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T细胞受体β链中的单变量结构域作为单功能和双功能CARS和TCR功能

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发表时间:2019-11-22 19:34作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

T细胞受体β链中的单变量结构域作为单功能和双功能CARS和TCR功能

摘要

利用T细胞受体(TCRs)和嵌合抗原受体(CARS)进行细胞治疗是一波新的免疫治疗浪潮,引起了广泛的关注和投资。这一医学领域的进一步进展在一定程度上取决于提高工程部件的功能能力,同时保持重组结构的总体大小,以确保其与现有基因运载工具的兼容性。我们描述了一个单变量域TCR(SvDTCR),它仅利用β链的可变域(Vβ).该Vβ模块不仅工作在TCR和CAR格式中,而且可以用来创建单链双专用车和TCR。单个配体结合的Vβ结构域在不同格式下的比较表明,在Jurkat和原始T细胞中,单独Vβ序列控制着CAR或TCR结构的敏感性和特异性,而不管信号形式如何。

导言

细胞治疗有望彻底改变医学的某些方面,并且随着第一批工程嵌合抗原受体T细胞(cart-ts)的批准,最近取得了一个重要的里程碑。1,2...这种治疗方式依赖于受体分子(典型的工程抗体单链可变片段(ScFv)结构域),将T细胞活性重定向到在癌细胞上表达的特定细胞表面靶抗原。由于肿瘤选择性表面蛋白的反复表达在实体肿瘤中极为罕见,药物发现已开始探索肽-mhc复合物(PMHC)作为具有工程受体或天然TCRs的car-ts和T-细胞的靶机会。

pmcs是tcrs的天然配体,因此可作为tcrs及其衍生物的靶点。3...Ⅰ类MHC分子由α链上与β2微球蛋白相关的分子二聚体组成。这种二聚体在内质网折叠时,以一种退化的方式与单个短肽结合,形成pMHC复合物。4...然后,pMHC被转移到膜表面,在那里可以被同源T细胞识别。如果超过一定的结合阈值,pMHCs可通过TCRs触发T细胞的激活和效应功能。

T细胞受体异二聚体(αβ)与CD3蛋白复合物在T细胞表面表达,在化学计量学α:β:γ:δ:2ε:2ζ中提供了必要的信号域。5...α和β亚基构成了pMHC的中心结合元件,与其相对的抗体结合片段(Fab)具有显著的结构相似性。α和β亚基的可变区是由离散的V、D和J基因元件通过基因组重组组装而成的。由于β链包括D区和两个连接区(V-D和D-J),因此α链本身比α链复杂,而α链只有一个(V-J)。α和β亚基通常都有助于结合I类mhc配体上的一个小区域,该配体远连于膜上,包括mhc分子的残基以及与其络合的短肽。6,7.

pMHCs提供了从胞内蛋白质中提取的多肽的选择,这些多肽存在于细胞质中,而大分子(如单克隆抗体)则无法获得。随着更精细的细胞治疗被考虑、设计和部署,组件的小尺寸和模块化变得越来越有价值。例如,双功能受体的产生,即具有两个连接结构域的受体结合了不同的配体,提供了同时针对两种不同抗原的选择,在某些治疗环境下,这是一种潜在的非常有价值的资产。然而,TCRs的某些方面可能会限制其作为大分子和细胞治疗应用的模块组件的用途,这些限制可能根植于它们的基本结构和功能。这种结构的复杂性和越来越大的规模可能会阻碍下一代双功能疗法的实际发展。

双功能靶向分子的吸引力,再加上基因转移载体(如伦蒂病毒和逆转录病毒)的包装限制,提出了tcrs是否可以作为单个结合域的问题;例如,作为一个没有正常伙伴α可变域(Vα)的Vα。据我们所知,虽然鲨鱼种类中有许多与哺乳动物同源动物不同的新型tcrs,但还没有关于这种流线型tcr的报道。8,9...如果对特定的pMHCs保留特异性和功能活性的这种简化的TCR可变域是可能的,它可以为SvD TCR提供一条更小、更复杂的结合能力的道路。

