模型中缺乏干扰素γ可归因于近交系BALB/c小鼠株，在采用免疫策略的情况下，其干扰素γ应答普遍较低。40...事实上，当我们评估人类T细胞反应时，来自感染患者的CD4+和CD8+T细胞分泌干扰素γ，如ELISPOT和ICCS所示。另一方面，所选择的抗原在一个特征良好的人类群体中显示出低到中等的血清反应性。

这种低但可检测到的基线血清反应性和T细胞反应是慢性感染情况下新型疫苗候选疫苗的理想特性。在慢性感染中，免疫系统无法根除病原体，这部分可能是由两个功能不同的蛋白质类介导的：(1)暴露在细菌表面但宿主免疫系统只识别微弱的蛋白质；(2)主动削弱宿主免疫系统的蛋白质。在这两种情况下，这些蛋白质有助于免疫逃逸，从而建立和维持慢性感染。特别针对这两类蛋白质的免疫系统，可以提供一种未被开发的潜力来根除导致慢性感染的病原体。

总之，我们建立了DoE引导的剃须蛋白质组学与计算候选优先级和功能免疫原性分析相结合的简化组合，以确定JHP_0775是一种新的方法。幽门螺杆菌候选疫苗。因此，我们的研究提供了一个通用的路线图，以促进快速疫苗候选发现，并广泛应用于其他细菌病原体。

重组蛋白大肠杆菌

前耕

化学能大肠杆菌用产质粒转化BL 21(DE3)，接种在含有合适抗生素的LB板上，孵育至可见单个菌落。选择单个菌落接种含合适抗生素的LB培养基。培养量至少为生产培养量的1/50。在37°C强烈摇动下隔夜孵育后，将主要生产培养接种到OD上。600并根据所采用的表达系统和诱导方法进行孵育。

T7启动子系统的自诱导

自动归纳法基本上按照(Studier2005)的描述进行。简单地说，接种后，细菌在37°C，250到275 rpm(摇床直径2，5厘米)生长，试图确保最大的氧传递速率高细胞密度增长。41-添加2mm MgSO的自诱导棒肉汤(TB)培养基中4、100 mg/L硫酸卡那霉素(Carl Roth)、0.2 g/L PPG 2000(Sigma Aldrich)和0.2%(w/v)一水乳糖(Sigma Aldrich)，直至OD值600达到1-2。随后，气温降至25摄氏度，并在夜间自动诱导，通常达到最终OD值。600第二天早上10点到15点。为了促进不溶性蛋白质的产生，诱导温度在37°C保持不变。在预冷的Sorvall RC-6 Plus离心机(ThermoFischer)中，用SLA-3000转子在6000 g离心15 min，在预冷的Sorvall RC-6 Plus离心机上收集细菌，直接处理蛋白质纯化或刮入可密封的塑料袋，并保存在−20°C。

利用IPTG诱导的T7启动子体系

细菌的生长被描述为自我诱导，但经过轻微的修饰。TB培养基不含一水乳糖。在达到OD后600在2-3℃下，温度降至25℃，再孵育1~1，5小时，再加入1mm异丙基-β-D-硫代丙酰吡咯烷酮诱导。e(IPTG，股票浓度1M)。

利用AHT诱导的Tet启动子系统

所述蛋白质为IPTG，但以每升培养物200克盐酸四环素(AHT)为诱导剂(原料浓度为2mg*ml)。−1在乙醇中)。

重组蛋白纯化

细胞分裂及饲料制备

细菌被重新悬浮在每克生物湿重(BWW)10毫升的冷NiNTA缓冲液A(100 mm Tris，500 mm NaCl，pH 8.0)中，添加0.1mm AEBSF-HCl，150 U/g BWW DNase I和5mm MgCl。2与超高速T25数码(宜家)在10，000至14，000转每分钟30至60秒。用PANDA 2000(Gea Niro Soavi)高压均质法在4°C下3代培养3代细胞，25000 g离心30 min，4°C离心30 min。如果上清液中含有重组蛋白，则用0.2M滤池过滤去除残留的颗粒。如果蛋白位于球团中，则丢弃上清液，用超高速T25数码(IKA)在10 000~14 000 rpm下再悬浮30~60秒，每克颗粒“NiNTA展开红A”(100 mm Tris，500 mm NaCl，6 M GuaHCl，1 mm DTT，pH 8.0)缓冲液中加入盐酸胍作变性剂和DTT还原剂。然后在4°C下搅拌30 min，在4°C下离心25000 g澄清30 min。

