细胞周期素依赖性激酶9(CDK 9)是促进细胞从转录暂停向延伸转变的关键分子，是细胞生存和死亡的关键调节因子。然而，CDK 9在细菌性炎症性疾病中的病理作用一直未见报道。CDK 9抑制或击穿衰减牙龈卟啉单胞菌-触发炎症基因的表达。单核细胞基因表达微阵列分析表明，cdk 9基因敲除不仅影响炎症反应，而且影响细胞死亡网络，特别是受体相互作用蛋白激酶3(Ripk 3)混合谱系激酶样(Mlkl)介导的坏死。牙龈P.gingivalis感染。CDK 9的抑制作用随MLKL和磷酸化MLKL的下调而显著降低。CDK 9通过调节调节细胞存活和死亡的关键分子caspase-8和细胞FLICE抑制蛋白(CFLIP)，不仅影响经典的RIPK 1-RIPK 3介导的坏死，而且还影响替代的TIR-结构域诱导干扰素-β-RIPK 3介导的坏死。cdk 9抑制抑制皮下腔内急性感染过程中促炎基因的产生体内...此外，CDK 9的抑制有助于减少牙周骨丢失和炎症反应。牙龈P.gingivalis在牙周微环境中。结论：CDK 9抑制通过调节RIPK 3-MLKL介导的凋亡，为影响牙周环境中细菌感染的进展提供了一种新的机制。

牙周炎是由细菌引起的牙周组织炎症.厌氧“红色复合”细菌的逾期生长，包括牙龈卟啉单胞菌和[医]齿密螺旋体与牙周病的发生和发展有关1...宿主前哨细胞，如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，在牙周病原体入侵的第一线站立。通过大量的模式识别受体(Prr)，它们可能与病原体相关的分子模式结合，包括脂多糖(Lps)、dna、rna和碳水化合物。2.

将PRRs与PAMP连接，将启动下游信号通路的级联，以处理被破坏的细胞微环境，从而导致PAMP反应基因的改变。3...这种炎症反应会导致多种趋化因子的产生，使更多的哨兵细胞进入炎症部位，以对抗细菌的入侵；此外，产生促炎症介质，如肿瘤坏死因子α(tf-α)和转化生长因子-β(tf-β)，也可能促进宿主细胞存活以维持感染。4...此外，入侵细菌的刺激可引起多种不同的调节细胞死亡(RCD)，如凋亡、NET病、坏死和下垂。一般情况下，当细胞膜保持完整时，经典的凋亡并不是炎性的，而由于细胞膜的破裂，凋亡和坏死是高度炎性的。5...由于白细胞介素-1α(IL-1α)、线粒体、核糖体以及dna等损伤相关分子模式的大量排出，坏死细胞死亡有助于炎症的放大。6...此外，细胞凋亡或自噬也参与了对细菌感染的免疫反应，促进了病原体的清除，但没有引起宿主的炎症。7.

炎症介质和各种细胞死亡途径的表达必须精心安排，以防止过度的炎症反应和组织破坏。事实上，在多个水平上抑制促炎细胞因子产生的负性调节机制已经被发现。8...转录过程的复杂性使得这一过程成为一个正确的位点，能够对给定的环境信号产生精确和适当的炎症反应。9...RNA聚合酶Ⅱ与多种转录因子结合到转录起始位点(TSS)是调控多种靶基因表达的重要机制。10...在转录启动后不久，这一过程在启动子-近端位点停止，这是∼TSS下游50 NT。细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK 9)和细胞周期蛋白t1通过rna聚合酶ⅡC末端结构域的磷酸化以及一些负面因素，促进了从转录暂停到延伸的转变。11...此外，cdk 9可能与含溴结构域蛋白(Brd)4协调，以动态增强转录伸长率。12,13.

细胞生存与死亡的平衡是由天然免疫反应中的关键分子控制的，包括受体相互作用蛋白激酶(RIPK)-1、-3、caspase 8和cFLIP。我们推测，CDK 9通过调节细胞存活和死亡网络中的关键分子，在牙周炎的发生和发展中起着关键的作用。我们的研究表明，CDK 9的激活对炎症基因的转录和RIPK 3-混合系激酶结构域(MLKL)介导的随后的坏死有调节作用。牙龈P.gingivalis侵袭并进一步影响牙周炎的进展。

Top1、Brd 4和CDK 9在慢性牙周炎中的表达

BRD 4和CDK 9介导的基因转录与辐射致小鼠肺纤维化等炎症性疾病有关。14子痫前期患者胎盘炎症过程的研究15...推测TOP 1、Brd 4和CDK 9介导的基因转录激活可能伴随牙周组织的破坏。与健康对照组相比，我们观察到牙龈炎症组织中TOP 1 mRNA的转录量增加了近1倍，Brd 4和CDK 9的转录量增加了50%。1A)。TOP 1、Brd 4和CDK 9蛋白在正常牙龈中表达较小，而在牙周病变组织中表达较高，提示牙周活检组织中炎症基因转录能力较强(图二)。1B)。为了进一步探讨其在牙周炎症中的作用，我们还进行了免疫组织化学染色，发现牙龈上皮和上皮结缔组织中三种蛋白的表达增加，提示TOP 1、Brd 4和CDK 9参与牙周病的发生发展。1C).

