心血管疾病是全世界最常见的死亡原因，以动脉粥样硬化为主要病因。动脉粥样硬化的标志是在动脉壁沉积高胆固醇脂蛋白，引起致病的免疫反应。本病的特点是巨噬细胞在动脉粥样硬化病变中的致病积聚，大量摄入脂蛋白后，巨噬细胞成为泡沫细胞。我们假设，通过诱导CD8 T细胞对脂蛋白衍生载脂蛋白-B 100(ApoB 100)的应答，有可能交叉存在脂蛋白成分的巨噬细胞可以被特异性清除。基于硅中采用蛋白质加工和MHC-I结合模型，从ApoB 100中合成了6个推测的CD8 T细胞表位。T2细胞结合试验证实Hla-A2与所有肽的结合，免疫后的回忆反应证明，6种多肽中有5种能诱导CD8 T细胞应答。诱导ApoB 100特异性CD8 T细胞不影响HLA-A2和人ApoB 100转基因LDLR的斑块大小和细胞组成。−/−老鼠。分离自主动脉弓的细胞在脾细胞和肠系膜淋巴结的细胞培养中未检测到任何回忆反应，提示动脉粥样硬化环境影响了CD8 T细胞的活化。

心血管疾病是西方世界最常见的死亡原因，动脉粥样硬化是最常见的病因。1...动脉粥样硬化的特点是在中、大动脉内膜内沉积脂质，引起血管壁的免疫浸润和炎症。动脉粥样硬化病变吸引的免疫细胞包括CD8 T细胞。2...动脉粥样硬化病变中CD8 T细胞高度活化3提示CD8 T细胞动脉粥样硬化的发病机制。最近的研究确实支持CD8 T细胞通过分泌促炎细胞因子在动脉粥样硬化中的整体促动脉粥样硬化作用的观点。4,5,6...尽管如此，CD8-T细胞在病变中也有保护动脉粥样硬化作用的报道。7.

这些相互矛盾的报道可能是由于CD8 T细胞形成了一个由不同的亚群和识别不同抗原的细胞组成的异质群体。最大的CD8 T细胞亚群是细胞毒性CD8 T细胞或细胞毒性淋巴细胞(CTL)。8...CTL的主要功能是保护宿主免受细胞内病原体的侵袭。9和肿瘤10...目的细胞的特异性识别是通过CTL的T细胞受体之间的正向相互作用来建立的，CTL的T细胞受体在单个CD8 T细胞之间是可变的，MHC-I与靶细胞上的特定抗原衍生肽相互作用。MHC-I/肽复合物识别导致CTL产生肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ，并导致Fas配体或穿孔素和颗粒酶B介导靶细胞死亡。11...TCR的特异性对其致病性有很大的影响，因为根据靶抗原的不同，疫苗诱导的CTL可以对动脉粥样硬化起到保护作用。12,13,14,15或致动脉粥样硬化16...诱导CTL对平滑肌细胞等血管细胞的反应性增强血管炎症和动脉粥样硬化16...AS抑制巨噬细胞凋亡增强动脉粥样硬化17,18而MHCI分子的缺失加剧了动脉粥样硬化。19我们推测CD8 T细胞介导的巨噬细胞杀伤是控制动脉粥样硬化进展的重要过程。TLR激活20和凋亡小体的存在21，这两种交叉呈现的强大诱导剂22,23，可诱导病变巨噬细胞交叉表达空斑抗原。推测由吞噬细胞在MHC-I上交叉表达LDL衍生载脂蛋白-B 100(ApoB 100)表位，提示诱导ApoB 100特异性CD8 T细胞可杀伤巨噬细胞，减少动脉粥样硬化。

因为只有一小部分肽与mhc-i结合24为了验证这一假设，我们开始鉴定ApoB 100中的CD8 T细胞表位。带着硅中人类HLA结合和抗原处理的预测模型，人类HLA-A2限制性表位来源于人ApoB 100，并对其翻译相关性进行了预测。筛选并合成了6条ApoB 100衍生肽，并通过对T2细胞的HLA-A2分析，证实了所有肽与HLA-A2的结合。25...此后，我们利用这些肽进行了疫苗接种研究，诱导HLA-A2和人ApoB 100转基因LDLR中大量的肽特异性记忆CD8 T细胞。−/−老鼠。虽然ApoB 100肽疫苗诱导了ApoB 100特异性CTL，但这些CD8 T细胞并没有改变斑块组成、斑块胶原含量和斑块大小，提示诱导ApoB 100特异性CD8 T细胞不影响动脉粥样硬化。