虽然SvD TCR是一个很有吸引力的概念,但并不明显的是,这种剥离式的结合域可以很容易地从哺乳动物的TCRs中派生出来。tcrs的三维结构显示出一个复杂的结构,tcrvα和β链聚集在一起,覆盖了一个较大的(>200)个小时。2)疏水表面。去除Vα结构域使这一表面暴露于不稳定的溶剂相互作用中。与过去几十年来在抗体方面进行的蛋白质工程类似,这种巨大的结构变化需要通过设计或选择进行重大调整,以适应单变量的结构域格式。10,11...尽管面临挑战,单抗vh结构域在产生具有多特异性结合特性的新型临床分子方面越来越受欢迎。12,13.

在这里,我们证明了SvDTCRs可以从Vβ域构建,而不需要在β链的框架和恒定区域内进行额外的序列工程。这些SvD TCRs在包括T细胞在内的哺乳动物细胞表面稳定表达。它们选择性地与pMHC四聚体结合,似乎以与全TCRs相同的方式触发T细胞。此外,它们作为CAR和TCR的双功能蛋白相互作用。这种Vβ结构域为下一代工程T细胞治疗提供了强有力的基础,并阐明了决定TCR和CARS信号敏感性的机制。

结果

单β的pMHC结合域的鉴定

为了鉴定肽特异性的pmhc结合分子,利用细胞培养中的V(D)J重组,在HEK 293细胞中产生tcr Vβ结构域的序列多样性,同时保持Vα恒定(有关htrg的详细信息,请参阅ww 2017/091905专利)。TM用于生成TCR多样性的平台)。用pMHC多价四价体对含NLMWITQV或MAGE-A3肽(SLLMWITQV)或MAGE-A3肽(FLWGPRALV)复杂的HLA-A*02-01等位基因的TCR表达细胞进行了分类。注意C端到Cα/β结构域,该文库构建编码人CD3ζ跨膜和细胞质结构域,并与β链融合,促进其在HEK 293细胞中的表达,并随后进行分析。特异性的pMHC结合细胞经多次富集后从文库中纯化。在此过程中,α链表达被无意中丢失,在没有第二个TCR可变域的情况下赋予特定表位结合的β链被恢复。这些只有β的克隆被用作下面描述的研究的基础。

β域在car和tcr格式中稳定表达并显示选择性pmhc绑定。

从β-A2/NY-ESO-1肽或HLA-A2/MAGE-A3肽的™序列中获得了几个只选择HLA-A2/NY-ESO-1肽的克隆,并对其进行了序列测定。其中3条和4条独特的CDR 3序列分别用于NY-ESO-1和MAGE-A3-选择性结合剂(补充表)。沙一)。有趣的是,这两个pMHC目标的所有7个β独特型都使用TRBV 5-8*01片段,这表明在没有正常Vα伙伴的情况下,这个Vα片段的结构特性可以促进单个结构域的稳定性(见下文)。此外,CDR 3环的平均长度为16.3个氨基酸(范围为12-20),比一组人TCR Vβ序列中观察到的平均长度长2个氨基酸。14...用流式细胞仪检测其在HEK293T细胞中的表达能力及与pMHC靶点的结合能力。用TcRβF1(8A3)抗体检测表面表达的β链。这种抗体不染色TCR的原生形式。15,只允许在CAR格式中检测TCRβ链。以四聚体的形式将生物素标记的含肽MHCⅠ类A*02:01与荧光载体标记的链霉亲和素结合生成pMHC四聚体。所有独特型均在细胞表面稳定表达,具有不同的四聚体结合能力(附图)。沙一)。选择了最强的结合剂,即NY-ESO-1靶向Vβ域的Idiotype 2和MAGE-A3靶向域的Idiotype 5。