炎症牙周组织中TOP 1、BET和CDK 9表达增高。在埋伏牙暴露时，在健康牙龈中采集牙周组织，在拔除无希望牙齿时采集炎症牙龈组织。(A用qPCR方法检测牙周组织中TOP 1、Brd 4和CDK 9的转录水平；B,C免疫组化法检测TOP 1、BET、CDK 9蛋白的表达。这些图像是从不同的凝胶中采集的，样本数量相同。(**p<0.01；**p<0.001)。

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抑制CDK 9有助于减少细菌感染后细胞因子的产生

天然免疫系统中的防御细胞可能通过早期反应和迟反应基因的协调表达来对付病原体的爆发。16...为了探讨TOP 1、Brd 4和CDK 9在炎症反应中的作用，我们筛选了TOP 1、Brd 4和CDK 9在炎症反应中的抑制作用。牙龈P.gingivalis...用喜树碱(CPT，Selleck)和盐酸托泊替康(TPT，Selleck)、Brd 4抑制剂TOP 1(+)-JQ1(Selleck)和CDK 9抑制剂Flavopridol(FVD，Selleck)预处理THP-1单核细胞。TOP 1抑制组在术后未见炎性细胞因子产生显著下降。牙龈P.gingivalis刺激，而brd 4或cdk 9抑制后4和24小时，IL-6和TNF-α表达下降。牙龈P.gingivalis感染(图1.2)。LPS处理的RAW264.7巨噬细胞经JQ 1和FVD预处理后也有类似的结果(见附图)。沙一)。因此，靶向Brd 4或CDK 9可有效减轻牙周组织炎症反应。

转录调控影响炎性细胞因子的表达。用cpt、tpt、jq1和fvd预处理THP-1细胞2小时，牙龈P.gingivalis...生产(A,B)肿瘤坏死因子-α和(C,D用ELISA法检测感染后4、24h培养上清液中IL-6的含量。(*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

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免疫系统表达各种PRRs，特别是TLRs，以检测危险并产生特定的免疫反应。17，过度炎症可能导致慢性牙周炎组织破坏。18...对细菌感染的先天免疫反应伴随着强大的基因转录。19然而，CDK 9在细菌感染中的作用从未被探讨过。因此，我们探讨了CDK 9在牙周感染中的作用。THP-1单核细胞经fvd预处理后，抑制cdk 9，然后用牙龈P.gingivalis...FVD预处理可显著降低肿瘤坏死因子-α和IL-6的产生。3A-D)。这种抑制作用也在外周血单个核细胞(PBMCs)中观察到。3E-H)，提示单核细胞中CDK 9的激活可能促进炎症细胞因子的产生。这些结果与CDK 9对LPS处理的软骨细胞的抑制作用一致。20.

CDK 9对单核细胞促炎基因的抑制作用牙龈P.gingivalis感染。(A–D)THP-1单核细胞经FVD预处理后阻断CDK 9 2小时后感染。牙龈P.gingivalis...感染后4小时和24小时用ELISA法检测细胞因子的产生。(E–H)PBMC经FVD预处理后感染。牙龈P.gingivalis...ELISA法检测培养物中细胞因子的生成。(**p<0.01；*p<0.001)。

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CDK 9可抑制单核细胞的炎症反应和坏死。牙龈P.gingivalis入侵

单核细胞对刺激反应迅速，在暴露于病原体后会激活经典的tlr信号。21...由于化学抑制可能具有有限的选择性，我们通过慢病毒转染短发夹RNA(ShRNA)使人THP-1单细胞株的CDK 9被敲除。值得注意的是，cdk 9的激活是在mRNA转录过程中POLⅡ的转录延伸所必需的。22,23它的完全消融会对细胞的存活和动物的生存产生不利的影响。10...~70%抑制cdk 9在qPCR和westernblot中的表达(图)。4A)在本实验中对细胞活力无明显影响。

cdk 9基因表达突变牙龈P.gingivalis感染。(A)CDK 9 shRNA构建物中CDK 9的RNA和蛋白水平受到抑制。这些图像是从不同的凝胶中采集的，样本数量相同。(B)venn图显示cdk 9敲除结构与2小时后置乱结构之间差异调控基因(折叠变化≥2)的逻辑。牙龈P.gingivalis感染。(C)用热图显示thp-1单核细胞在cdk 9敲除后2h内的差异调控基因。牙龈P.gingivalis治疗。(D)CDK 9的整体影响牙龈P.gingivalis用KEGG通路分析感染情况。77,78,79. (E)用详细的热图显示差异调节的炎症基因和细胞死亡基因。(*p<0.001)。