预测HLA-A2限制性表位稳定HLA-A2，诱导DC免疫后肽特异性CD8 T细胞应答

为了将CD8 T细胞靶向于可能交叉存在斑块衍生抗原的空斑巨噬细胞，我们预测了人ApoB 100中可能存在的HLA-A2限制性CD8 T细胞表位。26,27,28和HLA-A2结合模型28,29,30,31,32,33,34,35...我们合成了6个被认为是HLA-A2结合和加工评分最高的肽(表)。1)。ApoB 100肽与HLA-A2结合的建立离体用ApoB 100肽与T2细胞孵育一夜，用流式细胞仪检测T2细胞HLA-A2的表达(附图)。沙一)。由于T2细胞缺乏TAP 1和TAP 2的表达，T2细胞胞浆肽转运减少，内源性肽在ER中的MHC-I表达减少。MHC-Ⅰ不与多肽络合，其转运效率低，稳定性差，导致T2细胞膜上HLA-A2的表达降低。外源性肽的加入，在细胞表面形成mhc-i/肽复合物，增强了mhc-i在质膜上的稳定性，增加了t2细胞表面HLA-A2的表达。25...所有6个ApoB 100肽均以浓度依赖性的方式增加HLA-A2的表达。1A)，证实这些多肽与HLA-A2结合。

预测HLA-A2限制性表位，稳定HLA-A2，诱导DC免疫后肽特异性CD8 T细胞应答。(A)用T2细胞检测预测的CD8 T细胞表位。将T2细胞(n=3/肽)与一定浓度的多肽或载体对照(DMSO)隔夜孵育，流式细胞仪检测HLA-A2的表达。(B)下一步，我们评估了这些ApoB 100衍生肽是否能诱导HLA-A2限制性CD8 T细胞应答。不表达人ApoB 100的hla-a2tg小鼠(每肽2只)接种2*10。6HLA-A2tg骨髓来源DC单肽(30μM)脉冲。免疫后一周脾细胞体外与肽共同孵育，对其进行免疫接种。CD 44和IFN-γ双阳性T细胞流式细胞术检测肽特异性T细胞反应图。A组采用双向方差分析和Bonferroni后测，扫描电镜显示为均值。对于B类动物，用随机卡方检验和Bonferroni后测(经96对比较校正)，将肽刺激的样本与未刺激的动物对照进行比较，绘制个体样本。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

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为了检测人类白细胞抗原A2转基因动物(hhd小鼠)的免疫原性。36HHD骨髓来源DC(2*10)6用LPS(100 ng/ml)刺激细胞，用单个肽(10μg/ml)刺激细胞。接种后一周，我们通过流式细胞术检测rn-γ阳性抗原(CD 44)来评估多肽特异性ctl的诱导作用。+)CD4和CD8 T细胞(附图)。沙一)，在脾细胞培养中，用不断升高的ApoB 100肽的浓度孵育4小时，使特定动物接种疫苗，并对除ApoB外的所有肽进行Bregeldin A。2524–2532而免疫接种则不影响CD4 T细胞IFN-γ的产生(图一)。1B)。这表明6个肽中有5个能诱导HLA-A2限制性CD8 T细胞应答。体内.

肽免疫可诱导脾和纵隔淋巴结中的CD8 T细胞产生肽应答，而主动脉则无此作用。

人载脂蛋白B 100(ApoB 100)特异性T细胞在动脉粥样硬化中的作用，通过杂交育种HHD小鼠，转HLA-A2基因，缺乏mhc-i分子的表达，建立了一个合适的实验模型。36，表达人ApoB 100并缺乏LDLR的Hubl小鼠。37,38...hla-A2和人ApoB 100转基因小鼠，它们缺乏LDLR以促进动脉粥样硬化的发展，并具有正常表达(Hubl-A2)。M+)或缺乏mhc-i的表达(Hubl-A2)M−)生成。由于两株小鼠的ApoB 100肽免疫后，在动脉粥样硬化研究中产生了相似的免疫结果和对斑块参数的影响，这主要是用雌性Hubl-A2获得的结果。M−在雄性Hubl-A2中获得的一些补充数据显示了小鼠。M+老鼠。