色谱装置

对于色谱，在2到8°C(Kta)使用了一个自动的FPLC系统。TM前卫25，通用医疗)。用A5，A6和A7进口20%乙醇，1M NaOH和H，研制了标准进气系统。2O和入口B5、B6和B7分别用0.2 M乙酸、2M NaCl和H处理20%乙醇。2分别没有。出口1连接到一个废镍容器。此设置简化了两个功能：几乎所有的列在使用后都可以被清除(CIPed)，而无需使用通用的CIP程序切换缓冲器；NiNTA色谱可以为不同蛋白质的顺序运行自动化。因此，这一设置允许顺序，自动化和无人值守的多个蛋白质纯化。

细胞裂解上清液的NiNTA色谱

蛋白质经连续镍亲和层析和大小排斥层析纯化。用NiNTA缓冲液A预平衡，NiNTA缓冲液A 10柱体积(CV)与2%NiNTA缓冲液B(100 mm Tris，500 mm NaCl，500 mm咪唑，pH 8.0)混合，以15 CV线性梯度至75%NiNTA缓冲液B洗脱的结合蛋白。−1使用10 kDa分子质量截止自旋浓缩器。每次使用后，柱按照制造商的指示完全剥离，用5 CV 1 M NaOH清洗(CIP)，停留时间至少30分钟，再用NISO充电。4保存在20%乙醇中。所有含镍液体都被收集在一个特殊的废瓶中。

不溶性蛋白质组分的NiNTA色谱

不可溶质产生的蛋白质被纯化，如描述的可溶性蛋白，但变化很小。在装载含有上清液的DTT之前，HisTrap FF粗柱(GE Healthcare)是根据制造商的指示为减少条件而准备的，因为必须注意清除所有未螯合的镍离子。柱用5 CV NiNTA缓冲液A平衡，空白洗脱5 CV NiNTA缓冲液B，再平衡5 CV“NiNTA展开红A”。然后，以“NiNTA展开红B”(NiNTA展开红A+500 mM咪唑)作为洗脱缓冲液，按上述方法对原料进行负载、洗涤和洗脱。洗脱峰组分被收集、混合并浓缩至至少10毫克*毫升。−1用10 kDa分子量截留自旋浓缩器进行快速稀释复性。

蛋白质快速稀释复性

经NiNTA层析和浓缩后，展开蛋白和还原蛋白被快速稀释复性。这里使用的折叠式缓冲器含有大量精氨酸--一种有效的蛋白质复性增强剂(Baynes)。等人...2005年；Arakawa等人...2007年；Tischer等人...2010年)-DTT保持减少的条件。蛋白质浓缩后，预冷复性缓冲液(330 Mm Argpo)过剩20倍。410 mm DTT，pH7.4)置于磁力搅拌器上。在4℃时，在微搅拌条件下，将蛋白滴加到复性缓冲液中，孵育45分钟，无菌过滤。如上文所述，滤液被重新应用到NiNTA柱上，略有变化。采用“NiNTA还原A”(NiNTA缓冲液A+5mm DTT)还原条件，用NiNTA缓冲液A负载并洗涤蛋白质，停留时间45 min，允许二硫键的控制氧化。然后，用NiNTA缓冲液B洗脱蛋白，用大小排阻层析将其混合、浓缩、抛光。

尺寸排斥色谱

5毫升的NiNTA纯化和浓缩蛋白被加载到HiLoad 16/600 Superdex 75 pg或200 pg(GE Healthcare)柱上，用配方缓冲液(330 mm arginine/h)预平衡。3阿宝4，pH 7.4)，以1ml/min的流速洗脱。−1...最后，将与单体峰或确定的多聚物峰对应的蛋白质组分集中在一起，浓缩至至少1毫克*毫升。−1在−20°C或−80°C下进行标定，凝胶过滤校准试剂盒按生产厂家的指示使用(GE Healthcare)。对得到的标定曲线进行了拟合，得到的方程用于随后的分子量计算。纯化蛋白质后，柱用0.5~1CV~1MNaOH，停留时间至少为60 min，用2CV的H洗涤。2在20%乙醇中贮藏。