为了评价这些Vβ单域的特异性和通用性,将NY-ESO-1和MAGE-A3结合的独特型(分别为#2和#5)格式化为tcrαβs(简称svd tcr)和CARS(称为Vβ专用CAR)。对于TCRαβ格式,一个在人类中大量表达的通用α链被用作替代项(TRAV 41*01/J 49*01)。在CAR格式中,Vβs连接到β链常数区(Cβ),然后与CD3ζ跨膜和胞内信号域(第一代CAR)或CD 28跨膜区和CD 28和CD3ζ细胞内信号域(第二代CAR)融合。1A)。为了进行比较,我们使用了先前报道的NY-ESO-1靶向TCR克隆1G4。16和MAGE-A3-靶向小鼠TCR17,以及从重新格式化的抗体表面显示(HuTARG)派生的scFv的CARS。TM)图书馆。转染HEK293T细胞,流式细胞仪检测其表达和结合特异性。采用7个具有不同HLA等位基因和不相关肽的非靶pMHCs的混合物产生阴性对照四聚体。流式细胞仪检测结果表明,NY-ESO-1和MAGE-A3靶向Vβ-CARS在HEK293T细胞中均稳定表达,并与靶四聚体选择性结合。SvD TCRs对pMHC靶标也有表达和显示特异性,但结合率明显降低(图1)。1B).

图1
figure1

Vβ域在CAR格式中稳定表达,并表现出选择性的pMHC结合.(a)实验中使用的结构的原理图。注意,1第五代β专用汽车将通过CD3ζTM进行二聚体化,这在原理图中没有描述.(b转染NY-ESO-1(TOP)和MAGE-A3(底部)pMHC靶向结构的HEK293T细胞FACS图。x轴反映了与细胞结合的目标(红色)和非目标(蓝色)pMHC四聚体的数量。y轴反映细胞表面TCRβ链的数量.(c转染NY-ESO-1(顶部)和MAGE-A3(底部)pMHC靶向结构的Jurkat细胞FACS图。x轴反映了与细胞结合的目标pMHC四聚体的数量.

为了更自然地检测只有Vβ的CARS和SvD TCRs的表达和功能,将其转染到Jurkat人T细胞株中。此外,还检测了与CD 28跨膜区连接的Vβ-Cβ结构域和CD 28、4-1BB和CD3ζ细胞内信号域(第三代CAR)的CAR结构。所有NY-ESO-1和MAGE-A3靶向VβCARS均显示在Jurkat细胞中可检测到四聚体结合.与第一代相比,第二代和第三代汽车中的四聚体结合率略高。然而,SvD TCR没有结合任何一种pMHC靶标的四聚体(如图所示)。1C).

tbb 5-8vβ片段编码的序列可能更容易形成单个功能结合域。

基于与MAGE-A3 pMHC络合的Vβ−5 TCR的晶体结构,我们模拟了所描述的MAGE-A3 Vβ专区之一(Idiotype 5),其结果与需要对多肽主链进行一些调整的预期相吻合(图5)。2A)18...对TRB5-8Vβ结构的分子动力学模拟表明,与Vα的界面至少部分被CDR 3环在疏水表面的塌陷所覆盖,以适应Vα的丢失。2B)。此外,对另外两个TCR(6AT6和6AVG)进行建模。19其中含有来自其他家族的V段,表明与Vβ5−8相比,至少其他一些Vα结构域需要更彻底的改变才能形成一个热力学稳定的结构,而不是Vβ5−8(如图8所示)。2C,d)。特别是,TRBV 28编码区的晶体结构比Vβ5-8结构域暴露出的疏水表面积高出近80%。这样的序列可能有一条更具有挑战性的路线来形成一个稳定的单球状结构域。