哈贝尔-A2M−小鼠从15周龄开始接受西式饮食9周。治疗组小鼠腹腔注射。接种HHD DC疫苗(2*10)6在西式饮食开始时，用6种ApoB 100衍生肽(10μM/肽)的混合物刺激细胞。老鼠被静脉注射了。一周后，用抗CD 40(50μg)和聚(i：C)(50μg)辅助的多肽(30μM/肽)促进抗原特异性记忆CD8 T细胞的形成。39,40,41...对照组动物接受非脉冲控制DC(2*10)6细胞)在WTD起始和一周后无肽佐剂(载体组)，或接受两次PBS注射(PBS组)。在实验结束时，我们确定疫苗是否诱导肽特异性CD8 T细胞。为此，用流式细胞术检测脾脏细胞培养(2*10)中CD8 T细胞的回忆反应。6细胞)和纵隔淋巴结(1*10)6细胞与ApoB 100衍生肽(10μM/肽)和Bregeldin A共同孵育4h后，肽组CD8 T细胞百分率明显高于PBS组，脾脏CD8 T细胞百分率明显高于非脉冲DC/Vehicle组(如图1所示)。2A)和血液(附图。S2)而不是纵隔淋巴结(如图所示)。二维空间)。ApoB对脾细胞的孵育作用406–414、ApoB3070–3078或ApoB4531–4539肽组脾细胞培养中IFN-γ和TNF-α双阳性CD8 T细胞的百分率增加，提示长期诱导这些肽的记忆性CD8 T细胞是成功的。2B、C)。在来自纵隔淋巴结的细胞培养中，与所有多肽共同孵育的细胞中，干扰素-γ的比例也较高。+和肿瘤坏死因子-α+肽免疫组CD8 T细胞双阳性。2 E、F)，虽然百分比远低于脾脏。在循环中，肽处理组的效应记忆CD8 T细胞明显增加，天真CD8 T细胞减少(补充图1)。S2)，提示疫苗接种也会导致肽特异性CD8-T细胞在循环中。

肽免疫诱导肽应答的CD8 T细胞。(A)脾CD8 T细胞百分比的定量。(B)ApoB活化脾CD8 T细胞的典型流式细胞仪图406–414在不同的治疗组。(C)CD8 T细胞中IFN-γ和TNF-α双阳性细胞的定量。(D)术后CD8 T细胞百分比的定量体外肽刺激纵隔淋巴结。(E)典型的流式细胞术标记纵隔淋巴结CD8 T细胞活化及(F联合肽刺激后CD8 T细胞中IFN-γ和TNF-α双阳性细胞%的定量。采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行统计学分析。用扫描电镜刻划为刻薄**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

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用ApoB 100衍生CD8表位免疫不影响动脉粥样硬化病变的大小和组成

为了评价ApoB 100特异性CD8 T细胞诱导在动脉粥样硬化病变发展中的作用，我们用Oro法对主动脉根部中性脂质进行了染色。3A)，并量化斑块大小(对照组4.18±1.79*10)5，车辆4.55±1.32*105，治疗5.57±2.35*105)和血管阻塞。3B)。为了评估斑块的稳定性，我们用Masson三色染色对主动脉根部进行了染色。3C)，并量化斑块胶原和胶原含量的绝对面积(图)。三维空间)。最后用MOMA-2抗体免疫组织化学染色。3E我们量化了主动脉根部动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞绝对面积和巨噬细胞含量。3F)。ApoB 100特异性CD8 T细胞诱导后，上述斑块参数均无明显改变。此外，胆固醇水平不受ApoB 100肽疫苗接种的影响(附图)。S3).

用ApoB 100来源的CD8表位接种疫苗不会影响病变的大小和组成。(A)主动脉根组织切片Oro染色的典型显微图像。(B)平均斑块大小和平均血管闭塞量。(C)通过天狼星红染色组织切片分析，胶原含量测定评价斑块稳定性。小天狼星红染色的主动脉根部组织切片的典型显微图像。(D)主动脉根部动脉粥样硬化病变胶原含量的定量。(E)MOMA-2染色组织切片的典型显微图像(F)MOMA-2比表面积和斑块含量的定量。采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行统计学分析。用扫描电镜作图。

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ApoB 100肽疫苗增强CD8 T细胞含量，但不影响主动脉内其他免疫细胞群