血清多克隆抗体的纯化

用蛋白A亲和层析法从小鼠血清中分离纯化多克隆IgG抗体。因此，1毫升TM用蛋白A缓冲液A(20 MM Na)5 CV平衡Ge保健柱(Ge Healthcare)2HPO4、140 mM NaCl、pH7.2)。1只小鼠血清在蛋白A缓冲液A中稀释至10 ml，经无菌过滤去除颗粒，固定时间2~3 min，具有较强的动态结合能力。然后用蛋白A缓冲液A的15 CV洗涤柱，以100%蛋白A缓冲液B(100 mM柠檬酸，pH3.0)为步骤等洗脱结合抗体。为了中和洗脱缓冲液的pH值，将每1毫升洗脱液中200毫升的1 M Tris pH9.0预填充到96深井收集板中。然后，将含有抗体的组分混合在一起，透析出抗pbs，浓缩至2mg*ml。−1保存在−80°C。

SDS-PAGE

凝胶被浇铸到1.0毫米的Novex中®以分离凝胶(8%~15%(w/v)丙烯酰胺、375 mm Tris-HCl pH 8.8、0.1%SDS、0.1%APS和0.1%TEMED)和堆积凝胶(5%(w/v)丙烯酰胺、125 mm Tris-HCl pH 6.8、0.1%SDS、0.1%APS和0.1%TEMED)为原料，在95°C下加热5 min，制备出凝胶盒(LifeTechnologies)。对重组蛋白，用1~10μg/L的方法进行纯度测定。将凝胶置于XcellSureLock™微型细胞电泳系统室(LifeTechnologies)，在170V下分离蛋白质90~120分钟。另一种方法是用螺栓进行样品的制备和分离。®-系统(热费舍尔科学)与4-12%的双-Tris+预制件凝胶。随后，用Coomassie染色液对凝胶进行染色，检测限约为每带100 ng(舍甫琴科)。等人...或与快速科马西™染色(Serva电泳GmbH，海德堡，DE)，检测限为每条5纳克。

内毒素含量定量

用内皮LISA法测定重组蛋白的内毒素含量®根据生产厂家的指示，采用ELISA法进行内毒素检测。荧光测量用无限®F200Pro荧光阅读器(Tecan)分别配备380/20 nm和465/35 nm激发和发射带通滤波器。为了确保测量在标准曲线内，蛋白质用无内毒素水稀释10、100、1000和10000倍。在数据分析方面，采用乙状结肠曲线拟合标准曲线，荧光值在0.05~100 EU*ml之间。−1在动态范围内。

患者血清Luminex分析

卢米内克斯®用ELISA法检测人血清对候选疫苗的血清学IgG反应。抗原被透析到理论缓冲液超过1000的无胺缓冲液(20 Mm NAP)上。i，500 mm NaCl，pH 7.4)，利用标准的EDC-NHS耦合策略，实现对羧化MagPlex微球的固定化。抗原浓度大于0.1mg*ml。−1...抗原失活与腔®多路复用微珠阵列实验基本上如前所述(Filomena)等人...2015年；Platscher等人...)，使用一组特征良好的患者队列幽门螺杆菌尿素呼气试验阳性血清378份，阴性血清299份。

小鼠感染和免疫

老鼠的毒株和外壳。购买了6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Winkelmann GmbH)，并在特定无病原体条件下将其安置在MIH(德国慕尼黑医学微生物学、免疫学和卫生技术大学)。所有动物实验都是按照欧洲关于保护和使用实验动物的指南进行的。实验由“Regierung von Oberbayern”动物福利委员会批准。55.2-1-54-2532-107-16)

实验性感染幽门螺杆菌. 幽门螺杆菌感染基本上如前所述(Semper)等人...(2014年)。在感染前4到6小时，小鼠被禁食。1×109 幽门螺杆菌SS1悬浮于含10%FCS的200 lBB培养基中，口服200 l，3次，间隔2天。每组8只小鼠。终止后，CO将小鼠处死。2吸入。

定植量评价定殖幽门螺杆菌从小鼠胃、电镀和计数菌落形成单位(CFU)。因此，在PBS中，胃被打开，残留的食物被去除。然后取一片15~30 mg，立即浸泡于1ml BB培养基中，加入10%FCS。通过涡旋5分钟将细菌从胃中分离出来。随后，将100μl的上清液直接(1：10)镀在WC-凹板上，另一个100升依次稀释，外加1：100和1：1000的电镀稀释液。然后，在37°C条件下，在微氧条件下孵育5天，计数CFU。计算时考虑了含有1~400个菌落的平板，通常跨越两种稀释液，并计算出每毫克胃组织中CFU的相应平均值。