图2
figure2

结构同调建模分析。为(ad)与Vβ5 TCR(5 BRZ)配合物中使用MAGE肽/HLA-A2 pMHC原子坐标的同源模型。空间填充表面模型上的疏水性斑块被标记为绿色;带电和中性表面为白色。对于A,C和D,一条带状漫画显示Vα通常在TCRα/β二聚体中与Vβ结合。计算了疏水表面与α/β接触面的交点,并在2. (a)MAGE-A3SvDTCR同源性在5BRZ模板上建模,没有TCRα亚基。(b)MAGE-A3 SvD TCR同源性在5 BRZ模板上,经100 NSEC分子动力学模拟。(cTRBV 28结构域来源于5BRZ模板上的TCR(6AT6)同源模型,没有TCRα亚基。(d)TRBV 9结构域来源于5BRZ模板上的TCR(6AVG)同源模型,不含TCRα亚基。

vβ仅限于CAR格式的域在功能上是活动的。

为了评价Vβ单域结合的靶点是否能产生功能活性,将表达nFAT驱动的荧光素酶报告基因的工程Jurkat细胞转染到只有Vβ的载体上。连续稀释的NY-ESO-1和MAGE-A3肽在转染的Jurkat效应细胞共培养16h前加载到T2细胞(HLA-A2+)上。共培养6h后,用发光法测定群体平均NFAT信号.肽滴定曲线显示,NY-ESO-1和MAGE-A3VβCARS均能触发肽浓度依赖性的NFAT激活。3)。激活是特定于其各自的目标肽(补充图)。S2)。与基于EC的第二代和第三代汽车相比,第一代轿车的灵敏度要低两倍。50(补充表)S2)。与具有亲和成熟scFv结合剂的第三代CARS相比,具有Vβ结构域的第三代CARS的灵敏度较低,分别为~100×(NY-ESO-1)和~1000×(MAGE-A3)(补充表)。S2).

图3
figure3

CAR格式中的Vβ仅域显示靶肽特异性功能激活.转染Jurkat细胞与NY-ESO-1(左)或MAGE-A3(右)肽负载T2细胞共培养6小时后,NFAT-荧光素酶信号。错误条表示SD(n=2)。

MAGE-A3Vβ专用汽车显示背景NFAT信号升高(如图所示)。3)。然而,这一特性似乎并不是所有Vβ专用CAR结构的固有特性,因为其他三种特殊类型的MAGE-A3Vβ-纯模块显示的补强信号低于scFv CAR(补充图1)。S3)。为探讨Vβ单用CARS细胞的定位和聚集特性,将转染的Jurkat细胞固定,在非离子洗涤剂存在或不存在的情况下,用同源靶pMHC四聚体染色进行渗透(附图)。S4)。高、低背景组间的表面表达和细胞内聚集均无明显差异。

为了确定只有Vβ的CAR结构的表位结合所需的最小模块,将Cβ结构域替换为CD8铰链的CAR载体被生成(补充图)。S5)。肽浓度依赖性的nFAT信号与这些结构只有轻微的降低敏感性,表明Cβ不是必要的Vβ单结合能力(补充图)。S5).

转染SvD TCR的细胞没有信号,与这些细胞中缺乏四聚体结合相一致。

SvD TCRs受Vα结构域的阻碍

为进一步研究T细胞表面表达及TCR复合物的形成,将含Vβ结构域的β链和TCRα代用品链转染SUP-T1细胞。sup-T1细胞来源于一种淋巴瘤,在tcr、α和β基因簇内存在染色体倒置,从而阻止内源性tcr复合体的表面表达。由于tcrα和β不表达,tcr复合物的其他亚基,即4个CD3蛋白被表达,但不能在表面组装。20...因此,用CD3Ɛ染色法检测转染的TCRα和TCRβ在细胞表面的表达和配对。正如以前报道的那样,NY-ESO-1控制TCR在SupT 1细胞表面表达.此外,Vβ-纯复合物也呈CD3Ɛ染色阳性,提示该复合物整合了β和α亚基。然而,只有对照TCR显示四聚体结合,与转染Jurkat细胞的观察结果一致(见图)。4B).