由于诱导的ApoB 100肽特异性CD8 T细胞是通过杀伤斑块吞噬细胞交叉呈现ApoB 100肽来降低动脉粥样硬化的，我们评估了主动脉弓中CD8 T细胞的肽反应性和表型，以及主动脉弓的免疫功能。

为评价CD8 T细胞对ApoB肽的反应性，将同一治疗组的3只小鼠主动脉收集、消化，用10μM/肽和Breceldin A联合培养4h，用流式细胞仪(门控，附图)对细胞进行检测。S4)。肽组CD8 T细胞百分率较PBS组明显升高(P=0.0573)。4A)。与接种ApoB 100肽的小鼠脾脏和纵隔淋巴结的回忆反应相比，我们没有观察到接种ApoB 100肽的小鼠主动脉弓细胞的回忆反应。4B、C).

用ApoB 100肽免疫可提高CD8 T细胞水平，但对主动脉根部ApoB 100肽无反应性(A)主动脉培养中CD8 T细胞百分比的定量。(B)典型的流式细胞术分析主动脉CD8 T细胞活化和(C)用所有肽混合刺激CD8 T细胞，定量检测IFN-γ和TNF-α双阳性细胞%。采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行统计学分析。用扫描电镜刻划为刻薄*P < 0.05.

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在动脉粥样硬化研究中使用Hubl-A2M+分离后直接用流式细胞仪检测小鼠主动脉CD8 T细胞水平、成熟和活化情况。在本研究中，与载体处理的小鼠相比，ApoB肽处理小鼠的CD8 T细胞水平显著升高，提示ApoB肽特异性T细胞迁移到斑块中。我们没有观察到主动脉CD8 T细胞在载体和肽处理动物之间的表型差异(附图)。S5)。除了CD8 T细胞的增加外，我们没有发现主动脉弓多发性髓细胞和淋巴细胞的明显变化。M−小鼠(附图)S4)，髓系细胞和淋巴样细胞群在从Hubl-A2的主动脉弓分离后直接出现。M+小鼠(附图)S6).

由于CD8 T细胞需要细胞接触才能杀死靶细胞。42我们还评估了CD8 T细胞是否与巨噬细胞(动脉粥样硬化病变中最突出的apc群体)在女性Hubl-A2主动脉根部共定位。M−老鼠。CD8 T细胞主要存在于动脉粥样硬化病变的帽状结构中，可能与巨噬细胞富集区外层的巨噬细胞相互作用，并在外膜中观察到CD8 T细胞。巨噬细胞主要存在于斑块的深层，但在某些组织切片中，我们也观察到更深层次的CD8 T细胞(补充图)。S7).

因此，我们的数据表明，ApoB 100特异性CD8 T细胞对动脉粥样硬化病变的大小和组成没有重大影响。

CD8 T细胞在动脉粥样硬化中的作用是复杂的，不同的CD8 T细胞亚群和不同抗原特异性的CD8 T细胞具有不同的作用。最近的研究表明CTL通过分泌促炎细胞因子而发挥整体致病作用。4,5，这似乎与冠心病患者外周血中活化和产生细胞因子的CD8 T细胞增多有关。43,44,45...然而，取决于靶抗原，动脉粥样硬化和动脉粥样硬化保护12,13,14抗原特异性CD8 T细胞应答已被报道。因为巨噬细胞凋亡的抑制增强了动脉粥样硬化17,18而MHCI分子的缺失加剧了动脉粥样硬化。19因此，我们认为促进CD8 T细胞介导的巨噬细胞杀伤具有一定的抗动脉粥样硬化作用。由于炎性斑块环境有可能促进巨噬细胞交叉表达斑块抗原。20,21,22,23我们推测，我们可以通过ApoB 100衍生CD8 T细胞表位特异性地靶向CD8 T细胞来杀伤巨噬细胞，这被认为是ApoB 100衍生肽p 210免疫后的动脉粥样硬化保护机制。13,15.