候选疫苗的免疫原性。免疫野生型BALB/c小鼠，检测候选疫苗的免疫原性和抗血清水平。腹腔内(I.P.)以30g抗原和10g霍乱毒素(CT、Sigma Aldrich)为佐剂，间隔1周4次。抗原和佐剂在配方缓冲液中稀释200升。最后一次免疫后1周处死小鼠，用肝素预处理针头采血。取血在10000 g离心10 min，取血浆。血浆保存在−20°C，或直接用于纯化抗体。

候选疫苗的治疗效果。为了测试所选疫苗候选疫苗的有效性，小鼠在治疗装置中接种疫苗。野生型雌性BALB/c小鼠口服10只8 幽门螺杆菌第0、2、4天分别口服SS1，第28天口服免疫，口服联合免疫。在第35和42天。单抗原口服免疫，100 g与10μg CT联合应用，多抗原联合应用，每种抗原30μg。为I.P。免疫，每抗原30g，用10μg CT免疫。抗原和佐剂在配方缓冲液中稀释200 ml(330 mm ArgPO 4，pH7.4)。第70天，处死小鼠，从胃中提取细菌，并在琼脂板上镀上。

免疫化学方法

Westernblot

Westernblot检测免疫血清对重组蛋白的亲和力标记或功能检测。SDS-PAGE和半干印迹缓冲液平衡后，将凝胶置于浸泡的Whatman纸之间，置于甲醇活化的0.45M PVDF膜上。除去气泡后，蛋白质在横流中被擦掉。®SD半干式转移池(Bio-Rad)，每厘米2mA2110分钟。然后用添加5%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T阻断膜，清洗后加入1%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T中，在室温或4℃下孵育1h。洗涤后加入二次抗体-HRP结合物，室温孵育1h，洗净。用TBS-T洗涤4次，共10 min.为了检测，根据制造商的指示，制备了ECL Westernblotting底物(皮尔斯生物技术)，并将其均匀地分散在膜上。孵育1分钟后，用照相胶片或化学凸轮ECL成像仪(INTAS)CCD成像仪在30秒至10分钟内对信号进行增量检测。

ELISA法

用抗原特异性ELISA法分析体液免疫应答，相应抗原(1g*ml)−1)在PBS上涂上了一层MaxiSorb。TM96孔微滴度板(Thermo Fischer)在4°C下过夜。随后，用SmartBlock(坦率)堵住井，血清加入1：100至1：100000的系列稀释液，37°C孵育1h，然后加入1：10000的二次抗鼠IgG-HRP结合物(Abd Serotec)，37°C孵育1h，加入TMB底物溶液，用2 N H停止酶促反应。2所以4三分钟后。用PBS/0.05%Tween 20洗涤4次。在InfinedF200Pro(Tecan)中，在450 nm处测量吸光度，在620 nm处进行背景校正。

流式细胞术分析

细胞内细胞因子染色

用细胞内细胞因子染色法(ICCS)对免疫组和对照组的脾细胞进行抗原特异性细胞免疫反应分析。将脾脏移入3ml RPMI+培养基中，冷冻保存，直至制备完毕。用70M细胞滤器制备脾单细胞悬液。红细胞裂解用3 ml ACT缓冲液(17 mm氯化铵，153 mm Tris)孵育7 min。洗涤后，细胞再悬浮于8ml培养基中。1毫升细胞悬液在24孔板中用75克抗原刺激2小时，温度37°C，然后，GolgiPlug。TM在夜间加入抑制细胞因子的分泌，导致细胞内细胞因子的积累。在细胞染色方面，首先用EMA标记细胞，以实现活/死的鉴别。洗涤后，表面标记物CD4被染色。细胞固定/细胞周期™+(BD生物科学)通透性后，细胞内细胞因子用抗干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和白细胞介素17抗体进行染色。用1%PFA固定细胞，流式细胞术在CyanADP 9彩色分析仪(贝克曼库尔特)上进行筛选和分析，对CD4阳性的活淋巴细胞进行门控，计数至少10万次。单色控件用于实时补偿。数据用FlojoX软件(Treestar)进行分析。