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进一步揭示CDK 9在牙龈P.gingivalis进行感染、基因芯片检查。在转录改变的基因中，我们发现cdk 9的敲除作用于2h后大量炎症基因的表达。牙龈P.gingivalis刺激后，共有173个基因被激活，179个基因被抑制超过两倍牙龈P.gingivalis，cdk 9基因敲除导致151个基因下调5倍以上，其中9个基因被激活。牙龈P.gingivalis，并参与了11个基因的上调(图1)。4B).

cdk 9可能是基因转录的共同激活因子和抑制因子。24,25在CDK 9-敲除THP-1细胞中，多个基因增加或减少(见图).4C)。为了进一步研究cdk 9活化在细菌感染中的作用，利用kegg途径分析cdk 9基因敲除对细菌感染的整体影响。牙龈P.gingivalis感染(图1.4D)，我们发现CDK 9基因敲除可影响多种炎症通路，包括TLR、NLR和TNF信号通路。此外，无论单核细胞是否被细菌刺激，CDK 9基因敲除都抑制了死亡和下垂途径中的基因转录。cdk 9基因敲除对单核细胞凋亡无明显影响，但无明显差异。牙龈P.gingivalis孵化。与炎症和细胞死亡有关的基因在图中进一步显示。4E...我们目前的数据表明，CDK 9通过调节与炎症和细胞死亡相关的分子，尤其是坏死，调节细菌入侵时的防御反应。

CDK 9调控RIPK 1-和TRIF依赖的RIPK-MLKL介导的坏死

在此之前，我们观察到牙龈P.gingivalisRIPK 1/RIPK 3/MLKL信号通路诱导单核细胞坏死，产生大量潮气放电26...此外，像这样的病原体结核分枝杆菌27, 金黄色葡萄球菌5和肺炎球菌性肺炎28在微生物入侵和疾病进展过程中操纵身体下垂。然后我们探讨了坏死途径在CDK 9介导的炎症反应中的作用。牙龈P.gingivalis感染。

FVD抑制CDK 9可显著降低THP-1单核细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平，提示细胞死亡的发生。5A)和PBMCs(图1)。5B)细菌感染后4、8小时，提示CDK 9活化可引起单核细胞死亡。MLKL的激活导致磷脂酰肌醇磷酸酯的合成和寡聚，导致细胞膜破裂和细胞死亡。29...FVD阻断CDK 9可显著降低MLKL的转录和蛋白表达，且FVD预处理后THP-1单核细胞磷酸化的MLKL明显降低(图一)。5C，D)。此外，FVD还显著降低了RIPK 3的表达。牙龈P.gingivalis刺激，而它的Rhim结构域和激酶活性是诱导死亡的关键。30,31...此外，FVD抑制了牙龈P.gingivalis上调死亡受体级联的关键适配器ripk 1的水平。29...在TLR 3/4和DAI激活的交替坏死途径中，TIR-结构域介导的干扰素-β(Trif)也被减少.因此，我们的研究结果表明，CDK 9既参与了经典的RIPK 1-RIPK 3-MLKL介导，也参与了TRIF-RIPK 3-MLKL介导的坏死。

CDK 9的抑制降低了坏死细胞的死亡。(A)用FVD预处理THP-1细胞，抑制CDK 9 2小时，然后用牙龈P.gingivalis...在感染后4、8小时用LDH法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶的表达，以反映细胞死亡情况。(B对PBMCs进行同样的处理，检测乳酸脱氢酶的表达。(C)THP-1细胞与坏死相关的RNA水平，包括TRIF、cFLIP。S，cFLIPL、Caspase-8、RIPK 1、RIPK 3和MLKL的实时PCR检测。(D)Westernblot进一步检测翻译水平。这些图像是从不同的凝胶中采集的，样本数量相同。(**p<0.01；*p<0.001)。