为了适用于男性疫苗接种，CD8表位必须能够与人MHC-I结合。因此，我们用硅预测工具预测了ApoB 100中存在的人HLA-A2结合亲和力和肽序列的免疫蛋白酶体处理。26,27,28,29,30,31,32,33,34,35...与高精度的mhc-i结合模型预测mhc结合剂和非结合剂46在T2细胞结合试验中，所有6个预测肽均与HLA-A2结合。随后，我们评估了该多肽在hHD小鼠中的免疫原性。36...用单个ApoB 100衍生肽对HHD小鼠进行HHD DC的免疫，除ApoB外，疫苗接种后一周，所有肽均能产生强健的肽特异性回忆反应。2524–2532，确认除ApoB外所有ApoB 100衍生肽的免疫原性2524–2532...通过利用无mhc-i表达的小鼠和DC，可观察到的CD8-T细胞反应仅限于HLA-A2。36.

在本研究中使用的多肽以前没有评估其调节动脉粥样硬化的潜力。然而，血液中针对LQWLKRVANP的抗体LLIDVTYLVALIPEPS，和FLIYITELLKKLQSTTVMNPYMKLAPGELT，包含ApoB406–417(LLIDVTYLVAL)，ApoB406–414(LLIDVVTYL)和ApoB4531–4539(FLIYITELL)肽被筛选为潜在的急性心肌梗死生物标志物。47...抗LQWLKRVANP抗体LLIDVTYLVALIPEPS和FLIYITELL急性心肌梗死患者和对照组血液中均检出KKLQSTVMNPYMKLAPGELT，与急性心肌梗死无关。47...我们的疫苗接种方法不太可能诱导高抗体水平的多肽，因为启动发生在肽脉冲MHC-I负载的DC，然后只有一个助推器与可溶性肽。此外，通过对ApoB 100肽诱导T细胞增殖能力的文库筛选，发现一种氨基酸序列为HT的多肽。FLIYITELL包含ApoB的KKLQSTTVM4531–4539(FLIYITELL)肽能促进脾T细胞增殖48.

为了在动脉粥样硬化研究中诱导持久的肽特异性CTL，Hubl-A2M+/−用肽刺激的HHD DC刺激小鼠，一周后用活化的CD 40抗体和多聚(I：C)调节肽增强。在实验性癌症模型中，这种疫苗接种方法诱导CTL能够有效地穿透和杀伤肿瘤细胞，表明这种接种方法可以产生迁移性和功能性的CTL。39,40,41...此外，多价疫苗接种增强了这种免疫方法的抗肿瘤效果。41...为ApoB406–414、ApoB3070–3078，和ApoB4531–4539，在接种Hubl-A2的ApoB 100肽的脾脏中检测到强烈的回忆反应。M+/−老鼠，表明接种成功。绝大多数的ApoB 100特异性CD8-T细胞产生多个细胞因子(干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α)，说明它们是功能性的CTL。49...有趣的是，ApoB不能检测到CD8 T细胞的召回反应。406–417和ApoB2356–2364，提示胸腺阴性选择或外周耐受诱导ApoB406–417和ApoB2356–2364在人ApoB 100中表达Hubl-A2M−/+老鼠。在提高脾脏ApoB 100肽特异性CD8 T细胞水平的同时，观察到ApoB 100免疫小鼠纵隔淋巴结中肽特异性CD8 T细胞、循环中更有效的CD8 T细胞和主动脉CD8 T细胞水平的升高。

与p210偶联阳离子bsa(P 210 Cbsa)通过CD8 T细胞诱导减少动脉粥样硬化的研究相比，尽管诱导了相对较大的抗原特异性CD8 T细胞应答。13,15未观察到ApoB 100特异性CD8 T细胞诱导对动脉粥样硬化的保护作用。尽管硅中预测模型表明p 210不携带CD8 T细胞表位(小鼠h2db和h2kb mhc-i等位基因)，CD8 T细胞参与p 210 cbsa对动脉粥样硬化的保护作用表现为CD8 T细胞从p210 cbsa免疫供体转移到受体，而在车辆处理供者的CD8 T细胞中未见。13...然而，在我们的手中，各种疫苗接种方案，包括对padre偶联的明矾佐剂p 210疫苗，产生了抗p 210抗体，但不影响人apb 100转基因LDLR中的CD8 T细胞群。−/−(未公布的结果)。因为fitc-p 210比非共轭fITC更有效地被发展中国家所接受。13表明p 210具有佐剂性质。ApoB 100的ldlr结合位点(包括p 210)也被用于构建CD8 T细胞表位SIINFEKL，促进SIINFEKL的交叉表达，诱导SIINFEKL特异性CD8 T细胞活化。50...由于CBSA-p 210免疫后CD8 T细胞抗原特异性未被评估，提示p 210可作为CBSA佐剂，增强阳离子BSA的摄取和交叉呈现。以前曾报道过用阳离子bsa免疫可以减少动脉粥样硬化。51增强对CBSA的免疫应答可能是CBSA-p 210免疫对动脉粥样硬化的保护作用的基础。