细胞内细胞因子染色

血液样本是从健康和幽门螺杆菌经知情同意后，根据伦理法规(经医学院伦理委员会批准)获得感染患者(TUM#5662/13)。Ficoll法分离PBMC®梯度冷冻10%DMSO。细胞快速解冻，再悬浮于预热的pbs中，700 g离心10 min，再悬浮于5 ml AIM-V T细胞培养基中。计数后，细胞浓度调整到约1×10。7细胞/ml和1，5×106细胞播种到一个圆形的底部96井板。再刺激，50克*毫升−1内毒素含量小于30 Eu*mg的抗原−1在37°C下加入并孵育1小时，然后，GolgiPlugTM加入1：500可抑制细胞因子的分泌，导致细胞内细胞因子的积累，并孵育3.5h。作为对照组，PMA/Ionomycin未处理或刺激细胞。

细胞染色用FC受体阻断剂(Miltenyi Biotech)阻断FC受体。然后，用可固定活性染料eFluor标记细胞。®506(电子生物科学)，使活/死的歧视成为可能。洗涤后表面标记物CD3、CD4、CD8染色。然后用4%PFA固定细胞，在FACS缓冲液中洗涤两次，并在4°C保存一夜。第二天，细胞经细胞固定/细胞周期™+(BD生物科学)渗透，细胞内干扰素γ染色。随后，用CyanADP 9彩色分析仪(贝克曼库尔特)对细胞进行两次洗涤、过滤和流式细胞术分析，并对活淋巴细胞进行门控CD3检测，计数至少10万次。采集后补偿采用单色控制。数据用FlojoX软件(Treestar)进行分析。

表面蛋白染色幽门螺杆菌

用全血制备免疫小鼠血清，用蛋白A亲和层析法进一步纯化，分离的多克隆IgG抗体调节浓度约为2mg/ml。−1. 幽门螺杆菌将J99标记为CFDA-SE，用热灭活FCS在37°C下振荡15 min。随后，用含有0.5%(w/v)BSA的PBS清洗细菌，并将其调整为OD值。6000.5和10 0分之一种于96孔圆底细胞培养板中.用0.5%(w/v)BSA稀释纯化后的抗体。用离心法将细菌颗粒化，上清液丢弃后再用100 L相应的原抗体稀释液悬浮，在冰上孵育30 min。洗了两次后，®加入660标记的次级抗小鼠IgG 1-HRP结合物(EBioscience)，在冰上孵育30 min。细菌洗涤两次后，用1%PFA固定在PBS上，用流式细胞仪在CyanADP 9色度分析仪上过滤分析，在CFSE阳性细胞上进行门控。本实验由来自以下免疫的抗体控制：hpa(UniprotIDB5Z7F9)，这是一种外膜蛋白。幽门螺杆菌HPG(UniprotIDO25743)，一种位于胞浆和外膜囊泡内的蛋白，CT无抗原。数据用FlojoX软件(Treestar)进行分析。

伊莉斯波特

用人T型轨道进行干扰素γELISpot分析®基础干扰素γ试剂盒(Lophius生物科学)根据制造商的指示。简单地说，PBMCs被分离、冷冻和解冻，就像人类ICS所描述的那样。总计6×105细胞接种于预包衣96孔条纹上。再刺激，50克*毫升−1内毒素含量小于30 Eu*mg的抗原−1加入了。作为阳性对照，葡萄球菌采用肠毒素B(SEB)，显示细胞功能。此外，5克*毫升−1EFT-MHCⅡ类控制肽池(细胞技术有限公司)用于特异性刺激CD4记忆T细胞。细胞在37℃孵育20h，用CTL免疫斑点法检测干扰素γ并进行定量。®S6萤火线阅读器(蜂窝科技有限公司)。用CTL免疫Spot进行质量控制和背景减法。®学术软件。

Surfome制备与定量质谱

实验设计

在实验中，测量结果通常取决于多个变量。为了衡量它们的影响，科学家通常采用一次一个因素(OFAT)的方法，一次只改变一个变量，同时保持所有其他变量不变。但是这种方法需要进行大量的实验，并且不量化变量间和高阶依赖关系.这里，实验设计(DoE)方法提供了一个解决方案42...实验是经过数学规划和评估的，减少了实验的数量，同时量化了所有变量及其对读出的依赖关系。在过去的十年里，Doe在色谱领域变得越来越受欢迎。13.