图4
figure4

移除Vα使SvD TCR功能得以实现。(a)测试结构的原理图。(bpMHC四聚体结合和TCR复合物形成(CD3ε表面表达)。(c转染Jurkat细胞与NY-ESO-1(左)或MAGE-A3(右)肽负载T2细胞共培养6小时后,NFAT-荧光素酶信号。错误条表示SD(n=2)。

由于我们观察到只有Vβ结构域的pMHC四聚体以CAR形式结合,而不是作为TCR复合物,我们推测TCR Vα可能会阻碍Vβ结构域与靶区结合的能力。为了验证这一假设,在SUP-T1细胞中删除了α链的Vβ结构域,并与Vβ链共同表达。这些细胞表现出四聚体结合,证实Vα确实阻碍了Vβ专一结构域的表位结合。4A,b)。此外,转染β和Vα缺陷链的Jurkat细胞显示了T2/肽依赖性的激活,表明当他们的正常Vα伙伴被移除时SvD TCRs被保留,但α链的其余部分被保留(图1)。4C)。尽管有此功能,流式细胞术仍未观察到转染Jurkat细胞中的四聚体结合,说明NFAT报告系统比我们以前观察到的四聚体结合更为敏感。

进一步修剪Cα结构域的尝试导致SUP-T1细胞中修饰TCRs的四聚体结合完全丧失,而Jurkat细胞相应的功能丧失(补充图)。S6)。这一结果表明,只有完整的Cα结构域才能形成适当的代用品,而只有跨膜结构域的最小α多肽不符合Vβ的结构域功能,这可能是因为Cα结构域缺乏有效的α复合物形成,部分原因可能是Cα/β界面暴露的疏水表面所致。

CAR和TCR格式Vβ域信号敏感性的比较

我们的系统允许对CAR和TCR上相同的配体结合域进行直接比较.有趣的是,这两种格式的敏感性是相似的,这表明配体--结合域--它的亲和力和几何构型--是敏感性的主要决定因素,而不是CAR和TCR之间信号机制的细节。这与我们将scFv与相同的pMHC靶标嫁接到对照NY-ESO-1 TCR上的研究是一致的,该方法通过去除Vα和Vβ结构域来接受scFv。这些杂交TCRs在Jurkat信号分析中的敏感性几乎与它们所来自的汽车相同,比父母TCR(补充图所示)低近100倍。S7)。这些观察表明,至少在一个控制系统中,在Jurkat细胞中NFAT的激活是敏感性的度量,配体结合域决定了信号的敏感性。

双功能Vβ域在CAR和TCR格式中的作用

最近的临床试验表明,目前的过继性T细胞疗法易受肿瘤细胞抗原逃逸的影响。21,22...能识别多种抗原的T细胞为预防此问题提供了一种潜在的保障。双特异性受体已经在CARS中被探索和发展。23,24...然而,有能力针对两种不同抗原的TCR尚未被报道。考虑到Vβ域的小而通用的绑定特性,我们怀疑它们可能以更复杂的格式作为双功能CAR或TCR。

为了验证这一想法,双功能Vβ专用汽车以NY-ESO-1为目标。MAGE-A3 pMHCs是在具有Cβ和两个Vβ域的第二代汽车体系结构中通过a(G)串联而成的。4s)3GG柔性连接器。转染这些结构的Jurkat细胞通过流式细胞仪检测到NY-ESO-1和MAGE-A3四聚体的结合。5A)。在NFAT-荧光素酶报告试验中,双特异性CARS对NY-ESO-1和MAGE-A3肽负载的T2细胞均起作用,其个体敏感性仅略有下降(图一)。5B)。离膜较远的结合区(即N端)的敏感性略有下降,而直接附着在Cβ上的结合区与单特异性CARS相比无明显变化。

图5
figure5

具有两个配体结合结构域的双功能CARS和TCR。(a转染Jurkat细胞的流式细胞术(FACS)图,分别与NY-ESO-1 pMHC四聚体(y轴)和MAGE-A3 pMHC四聚体(x轴)结合。M指MAGE-A3,N指NY-ESO-1.(b转染Jurkat细胞与NY-ESO-1(左)和MAGE-A3(右)肽负载T2细胞共培养6小时后,NFAT-荧光素酶信号。错误条表示SD(n=2)。(c)测试结构的原理图。M指MAGE-A3,N指NY-ESO-1.(d)与(b).