由于我们观察到对3个ApoB 100衍生肽的强烈回忆反应，诱导的CD8 T细胞反应的质量和数量不足以调节动脉粥样硬化。当我们观察到斑块中CD8 T细胞和巨噬细胞的差异定位模式时，APC和CD8 T细胞可能没有充分的协同作用来影响动脉粥样硬化。另外，虽然TLR诱导和吞噬凋亡小体，但也有可能诱导交叉呈现。23,52，其他因素可能会阻碍交叉呈现，如氧化脂质，导致脂质体紊乱。53它们被发现对DC的交叉表达很重要54,55...大幅度降低批次3交叉启动能力的观察−/−嵌合体不影响动脉粥样硬化，表明交叉呈现在动脉粥样硬化中不重要。56...然而，在我们的再刺激试验中，缺乏交叉表达和缺乏共定位是通过外源性肽的加入来避免的，这些肽与MHC-I结合。尽管ApoB肽处理的小鼠主动脉CD8 T细胞水平增强，但我们没有观察到主动脉来源的细胞对CD8 T细胞的反应性，提示动脉粥样硬化环境降低了CD8 T细胞对TCR刺激的反应能力。这种缺乏反应性可能是CD8 T细胞固有的，例如由于慢性抗原暴露在斑块中导致CD8 T细胞衰竭。57,58...与动脉粥样硬化患者CD8 T细胞耗竭相一致，动脉粥样硬化患者pd-1表达上调。59...另一方面，空斑细胞可以抑制CD8 T细胞的活化，例如pd-L1在人的巨噬细胞上被上调(渡边)。等人.，2017年)，这可能提供一个共同抑制信号斑块CD8 T细胞。然而，斑块APC诱导T细胞活化的可能性很大程度上是未知的，但是评估将是非常有趣的。此外，最近发现动脉粥样硬化病变中的CD8-T细胞由于局部腺苷信号而显著降低细胞因子的产生。60...因此，血小板CD8 T细胞抗原特异性活化受损，可能使ApoB 100特异性CD8 T细胞的诱导失效。

从斑块材料中提取mhc-i表位，以及单细胞tcr测序，可以极大地提高对动脉粥样硬化中ctl生物学的认识，特别是由于新的生物信息学途径正在开辟，使得tcr序列能够与抗原连接。61,62,63...这些抗原的鉴定有助于揭示动脉粥样硬化和动脉粥样硬化保护CTL介导的免疫应答，通过接种抗原特异性CTL来揭示动脉粥样硬化的治疗方案。

总之，我们评估了接种ApoB 100衍生CD8 T细胞表位对动脉粥样硬化发展的影响。我们可以在8周内产生并维持对3个抗原表位的非常强的CD8 T细胞反应，但与其他报道CD8 T细胞通过接种ApoB 100衍生肽而产生的动脉粥样硬化保护作用的研究不同。13,15增强CD8 T细胞对ApoB 100的免疫作用并不能减少动脉粥样硬化的发生。

硅肺HLA-A2限制性人ApoB 100 CD8 T细胞表位预测

利用免疫表位数据库和分析资源(iedb.org)，预测人ApoB 100来源的HLA-A2限制性CD8 T细胞表位。首先使用NetMHCPAN选择了前1%的预测粘结剂。29该模型是HLA-A2的最佳预测模型。64...在此之后，利用蛋白酶体切割/TAP转运/MHCⅠ类联合预测器，根据蛋白酶体切割和TAP转运对剩余的肽进行排序。26,27和一个一致的有约束力的预测28组合人工神经网络31,32,33,34、稳定矩阵法(SMM)30，以及从组合肽库(CombLib)模型导出的评分矩阵(CombLib)。35...合成了6种顶级肽(IHB、莱顿大学医学中心)。