本文采用DoE技术，采用CFDA-SE标记法研究了缓冲液组分和孵育时间对自溶的影响。软件Modde(Uritics，Malm，SE)用于实验规划、分析和随后的可视化。对于响应面优化(RSM)，选择了星距为1的中心组合面中心(CCF)实验设计。实验包括19个条件，包括5个中心点，按软件建议的随机顺序进行。在评价方面，删除了一些无关紧要的条件，直到模型没有进一步改进为止。实验结果对R时的解释是有效的。2、Q2模型的效度和重复性分别大于0.5、0.2、0.25和0.6。在重现性很高的情况下，模型有效性的负值被接受，因为如果所有其他值都符合标准，则表示伪值。43.

CFDA-SE标记及自溶试验

大肠杆菌

大肠杆菌用pET30b转化DH5α进行卡那霉素抗性培养，接种在LB-卡那霉素平板上，37°C培养一夜，取单个菌落在5ml LB-卡那霉素中培养一夜。预培养接种1：200，在1 lLB-卡那霉素中37℃摇动200 rpm，直至达到OD值。6001.0。细胞经4400 g离心，室温下离心15分钟，洗涤两次，再悬浮PBS，调节OD值。60020岁。

cfda-SE标记如前面所述，进行了一些小修改(Logan)。等人...(1998年)。简单地说，将溶解在DMSO中的10 mm CFDA-SE添加到最终浓度为5 M的DMSO中作为背景对照，只添加DMSO。然后，将细菌在37℃下培养20分钟，200 rpm避光，在PBS中洗涤一次，分裂成1ml脂肪，然后转移到1.5毫升反应管中。

同时，为DoE实验准备了缓冲器。这些细菌在5000克离心5分钟。按DoE工作表对微丸进行处理，为再悬浮缓冲液、再悬浮顺序和培养时间提供实验条件。然后，用反复离心法将细菌颗粒化，上清液取出，注意不要打乱球团。将上清液转入白色96孔检测板。最后，分别在485 nm和530 nm处用带激发和发射通带窗的FITC滤光片测量上清液的荧光。在DoE分析之前，对CFDA-SE标记样品的荧光进行背景校正，从对照样品和缓冲器中减去荧光。

幽门螺杆菌标记

cfda-SE标记幽门螺杆菌将菌株J99镀在WC凹板上，膨胀一次，经刮除收获.所有后续步骤都按照大肠杆菌.

幽门螺杆菌PFA固定

在PBS中加入1%的PFA，在水浴中加热到70°C，直至溶解，制得PFA溶液。在冷却到室温后，用该溶液在室温下重新悬浮细菌颗粒，调节OD值。60030℃，孵育5分钟。固定菌在进一步治疗前用PBS清洗两次。

胰蛋白酶表面剃须

这个幽门螺杆菌菌株J99生长在WC凹琼脂板上。然后，在不固定和PFA固定的条件下，通过刮除分离获得细菌。随后，细菌用PBS洗两次，然后再悬浮在剃须缓冲液(1倍PBS，20%(w/v)蔗糖，10 mm DTT)中，直至最终OD。60030.将1ml的细菌溶液分散到冰上1.5ml的反应管中。另一半加入10 g序列级胰蛋白酶，另一半加入胰蛋白酶配方缓冲液(50 mm醋酸)。随后，在37℃温度下，在500 rpm的温度下，用Eppendorf(Eppendorf)对细菌进行振荡培养。10、20和30分钟后，将相应的管子放在冰上，停止刮胡子。细菌用离心法造粒，上清液用0.22M注射器过滤(用γ射线消毒，Millex)。®、米利波)。上清液冷冻于液氮中，保存于−20°C，直至制备样品进行MS分析。