为了检查V只β结构域是否可以作为双特异性tcrs,我们在这两种结构域中都构建了变体。顺式反式配置(即,在β链上串联,或在每个链上有一个Vβ域,Cα和Cβ(图1)。5C)。作为对照,Vβ在TCRα链上也与缺乏Vβ结构域(即仅Cβ)的TCRβ链相融合。这一结构在JurkatNFAT-荧光素酶报告分析中没有显示出功能,表明Vβ结构域移动到α链上,其功能被取消(如图1所示)。5D)。因此,反式双特异性SvD TCRs仅对融合在β链上的粘结剂的pMHC靶点有功能活性(图1)。5D). 顺式通过a(G)串联连接两个Vβ结构域,生成双专一SvD TCR。4s)3GG柔性链接器和表达此结构与替代TCRα链与Vα删除。令我们惊讶的是,双功能顺式NY-ESO-1结合剂在N-端与MAGE-A3结合剂N-末端的SvD TCRs和Cβ的MAGE-A3结合剂N-末端均显示Jurkat细胞的NY-ESO-1和MAGE-A3肽依赖性信号(图1)。5D). 顺式在N-末端与MAGE-A3结合剂的另一个方向的Vβ结构域对两个靶肽也具有功能活性,但MAGE-A3肽的信号强度(Emax)降低。欧共体50在T2上负载肽的分析中,这两种结构的敏感性与单特异性亲本的敏感性相似(补充表)。S2)。我们还测试了当提供给表达双特异性结构的Jurkat细胞时,两种pMHC配体之间是否存在功能水平上的相互作用。使用Bliss和Loewe独立性的分析方法,除了潜在的加性效应之外,没有任何东西被观察到。25,26.

只表达Vβ的原代T细胞具有细胞毒活性

为评价Vβ结构域对T细胞活性的影响,将原代T细胞导入慢病毒,经NY-ESO-1或MAGE-A3四聚体染色证实其表达。6A)。CAR结构比TCR结构表达得好得多,这很可能是由于引入的TCR链与内源性TCR链的错配所致。将转导的T细胞用于IncuCyte细胞杀伤实验,使靶细胞和效应细胞在37℃的时间内能在显微镜下显示出来。将稳定表达核定位GFP的A 375细胞负载10μM、NY-ESO-1或MAGE-A3肽,按1:1比例与转导T细胞共培养。用四聚体染色法检测T细胞的转导率,调整T细胞数。

图6
figure6

在原代T细胞中表达的Vβ单用CARS和SvD TCRs显示出细胞毒性和释放细胞因子的作用.(a原代T细胞经NY-ESO-1或MAGE-A3探针染色后表达。(b将10μMNY-ESO-1(左)或MAGE-A3(右)肽负载的A 375细胞与转染NY-ESO-1(左)或MAGE-A3(右)结合结构的T细胞按1:1比例共培养42小时。绘制了各时间点绿色荧光总面积除以时间零值的比值。错误栏指示sd(n=2)。(c)用CBA法测定共培养24小时培养上清液中干扰素γ的含量。b)。错误条表示SD(n=2)。

对于NY-ESO-1结合剂,表达基准TCR的T细胞表现出最强的细胞毒活性,其次是表达scFv-CAR的T细胞,以及具有类似杀伤活性的CAR和TCR格式的Vβ结构域(图1)。6B)。24小时共培养上清液中检测到的干扰素γ也有类似的趋势。6C)。过表达单链NY-ESO-1-β的K 562细胞2M-HLA-A2三聚体27并以GFP为靶细胞进行实时杀伤实验。在抗原大量呈现的情况下,所有4个NY-ESO-1靶向结构都显示出类似的杀伤活性(补充图)。S8).