HLA-A2结合试验

由于多肽水溶性差，在DMSO中制备了10 mm肽库，并进一步稀释成完整的IMDM。T2细胞，这是DR给我的礼物。Heemskerk(莱顿大学医学中心，Leiden)与多肽浓度(0.01~50μM)和3μg/mlβ-2微球蛋白(Sigma-Aldrich)共同孵育，流式细胞仪检测HLA-A2的表达。

动物

所有动物工作都得到莱顿大学动物伦理委员会的批准，动物实验的开展符合欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令的指导方针。人HLA-A2转基因(HHD)，H-2DB−/−β2m−/−C57BL/6小鼠36是医生送的礼物。Lemonnier(巴黎巴斯德研究所)与人ApoB 100转基因LDLR杂交−/−C57BL/6小鼠37,38是医生送的礼物。尼尔森(隆德大学，隆德)，将人类ApoB 100和HLA-A2基因转化为H-2D。B−/−β2m−/−LDLR−/−(无鼠mhc-i表达，Hubl-A2M−)和hApoB 100和HLA-A2转基因的H-2DB+/+−β2m+/+−LDLR−/−小鼠(小鼠MHC-I表达，Hubl-A2)M+)。ApoB 100在血浆中的表达，用ApoB 100 ELISA显影剂试剂盒(Mabtech)检测。应用HLA-A2-APC(BB7.2，Biolegend)、H2Db-FITC(28-14-8，热Fisher)和H2Kb-BV 421(AF6-88.5，BD生物科学)抗体，流式细胞术检测外周血中HLA-A2、H2Db和H2Kb的表达。在EDTA包被的毛细管(Microvette，Sarstedt)中采集非诺亚型血。用PCR方法检测LDLR缺陷(引物：正向引物；CAGTGCTCCCCTCATCTCTTG，反向-WT；CATCTCCCCCCGCAGTTTGTGT，反向-KO；CGCCTGCTGACGAGTTTCTG)。所有小鼠都被单独饲养在带有白杨树被褥的通风笼中，每笼2-4只小鼠，并被喂食常规饮食或含有0.25%胆固醇和15%可可脂的西式饮食(特殊饮食服务，Witham，Essex，英国)。实验中使用的所有小鼠均在12-20周龄。动物随机分为年龄、体重、血浆Apob 100水平、HLA-A2、H2Db和H2Kb表达。饲料和水是可用的。在献祭时，用含氯胺酮(40 mg/ml)、阿托品(50μg/ml)和西嗪(6.25mg/ml)的混合物皮下注射(120μl)麻醉小鼠。随后，用股动脉切断术和经左心室灌注PBS使小鼠安乐死并放血。

免疫

简单地说，骨髓是从HHD小鼠的股骨和胫骨中获取的。骨髓细胞在非培养培养皿中加入8%FCS(GE Healthcare)、100 U/ml青霉素/链霉素(Lonza)、2mm Glutamax(Invitrogen)+20 ng/ml GM-CSF(Invitrogen)培养。6细胞/ml(每板10毫升)。3天后，将10 ml新鲜、完整的IMDM和20 ng/ml的GM-CSF加入到培养皿中。第6天，仔细吸出10 ml培养基，避免细胞脱落，代之以20 ng/ml GM-CSF的完全IMDM。第9天，取非/轻度贴壁的DC，用25μg/ml的高分子量聚(I：C)(Invivgen)在非培养培养皿中培养。在50毫升的猎鹰管(10*10)中，用多肽(10μM)或载体(DMSO)在37°C下脉冲2小时。6细胞/毫升(细胞/毫升)在不断的搅拌，以避免粘在塑料上。DCS用PBS和2*10清洗两次。6细胞经尾外侧静脉静脉输注。

在动脉粥样硬化研究中，小鼠接受了静脉注射。以5%DMSO+50μg高分子量™，Invivogen50μgαCD 40(载体组)或5%DMSO+30μM肽(约67μ/肽)和50μgαCD 40(载体组)的PBS为增强剂，接种DC后1周，共接种200μ1。