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由于凋亡和坏死是对微生物刺激的免疫应答中两个相互关联的死亡途径，caspase-8和cflip调节细胞的命运，即细胞的存活或死亡；它们也决定了免疫细胞是经历外源性的凋亡还是死亡。32,33...我们接下来探讨CDK 9抑制后caspase-8和cFLIP的变化。FVD对THP-1单核细胞caspase-8表达的抑制作用及其对cFLIP的抑制作用牙龈P.gingivalis孵化(图1.5C，D)。将shRNA转染THP-1单核细胞作为抑制CDK 9的另一种方法，LDH水平及与坏死相关基因的表达与抑制FVD预处理结果一致(图一)。6)。由于原代单核细胞和单核细胞株的差异可能影响细胞死亡的发生，我们利用PBMCs进行了进一步的实验。同样，CDK 9抑制转录调节TRIF，cFLIPS，cFLIPL、Caspase-8、RIPK 1、RIPK 3和MLKL(见附图)。S2)。这些结果表明cdk 9的激活调节了对cdk 9的免疫应答。牙龈P.gingivalis通过细胞死亡网络的调节。

cdk 9基因敲除改变了细胞死亡网络中的基因。用携带cdk 9 shRNA的慢病毒转染thp-1细胞96h，抑制cdk 9，然后用牙龈P.gingivalis. (A用乳酸脱氢酶(LDH)法检测感染后4h乳酸脱氢酶的含量.(B用qPCR方法检测死亡相关分子的表达。(**p<0.01；*p<0.001)。

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阻断CDK 9减轻皮下腔内炎症反应体内

其次，我们研究了fvd介导的抑制cdk 9的生物学意义。牙龈P.gingivalis-诱导免疫反应体内...FVD预处理不影响注射后2h的细菌计数。活的牙龈P.gingivalisFVD组细胞在注射后24h出现生长高峰，而细菌生长较少。细菌感染48小时后，细菌数量进一步上升。牙龈P.gingivalisFVD组注射48h后细菌数量无明显变化(图1).7A).

CDK 9抑制对急性细菌性炎症的影响体内...皮下腔被用来模拟牙龈P.gingivalis感染体内...2小时前腹腔注射FVD阻断CDK 9。牙龈P.gingivalis(2×10)8)在室内接种。(A))可行数目牙龈P.gingivalis在血琼脂板上。(B,CELISA法检测感染后2、24、48h大鼠腹腔液中TNF-α和IL-6水平。(*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

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牙周组织中肿瘤坏死因子-α的升高与厌氧菌的增殖有关，导致牙周组织中肿瘤坏死因子的持续存在。Ginigvalis P.Ginigvalis以及炎症的延长34,35...感染后2 h TNF-α的产生无明显差异，感染后24h TNF-α的含量增加了1倍，而FVD预处理则抑制了TNF-α的产生(图一)。7b)。同样，FVD预处理也显著降低了皮下腔液中IL-6的生成。7C)。因此，fvd治疗可以抑制炎症反应。牙龈卟啉杆菌(P.gingivalis).

抑制CDK 9减少牙周组织丢失

慢性牙周炎是牙周组织对厌氧菌的炎症反应，导致牙周组织的破裂和牙周膜成纤维细胞的丢失。36...探讨CDK 9在牙周炎、丝结扎术及牙周炎发生发展中的作用牙龈P.gingivalis感染被用来模拟慢性牙周炎，等人.26在细菌注射前2h腹腔注射FVD或DMSO。从微CT的结果来看，FVD治疗减少了牙周组织的丢失.牙龈P.gingivalis接种导致牙槽骨吸收，FVD治疗减轻骨丢失(图)。8A)。骨密度相关分析发现牙槽骨骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb-Th)下降，细菌接种后骨小梁分离(Tb-Sp)增加，因此，FVD治疗减轻了细菌感染后的骨吸收。8B).

CDK 9的抑制减轻了牙周组织的丢失。慢性牙周炎是通过丝结扎和牙龈P.gingivalis接种。前2小时腹腔注射FVD阻断CDK 9。牙龈P.gingivalis接种。(A用μCT测量牙骨质结合至牙槽骨嵴的牙槽骨吸收水平。(B)用骨密度的几项指标评价骨吸收。(C用免疫组织化学方法检测牙周组织中TNF-α、IL-6、RIP 1和RIP 3的表达。(*p<0.001.0 5；*p<0.001.0 5)。

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我们进一步评估了FVD对牙周组织炎症和RIPK3-MLKL介导的坏死的影响。牙龈P.gingivalis接种可导致牙周组织中IL-6和TNF-α阳性细胞的积累，而FVD治疗可明显减少牙周组织中的炎症细胞。同样，FVD预处理组RIPK 1和RIPK 3阳性细胞较少。8C，D)。提示CDK 9在牙周组织中的激活导致炎症和坏死细胞死亡增加，其抑制作用可能延缓牙周炎的发生和发展。

CDK 9是一种重要的转录调节因子，可以调节NF-kB在促炎反应中的活性。19,37,38...此外，CDK 9的激活还与破骨细胞分化和骨吸收功能有关。39...为了了解CDK 9在牙周炎中的病理作用，我们首先研究了CDK 9、Brd 4和RNA聚合酶Ⅱ在调控基因转录中的表达。此外，我们还通过抑制FVD或用shRNA来探讨CDK 9在牙周炎进展中的作用。本研究不仅证实CDK 9参与了天然免疫反应，而且通过调节RIPK 3-MLKL介导的炎症性疾病的坏死，发现了一种新的机制。