在每一步后，通过计数三重细胞中的CFU来测定其活力，并在显微镜下观察其形态。本实验是在生物四倍体中独立进行的。

表面蛋白生物素化

生物素化是用皮尔斯™细胞表面蛋白分离试剂盒按照制造商的指示和制造商的专有缓冲器进行的。简单地说，幽门螺杆菌以同一批细菌为原料制备了菌株J99，并从同一批细菌中固定了PFA，进行了剃须实验。洗涤后，细菌在PBS中重新悬浮到最后的OD值。60030岁。用48 ml冰冷PBS溶解一小瓶Sulfo-NHS-SS-生物素.对生物素化反应，加入1ml细菌悬浮液，在4°C温和搅拌条件下，在轨道摇床上孵育30 min。对照组在不加交联剂的情况下进行同样的处理。为了阻止反应，添加了500升隔离试剂盒的淬火液。然后用TBS洗涤细胞，加入750μl的分离试剂盒的生物素化裂解缓冲液与超声作用4×1 min。然后，用离心法清除裂解液，用0.22M注射器过滤澄清上清液(用γ射线、Millex、Milli孔隙消毒)。上清液冷冻于液氮中，保存于−20°C，然后用中性琼脂糖树脂富集生物素化蛋白。将浆液加入离心机柱上，用500 ml洗涤缓冲液洗涤3次，1000 g离心1分钟，加入上清液，室温下用端端混合法孵育60 min。离心去除上清液后，将浆液冲洗四次。结合蛋白加入含50 mm DTT的分离试剂盒洗脱缓冲液400 L，室温孵育60 min，离心收集上清液。将样品冷冻在液氮中，保存在−20°C，直至样品进行MS分析。

并对其表面光洁度和表面形貌进行了分析。本实验是在生物四倍体中独立进行的，与表面剃须同时进行。

全蛋白质组分析

分析幽门螺杆菌蛋白质组，细菌裂解物的小适应，如描述的细胞(Hornburg)等人...(2014年)。简单地说，一个OD600取5株细菌，用含蛋白酶抑制剂的冰冷PBS洗涤2次，溶解缓冲液(4%SDS，100 mm Tris，pH8.0)，4×1 min超声处理。在此基础上，对溶出液进行无菌过滤，在280 nm处测定蛋白质浓度，以1 AU=1mg*ml为宜。−1.

质谱样品制备

在超声水浴中用10 mm DTT还原100 g蛋白样品30 min，用55 mm碘乙酰胺烷基化45 min。为了去除洗涤剂，蛋白质被沉淀。在−20°C下加入80%(v/v)丙酮，孵育2h，离心沉淀，用80%(v/v)丙酮洗涤两次。然后将沉淀蛋白溶于6M尿素/2M硫脲中，pH8.0，pH8.0，加入1g LysC消化3h，然后用50 mm碳酸氢钠稀释1：5，加2g胰蛋白酶隔夜消化。最后，将得到的多肽混合物用C18段脱盐，直接用MS进行分析。

用轨道式质谱计进行质谱分析

利用热科学简易nlc 1000高效液相色谱系统，通过纳米电喷雾源(Thermo Fischer Science)(Michalski)，直接耦合到轨道饶舌精英™四极轨道记录仪上进行质谱分析和数据评价。等人...(2012)，用Xcalbur软件获取数据。将多肽装在MS缓冲液A的内部填充柱(75 M内径，20 cm长，1.8 M C18颗粒)上，在5%MS缓冲液B至60%MS缓冲液B的线性梯度范围内分离70 min，柱温为40℃，流速为250 nL/min，柱温为40℃，质量分析仪工作于数据依赖的top15模式，扫描范围为300~1650 m/z，400 m/z的分辨率为240，000。重复测序受动态排除序列特征30秒的限制。

数据分析

我们用MaxQuant处理原始数据44(v.1.5.3.14)并使用集成搜索引擎Andromeda45搜索MS/MS光谱幽门螺杆菌J99 UniprotKB FASTA数据库(1 488个转发条目；版本自2015年10月起)。酶特异性被设置为胰蛋白酶，同时允许多达两个缺失切割和切割N端到脯氨酸。我们将可考虑的肽的最小长度设为7个，假设半胱氨酸的甲胺甲基为固定的，甲硫氨酸氧化(M)以及N-末端的乙酰化为可变修饰。肽和蛋白质的假发现率(FDR)均为1%。

我们在MaxQuant中对所有被测样品进行了非线性保留时间比对，允许我们在没有测序(仅MS1)的情况下，在最大保留时间窗口0.7 min(“运行之间匹配”)内传递肽识别信息。蛋白质强度在MaxQuant(MaxLFQ，21)基于归一化提取的离子电流。我们严格地过滤了我们的数据，需要至少两种肽比例来进行蛋白质定量。此外，普通污染物(n=247)以及仅经侧修饰鉴定的蛋白质被严格排除在分析之外。数据分析是在Perseus框架内进行的46...根据相关实验中所有定量蛋白质的分布(下降1.8，宽度0.3)估算缺失值。

定量蛋白质(无花果。2A):对常见污染物的Maxquant蛋白群强度输出进行过滤，只对蛋白质进行侧改和反向鉴定。BAR表示每一组已识别蛋白质的中位数(四倍)，误差条表示量化蛋白质数量的标准差。