原代细胞制备

再刺激培养和免疫细胞流式细胞分析，主动脉从心脏上方分离到心尖高度，并从脂肪组织中清除。主动脉用剪刀切碎，用含有400 U/ml胶原酶I型(Sigma-Aldrich)和120 U/ml胶原酶XI型(Sigma-Aldrich)的0.5ml PBS消化。溶组织梭菌60 U/ml牛睾丸Ⅰ型透明质酸酶(Sigma-Aldrich)和60 U/ml DNase 1(Sigma-Aldrich)在37℃恒温搅拌30 min。将3只小鼠的主动脉消化液混合在70μm以上的过滤器中，制成单细胞悬液。取脾脏和纵隔淋巴结，将70μm以上的滤过器捣碎，获得单细胞悬液。在牺牲时，血液是通过晚期复古眼眶出血获得的。用1ml ACK裂解缓冲液(Nh)孵育血液中的红细胞两次，脾细胞悬液一次。4CL 150毫米，KHCO310毫米钠2EDTA 0.1mm)，室温作用30秒。

肽特异性免疫应答的评价

对于抗原特异性CD8+T细胞反应的测量，大约为2.5*10。6脾细胞与U型底板中指示浓度的单个肽共同孵育。用于评估纵隔淋巴结中的特异性CD8 T细胞，约为1.5*10。6用10μM的多肽与U型底板联合孵育细胞。为了测定主动脉中肽特异性CD8 T细胞的反应，将3种主动脉消化液中的细胞组合起来，约为20*10。5活CD 45+细胞(流式细胞术)，并与10μM的所有肽结合在V底板。在RPMI(Lonza)中，用多肽与Bregeldin A(BD生物科学)和monensin(BD Bioscience)共同孵育4h，加入8%FCS、100 U/ml青霉素/链霉素和2mm谷氨酸。

流式细胞术

用2%FCS和δCD 16/32抗体(93，Biolegend)和eBioscience™可固定活性染料eFluor™780(热Fisher)对单细胞悬液进行细胞外染色，在4℃下对活细胞和死亡细胞进行30 min的鉴别。细胞内细胞因子染色：细胞外染色后，细胞在细胞内固定/细胞周期™缓冲液(BD生物科学)中孵育15 min，用PERM/Wash缓冲液(BD生物科学)冲洗两次，4°C染色45 min，在BD生物科学上购买以下抗体：IL-17-FITC(TC 11-18H10)、F4/80-BV421(BM8)、CD4-V 500(RM-4-5)、CD19PE-Cy7(1D3)。CD3 V 500(500A2)。在Biolegend购买以下抗体：CD8-BV 510(53-6.7)、NK1.1-BV650(PK 136)、CD4-PerCP(RM4-5)、CD45-AF700(30-F11)、CD11b-PE/Dazzle 594(M1/70)、Thy1.2-PE-Cy7(53-2.1)、TNF-δ-PE(MP6-XT 22)、CD11c-FITC(N 418)、Ly6G-PerCP(1A8)、Ly6C-APC(HK1.4)。抗体来源：IFN-Y-eFluor 450(XMG 1.2)、IL-10-APC(JES5-16E3)、CD11b-进化605(M1/70)、MHCII-进化655(M5/114.15.2)、CD 19-PE(EBio1D3)、CD8-PE-tr(5h10)、CD62L-PerCP/Cy5.5(MEL-14)、CD 44-APC(7)。采用UltraComp eBeads(热Fisher)和电弧胺-反应补偿珠(热Fisher)进行补偿测量.细胞分析采用细胞FLEXS流式细胞仪(贝克曼库尔特)和CytExpert2.0软件(贝克曼库尔特)，并进一步用Flowjo软件(TreeStar，Inc.)进行分析。

组织学

心脏切成两半，在OCT培养基中孵育30分钟。30分钟后，心脏在干冰上快速冷冻，保存在−80°C，然后将主动脉根部冷冻(10μm)后，以70μm间隔(7片/鼠)取主动脉根部的™贴壁显微镜切片。中性脂肪用油红O染色，以评估三个主动脉瓣区域内随后五个心脏切片的病变大小。采用Masson三色染色法(Sigma-Aldrich)测定病变胶原含量。用MOMA-2抗体(SanBio，1：1000稀释)，CD8 T细胞(Ly-2，1：100稀释，BD制药)免疫组织化学染色检测斑块面积和胶原含量。用5%奶粉阻断玻片，RT加一次抗体2h，4°C隔夜孵育一次抗体，RT时用0.3%过氧化氢孵育30 min，阻断内源性过氧化物酶活性。然后用多克隆兔抗大鼠Ig HRP(DAKO)在RT下孵育1h，然后用VECTASTAIN ABC HRP试剂盒(VECTASTAIN ABC HRP Kit)。用NovaRed(媒介实验室)染色。