阻断或击穿单核细胞中的cdk 9可减少对厌氧症的炎症反应。牙龈P.gingivalis由于基因启动子转录减弱，类似的抑制细菌感染的天然免疫反应也被bet抑制剂i-bet所阻断。40,41或有条件地敲除髓系细胞中的Brd 4。42，以及拓扑异构酶1的抑制作用16...尽管有厌氧菌，牙龈P.gingivalis显示与其他革兰氏阴性菌不同的致病因素。一般来说，革兰氏阴性菌是通过TLR 4来识别的，而牙龈P.gingivalis可以被TLR 2、TLR 4或两者所识别。43，TLR 2对牙周骨吸收有促进作用。牙龈P.gingivalis感染体内44...此外，TNF-基因敲除小鼠对口腔感染动物牙周骨丢失的易感性较低。牙龈P.gingivalis43...TLR信号通路的激活触发了一系列的适配器分子，在微生物刺激下启动促炎基因的转录。Pol-Ⅱ介导的停顿调控是转录调控的主要靶点之一。45，以及大量的转录因子，包括NF-κB。46，c-Myc47，以及低氧诱导因子-1α参与了这一过程。48...广泛释放TLR触发的CDK 9调节的炎症介质可能通过加重炎症和破坏牙周支持组织而损害宿主。因此，这两种细胞因子的减少体内实验可以解释CDK 9抑制后牙槽骨丢失减少的原因。由于多种细菌参与牙周炎的发展过程，多种病原体采用不同的策略侵入牙周组织，利用其他致病菌的实验可以进一步了解CDK 9在牙周炎发生发展中的病理作用。

由于CDK 9在胚胎发生中的重要性，CDK 9基因敲除或其结合伙伴cyclinT 2对小鼠具有胚胎致死性。49,50...利用条件基因敲除小鼠的未来研究可能会提供更多关于CDK 9介导的转录调控在感染中的信息。

在本质上，炎症反应可能有助于防御细胞招募更多的防御细胞进入感染位点并维持感染；然而，面对病原体的过度生长，易感对象的宿主防御细胞可能会经历几个程序性细胞死亡，例如ripk 3-mlkl介导的死亡。51，caspase-1依赖于炎症小体激活后的下垂。52和凋亡53...一旦细胞外和细胞内的危险信号被各种PRRs所感知，即细胞膜上的TLRs。17以及胞液中的NLRs(NOD样受体)54，一串适配器分子可能触发不同的炎症反应，其特点是基因转录的协同激活。在转录暂停过程中，CDK 9与Brd 4相互作用，磷酸化RNA POLⅡC末端结构域。55此外，它还磷酸化DRB敏感性诱导因子(Dsf)和负伸长因子(Nelf)。56导致它与RNA聚合酶分离。因此，Brd 4和CDK 9可能参与多种分子的转录，这些分子与程序性细胞死亡密切相关，如凋亡、死亡和细胞死亡。事实上，基因微阵列数据显示cdk 9会影响细胞死亡，包括坏死、凋亡和萎缩，其特点是活性氧的过度堆积和脂质过氧化产物的生成，并可被铁螯合剂去铁胺所阻断。57.

抑制cdk 9可抑制促存活炎症基因，增强caspase-8和-9等促凋亡基因的转录，同时减少抗凋亡基因，如mcl-1、xiap、bcl 6和btg 1。47,58...此外，CDK 9还参与了非肿瘤细胞凋亡的改变。例如，用黄酮类药物治疗中性粒细胞，通过下调抗凋亡基因mcl-1和bcl2A的表达，促进细胞凋亡。59...本研究证实caspase-8的caspase-8水平在cdk 9基因敲除后上调。牙龈P.gingivalis说明黄曲霉醇预处理改变了细胞存活和死亡的平衡，有利于细胞凋亡。

摘要坏死在维持组织内稳态和组织细菌入侵中起着至关重要的作用。60...已发现三种死亡途径，包括Rhim-含RIPK 1、TRIF和Z-dna结合蛋白1介导的途径。61...在本研究中，CDK 9抑制或下调可显著降低细菌刺激后RIPK 1、RIPK 3和TRIF的水平，从而减少细菌感染时的坏死。确实，减少的pMLKL，明确的标志，死亡，观察到牙龈P.gingivalis经CDK 9抑制或敲除后的单核细胞。此外，FVD治疗后，牙周组织中RIPK 1和RIPK 3表达降低，提示CDK 9可能在牙周炎进展过程中调节坏死。然而，RIPK 1的生物活性取决于刺激的背景。RIPK 1参与了肿瘤坏死因子-α与其受体的连接后的三种不同的复合物。62...复合物I促进NF-κB通路的激活，促进炎症和存活；复合物II激活非炎性细胞凋亡；复合物Ⅲ的形成导致促炎性坏死。61...以前没有关于CDK 9在调节RIPK 1、TRIF、RIPK 3和MLKL方面的作用的报告。我们的研究扩展了CDK 9和Brd 4的协调作用，通过经典的RIPK 1介导的和交替的TRIF介导的坏死作用来调节坏死。