注释覆盖率(无花果。2B):注释与所有定量蛋白质的大多数蛋白质柱相匹配(见定量蛋白质)。此外，还为所有1488人创建了一个基因列表。幽门螺杆菌蛋白质和类似和注解(GOMF名称，GOBP瘦名，GOCC瘦名，KEGG名称和UniProt关键字)被加载到Perseus中的UniProt标识符。根据UniProt标识符与此数据框架匹配所有量化的蛋白质(见量化的蛋白质)，并计算覆盖率百分比(见补充表覆盖)。

文恩图(无花果。2C):量化的蛋白质(见量化的蛋白质)相应地被分组，需要至少3个有效值来计算一个蛋白质组。

第1和第2组中的注释丰富(无花果。2F):在Perseus进行Fisher精确测试，并与所有标本(C10，C20，C30，T10，T20，T30，PFA+和PFA-)进行比较。结果是在注释火山图中绘制的，显示了非富集和丰富的注释(参见补充选项卡集群C1、C2)。

常设仲裁院：正交组分1和2在这两种效应之间存在差异。为了鉴定分泌释放的蛋白质谱组和细菌表面的蛋白质组，我们在方差分析显着性(S0：1，FDR：5%)上采用无监督的K-均值分级聚类(300聚类)。根据大小归一化蛋白质强度(iBAQ，(Schwanh Usser))计算整个蛋白质组中的绝对丰度。等人...(2011年)，并与他们各自的军衔作对比。用R计算密度分布47并以相似强度为尺度，以改善蛋白质组动态范围内分布位移的比较。

生物素化：我们首先在一个无监督的等级k-均值聚类中评估样本的相似性。对于两组，生物素化和对照，我们确定了一个样本的四份显示出一个非常不同的蛋白质模式，并删除这些供进一步分析。接下来，我们进行了Welch t检验，并应用了5%的基于置换的错误发现切断，并对至少在一组中检测到至少2个有效值的蛋白质进行了S0校正。为了将生物素化方法与胰蛋白酶结合起来，我们对生物素化与生物素化和胰蛋白酶处理(+胰蛋白酶10 min，pFA阳性)与对照组(−胰蛋白酶，10 min，pFA阳性)的T检验差异进行了二维注释富集。补充表生物素化2D和补充图。2C显示p值<0.05的所有分类注释.

候选人选择

相关分析

从1153个定量蛋白质中鉴定表面相关蛋白幽门螺杆菌首先根据胰蛋白酶处理和孵育时间(10，20或30)对个别实验进行数值注释。由于对于对照样品(不使用胰蛋白酶处理)，无论时间点如何，都不会进行表面修整，因此对这些样品进行了0的数值注释。计算缺失值，并将复制结果聚合到中间值。接下来，我们对数值注释(0、10、20或30)进行了Spearman秩相关分析，使用基于排列的FDR 5%(250随机)的蛋白质丰度剖面。146个蛋白质与大于0.75的系数显著相关。这146个剖面的复制平均(中位数)和z评分。接下来，我们使用一个无监督的k均值聚类来进一步过滤预期表面剃齿轮廓的数据。我们鉴定了两个簇(C1，c2)，分别包含54和19个蛋白质(总计73)。

同源性分析

提取C1和C2蛋白群的第一个UniProt标识。使用此uniprot标识符，通过BioPython对NCBI进行了BLAST搜索(“Blastp”，无冗余数据库，命中列表大小2000，e值阈值10)。http://www.biopython.org/(BIVE，NCBIWWW)48,49...针对所有细菌(分类法ID 2)搜索了UniProt标识符(A)，不包括幽门螺杆菌(分类学ID 210)，(B)智人(分类学ID 9606)和(C)幽门螺杆菌(分类法ID 210)。搜捕幽门螺杆菌返回提交的73个标识符中缺少Q9ZLC5的72个。

该标识是通过将hsp.恒等除以对齐.长度来计算的。筛选者：(A)与其他细菌蛋白相比，排除身份>33%(不包括37位候选人)。(B)与人类蛋白质相比，不包括5%以上和e值>1的−log 10(不包括46名候选人)。这两个过滤器都被应用，将我们的候选名单减少到22。若要可视化内部的身份，请执行以下操作幽门螺杆菌与264的蛋白质组相比，我们提取了剩余候选人的最佳身份评分。幽门螺杆菌菌株。