表达MAGE-A3基准TCR和ScFv-CARS的T细胞只表现出轻微的细胞毒性作用,而V-β专用型CAR和SvDTCR则触发了更强的杀伤活性(图1)。6B)。然而,这些Vβ专用型CAR和SvDTCR细胞对K 562细胞也表现出较弱的细胞毒性,没有任何MAGE-A3肽(附图)。S8),提示这些结构可能引发靶细胞与配体无关的凋亡。这与转染MAGE-A3Vβ-CAR和SvDTCR的Jurkat细胞的高背景NFAT信号相一致。4C).

讨论

我们已经建立了Vβ的唯一结构域,表达,特别识别同源pMHC配体,并在Jurkat和初级T细胞中功能强大。针对两种不同的pMHC靶标的多个结合剂的分离和表征表明了这种效应的普遍性。

在TCR格式中,β链利用缺乏Vα片段并与6个CD3亚基复杂的激活能力的TCR的代理α链。我们推测,对代谢性α亚基的要求与构成功能性TCR的其他CD3亚基在膜中形成复合物有关。序贯N端缺失证明球状Cα结构域是SvDTCR完全活性所必需的.相反,Vα结构域存在于α亚基上,相对于单个Vβ多肽,对其表面表达无影响,但干扰配体结合,这可能是由于pMHC配体与其同源Vβ结合位点的位阻所致。

与其他与pMHCs结合的TCRs和抗体相比,SvD TCRs的选择性更好。他们保留所选择的HLA限制。因此,进化有利于双域配体结合结构的事实并不一定排除选择性单域结合剂的产生,这一特性也适用于抗体基因家族。28...相反,可能是由两条链组成的曲目通过组合组合产生必要的多样性。

此外,配体结合模块可以嫁接到CAR信号结构中,其功能独立于TCRα链。两个配体结合域(一个NY-ESO-1和一个MAGE-A3粘合剂)与各种不同的CAR格式兼容,其中包括不同的CAR组件(图1)。1,3)。有趣的是,CAR版本的Vβ-只有配体结合域有相似的敏感性,他们的TCR表亲.这一结果表明,配体结合区的性质决定了功能敏感性,而不是信号成分的详细结构,而是受体的结合性质决定了敏感性,至少在Jurkat NFAT激活实验中是这样。

这一结论被观察到,从针对相同的pMHC目标(NY-ESO-1和MAGE-A3)产生的抗体产生的scFv序列,当嫁接到TCR亚基时,产生的杂交TCRs对携带相同scFVS的CAR结构的敏感性几乎相同。S6)。因此,有两个不同的pMHC靶标和两个独立的配体结合区,一个来自TCRs,另一个来自抗体,灵敏度与配体结合域一致地跟踪,而不是信号分子的类型。这些结果再次表明,TCRs可能不是通过其高度进化的多亚单位机制,而是通过体内的选择过程来获得其惊人的敏感性。可能α和β链都需要与同源MHC相互作用才能传递敏感信号。然而,对先前报道的tcr-pmhc结构和氨基酸序列的分析表明,cdr 3α与目标pmhc没有接触,而cdr 3β接触始终存在。29...TCRs的分离和研究离体研究人员可能进一步解释了他们的非凡效力是通过在抗原阳性底物上生长或在数十万个T细胞中挑选罕见的抗原应答T细胞克隆来进行额外的功能选择。16,17.

我们的观察与哈里斯的结论背道而驰。等人...世卫组织设计了两对针对wt-1或mart-1 pmhc的人tcrvα/β对。30...当这些亲和力成熟的结合剂被测试为重建的TCRs或CARS时,TCR版本在这两种情况下都要高出10-100倍。差异的原因仍有待确定,但包括以下可能性:(I)Vα/β相互作用是tcr信号机制的一个关键部分,因此只有Vβ的tcr在tcr敏感性方面被削弱,因为它缺乏Vα;(Ii)hris使用的IL-2表达。等人...与我们在Jurkat实验中所测得的NFAT激活相比,读出有利于TCR信号机制;(Iii)他们使用小鼠T细胞杂交瘤细胞系和小鼠初级T细胞作为效应,以人T2淋巴线作为刺激物,从而产生了一种物种间激活情景,在某种程度上对TCRs敏感;或者,(3)最优TCR功能遵循TCRs的强大功能选择;如果它们起源于物理结合选择,它们缺乏某些功能上选择的TCRs的非凡敏感性特征,相反,它们表现出相当于它们的CAR对应物的灵敏度。