细胞的生死存亡是感染过程中密切相关的事件。几个关键分子在对各种刺激的反应中精细地调节细胞的命运。cFLIP在Fas相关死亡域(Fdd)caspase 8 cflip复合物中的存在决定了细胞对刺激反应的命运。32...caspase-8具有两种相互对立的作用：通过外源性凋亡途径促进细胞死亡和阻止RIPK 3介导的坏死而不诱导细胞凋亡。它与类FLICE抑制蛋白长(翻转)有蛋白溶解作用。L)63...由于转录后mRNA的剪接，cFLIP有两种亚型.cFLIPs蛋白质能抑制caspase-8的活性，阻断cflip中proaspase-8的活化。L可能调节proaspase-8的活化程度及其底物特异性。64...此外，选择性CDK 9抑制cFLIP和mcl-1的活性，增强TRAIL诱导的细胞凋亡。65...我们的研究进一步证明了这两种cflip的下调。s和cFLIPL上调caspase-8，从而减弱cdk 9的抑制作用。牙龈P.gingivalis-引起的坏死。

单细胞株，包括thp-1和u 937，在细胞培养模型中被广泛应用于模拟单核细胞，探索炎症机制。66细胞死亡，如细胞凋亡67，下垂68和坏死69...然而，原代单核细胞和单核细胞株的差异可能影响细胞死亡的发生。虽然我们用PBMC来证实CDK 9在牙龈P.gingivalis侵袭，还需要进一步的研究，以进一步确定其调节死亡的机制。

牙周组织周围的天然免疫系统和生物膜之间的动态平衡维持牙周组织内的稳态。我们先前的研究表明，RIPK 3-MLKL介导的坏死作用参与了牙周炎的进展。26,70...随着大量潮气进入牙周组织，坏死可能加重牙周炎症。此外，microrna-214还通过atf 4调节糖尿病相关牙周炎的坏死。71...我们的研究进一步表明，RIPK 3-MLKL介导的牙周组织坏死可能受CDK 9介导的转录调控。

总之，CDK 9在细菌炎症性疾病的发生发展中起着重要的作用。我们研究了一种新的机制涉及RIPK 3-MLKL介导的死亡.CDK 9介导的转录通过靶向RIPK 1、caspase-8和cFLIP等关键分子，调控细胞存活、凋亡和凋亡网络。CDK 9通过调节TRIF依赖的交替型和RIPK 1依赖性的经典坏死，在牙周炎发展过程中可能增强免疫细胞的存活，减少炎症的释放。虽然抑制炎症反应可能有助于减少牙周骨吸收和炎症牙龈P.gingivalis在目前的研究中，CDK 9抑制剂的临床应用应谨慎。

样本

收集10例成人牙周炎和10例无牙周病的健康成人牙龈组织，资料见表。1...成人牙周炎患者的牙龈是从需要拔除的Ⅲ°移动的无希望牙齿中获得的。所有牙在探测深度为≥6mm或临床附着缺失≥为6mm时均有阳性出血。健康成人的牙龈是在拔牙过程中从埋伏和阻生智齿中获得的，没有炎症反应。每个个体(不混合)的牙龈标本进行mRNA和蛋白质分析。从全血分离外周血单个核细胞(PBMCs)。采集3例非牙周炎成人志愿者的血。用乙二胺四乙酸(乙二胺四乙酸)抽吸BD型液泡管，经静脉穿刺取血100 mL。

细菌菌株

牙龈P.gingivalisATCC 33277在37°C加酵母膏(50 mg/L)、维生素K3(1mg/L)和血红素(1mg/L)的脑心灌注培养基中进行厌氧培养。孵化牙龈P.gingivalis光密度在600 nm处检测到，1对应于10。9CFU/ml

细胞培养

人急性单核细胞白血病细胞系(thp-1，atcc)在含10%胎牛血清(10%胎牛血清)、1%青霉素/链霉素溶液(hclone，US)和0.1%β-巯基乙醇(Sigma，US)的RPMI 1640培养基中培养，浓度为5%CO。2加湿孵化器。PBMC是用Corkum C P所描述的Ficoll分离出来的。等人.72在添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养。

细胞感染模型

将THP-1细胞接种于24孔板中，进行不同处理.空白组用DMSO预处理2h后用PBS治疗。CPT组、TPT组、JQ1组和FVD组分别用CPT(5NM，50 NM，500 NM)，TPT(1 NM，10 NM，100 NM)，JQ1(50 NM，250 NM，500 NM)和FVD(4 NM，40 NM，400 NM)预处理2h，然后用PBS。牙龈P.gingivalis治疗组牙龈P.gingivalisDMSO预处理2h后(MOI=40)。牙龈P.gingivalis和CPT，牙龈P.gingivalis和TPT牙龈P.gingivalis和JQ 1，牙龈P.gingivalisFVD组分别给予CPT、TPT、JQ1和FVD预处理2h，然后用牙龈P.gingivalis...所有治疗组均在治疗过程中去除抗生素。PBS治疗后4、24小时上清液或牙龈P.gingivalis被收集起来了。采用ELISA法测定细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量.

将THP-1细胞和PBMCs接种于24孔板中，分为4组.空白组用DMSO预处理2h，再用PBS。FVD组给予PBS+FVD(40 Nm)预处理2h。牙龈P.gingivalis治疗组牙龈P.gingivalisDMSO预处理2h(MOI=40)。牙龈P.gingivalisFVD组牙龈P.gingivalisFVD预处理2h。取上清液于4、24小时进行细胞因子检测。

细胞死亡模型

将THP-1细胞和PBMCs接种于6孔板中，分为4组.空白组用DMSO预处理2h，再用PBS。FVD组给予PBS+FVD(40 Nm)预处理2h。牙龈P.gingivalis治疗组牙龈P.gingivalisDMSO预处理2h(MOI=200)。牙龈P.gingivalisFVD组牙龈P.gingivalisFVD预处理2h。2小时后提取RNA，6h后进行蛋白质提取。

shRNA敲除

THP-1细胞在24孔板中培养.将携带CDK 9 shRNA或未携带CDK 9 shRNA的慢病毒载体转染到细胞内，并在EnGreen生物系统的辅助下进行转染。转染96h后观察到绿色荧光的表达。提取RNA和蛋白质，检测CDK 9的表达。THP-1细胞分别接种96孔板和6孔板进行细胞毒性分析和实时PCR分析.细胞分为4组。NC组用非靶向置乱转染，PBS刺激。NC和牙龈P.gingivalis非靶向干扰转染组牙龈P.gingivalis...CDK 9 shRNA组转染CDK 9 shRNA，PBS刺激CDK 9 shRNA。CDK 9 shRNA和牙龈P.gingivalis转染组转染CDK 9 shRNA，牙龈P.gingivalis...转染96h后，用牙龈P.gingivalisPBS，4h后用LDH法检测细胞毒性。在刺激后2h提取RNA。

小鼠

雌性C57BL/6小鼠在无菌食物和水的作用下，在12/12小时的昼夜循环中饲养至8周。实验前，所有小鼠在新环境中适应性喂养一周。

小鼠实验性牙周炎模型

分组包括空白组，FVD组，牙龈P.gingivalis小组，牙龈P.gingivalisFVD组15只，每组15只。空白组用丝栓加PBS注射液治疗。FVD组小鼠采用丝结扎加FVD注射。牙龈P.gingivalis实验组小鼠采用实验性牙周炎模型和PBS注射。牙龈P.gingivalisFVD组采用实验性牙周炎模型和FVD注射。以朱莉·马切森(Julie Marchesan)的描述建立实验性牙周炎模型。等人.73...简单地说，丝绸(5-0)浸在溶液中牙龈P.gingivalis有一天晚上，在上颌第二磨牙周围放置一个载体牙龈P.gingivalis...在此之后，10μl牙龈P.gingivalis(2×10)8)每隔2天向上颌第二磨牙6个部位注射一次，包括近颊部、颊部、远侧颊部、近中腭侧、腭侧和腭远端。细菌注射前2h腹腔注射FVD(5mg/kg)或PBS。10天后处死所有小鼠，取三颗磨牙的上颌骨作进一步分析。

小鼠急性炎症模型

180只小鼠随机分为4组。每组45只小鼠，15只小鼠2 h，15只小鼠24 h，15只小鼠48 h。艾尔。形成密室74...10天后，创面愈合后，空白组腹腔注射PBS预处理，2h后腹腔注射PBS。FVD组小鼠腹腔注射PBS，腹腔注射FVD(5mg/kg)。在牙龈P.gingivalis小组，牙龈P.gingivalis(2×10)8将100μl的CFU注入腔内引起急性炎症，并预先注射PBS。一群牙龈P.gingivalis和FVD牙龈P.gingivalisFVD的溶液及预处理。分别于PBS或FVD感染后2、24、48h取房室分泌物，用ELISA法检测细菌计数，检测IL-6和TNF-α。

微观CT评价

用4%多聚甲醛隔夜固定小鼠磨牙上颌骨，用VVACT微型计算机断层扫描仪(瑞士Bassersdorf Sanco Medical，Bassersdorf)进行10.5μm分辨率扫描。三维重建。对骨密度、BV/TV、Tb.N、TbTh和Tb-Sp进行了容量和形态计量分析。75.

免疫组织化学分析

用4%多聚甲醛固定小鼠上颌骨和牙龈组织。所有标本经骨组织脱钙后进行脱水和包埋。免疫组织化学按Ke X所描述26...组织切片厚度为4μm，脱蜡和抗原提取后用3%BSA阻断组织切片。用兔抗TOP 1、兔抗BET、兔抗CDK 9、兔抗RIPK 1/RIP、兔抗RIP 3、兔抗IL-6(ABCAM，美国)和兔抗TNF-α(ABCAM，美国)在4°C过夜培养。用链霉亲和素-HRP-偶联抗体孵育30 min后，采用显色试剂盒。然后切片脱水，苏木精浸入，分化和安装中性胶。

细胞毒性试验

将THP-1细胞和PBMCs接种到96孔板中.然后将细胞分为4组，作为细胞死亡模型。经细菌感染或PBS治疗4、24h后，用乳酸脱氢酶(LDH)测定(美国普罗米加)。在490 nm处测得吸光度。以RPMI 1640培养基的吸光度值为基准，以完全溶解细胞的吸光度值为最大LDH释放量。LDH法测定的实用价值被纠正，以表明细胞毒性。

RNA提取及实时定量PCR分析

RNA的提取和分析如所述。26...用PBS或PBS处理后，用RNA提取试剂盒提取总RNA。牙龈P.gingivalis2小时或从临床采集的牙龈组织标本中提取。RNA用纳米滴分光光度计定量，上标II反向转录(日本Takara)。采用SYBR绿色母料(ABI，美国)进行实时PCR.引物可作为补充表沙一.

微阵列表达分析

将感染CDK 9 shRNA或非靶向干扰shRNA的THP-1细胞的总RNA保存在−80°C，测定其数量、质量和完整性后，用Cy3-UTP进行线性扩增和标记，用RNeaseMiniKit(Chiagen)纯化。用纳米滴Nd-1000测定标记CRNA的浓度和比活性后，加入10×封闭剂(11μL)和25×断裂缓冲液(2.2μL)，完成CrNA的断裂。混合液在60℃下孵育30 min，用2×Ge杂交缓冲液(55μL)稀释。将杂交液(100μL)配制到垫片片上后，组装成芯片幻灯片。在Agilent杂交炉中孵育17小时后，用Agilent DNA芯片扫描仪(部分编号G2505C)冲洗、固定和扫描。用Agilent特征提取软件读取原始荧光数据，利用GeneSpringGX v12.1(Agilent Technologies)进行分位数归一化和数据处理。各组间折叠变化大于2者为差异表达。利用京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径数据库，揭示了CDK 9介导的细菌感染转录调控机制。

蛋白质提取及westernblot分析

蛋白质的提取如下所述。76...用12%Bis-Tris Plus凝胶(Genscript，China)分离蛋白质，经350 mA转移至PVDF膜(美国米利波)90 min，室温下封闭1h。Primary antibodies used to probe blots were mouse anti-TICAM-1(sc-514384，mAb，Santa，USA)，mouse anti-FLIPS/L(sc-5276，mAb，Santa，USA)，rabbit anti-cleaved caspase-8(9496，mAb，CST，USA)，rabbit anti-total caspase-8(ab108333，mAb，Abcam，USA)，rabbit anti-RIPK1/RIP1(NBP1-77077，polyclonal Ab，Novus，USA)，rabbit anti-RIP3(ab152130，polyclonal Ab，Abcam，USA)，rabbit anti-MLKL(ab184718，mAb，Abcam，USA)，兔抗p-MLKL(膦S 358)(ab 187091，mAb，AbCAM，USA)，兔抗TOP 1(20705-1-AP，多克隆抗体，Proteintech，USA)，兔抗BET(13232，mAb，CST，USA)，兔抗CDK 9(2316，mAb，CST，USA)和兔抗-GAPDH(MB001，mAb，Bioworld，USA)，在4°C下孵育1小时。然后，用化学发光成像系统(中国上海，Tanon)对污迹进行观察。

道德声明

实验规程经南京大学医学院南京口腔医院医德委员会批准，伦理批准号为2017NL-012(KS)。研究中包括的所有参与者都表示知情同意。所有涉及人类参与者或小鼠的实验都是按照相关的指南和规定进行的。

统计分析

数据采用单因素方差分析(ANOVA)和SPSS20.0 t检验，t检验仅用于两组比较。数据以均值±标准差(SD)表示。P<0.05为显着性水平。