Vβ单用CARS和SvD TCRs在剂量/反应曲线形状方面与TCRs在许多方面有相似的信号行为(如图所示)。4)。然而,它们不像大多数被高度选择或优化的TCRs那么敏感,这些TCR通常是从病人的功能选择的T细胞中获得的,或者是为活性而优化的。16,17,包括我们实验中使用的基准NY-ESO-1 TCR。MAGE-A3-靶向Vβ-模块在Jurkat细胞中表现出高背景(补强信号)和窄的激活窗口(图1)。3, 4C)。请注意,在本研究中使用的Vβ专用模块并不是优化的。敏感性、强化信号和激活窗口是可以通过筛选更多变体(未公布的数据)来优化的属性。例如,其他三个特殊类型(ID#1,2,4)的MAGE-A3Vβ模块显示的补药信号远低于ID#5(补充图5)。S3),这是我们最初选择的进一步研究,因为它的最强的四聚体结合能力(补充图。沙一)。基于对tcrs的广泛研究,我们相信优化Vβ单模块结合的努力将产生更强的受体。31,32,33,34,35...换句话说,在一个只有Vβ的配体结合域中没有什么明显的东西可以阻止它在所有的基本属性上模仿一个天然的TCR。然而,我们承认需要进一步的验证和优化来证明这种技术的实用性超出了它的学术兴趣。

相当大的努力已经针对抗体,以工程师单变量域,以避免第二链的要求。其目的是使配体结合功能更小,更容易从一种分子环境传递到另一种分子环境。天然单域抗体的存在,特别是来自骆驼科(包括骆驼和美洲驼)和软骨类(包括鲨鱼)的抗体的存在,为类似人类领域的工程指明了方向。这些小的系统发育距离较远的单域抗体代表了经典免疫球蛋白折叠的显著变化,其中通常参与与轻链可变区相互作用的表面被cdr 3环的延伸所覆盖,从而形成了更紧密、凸的球状结构。36,37,38...为了使抗体结构产生单链(例如,重链)可变结构域,需要引入大量的氨基酸变异和结构变化,这与它们所产生的双链结构相比,产生的分子更类似于骆驼类单结构域分子。39,40.

虽然我们还没有阐明在这里描述的Vβ仅域的原子结构,但我们强烈怀疑它们也与双链TCR有相当大的偏差。值得注意的是,所有Vβ的唯一结构域都使用Vβ5-8可变基因片段.这种偏差并不是由一个扭曲的tcr输入库来解释的,因为所涉及的V基因片段trb-5-8在hutarg中的存在频率与预期的大致相同。TM诱导TCR重排前的文库(约占V段总数的1%;数据未显示)。它的频率在表达表面TCRs的细胞中增加了大约6倍,这与它可能更容易形成稳定的球状结构域的观点一致。这种可能性得到了建模的支持(如图所示)。2).

Vβ-纯域提供了一个机会,创造双功能的TCR配体结合域,是更小和更可移植的-潜在非常有用的背景下,CAR-T和TCR-T工程。特别是,研究人员创造了双功能汽车,将单链抗体串联成两种不同抗原的直接工程T细胞,例如CD 19和CD 20。23,24...假设这种双重靶向的受体会对肿瘤的复发造成额外的障碍,因为肿瘤必须逃避两个而不是一个T细胞的靶向机制。这类方法也被建议用于汽车,但实现TCR双功能的技术路线则不那么清晰。

我们已经朝着这一目标迈出了重要的一步,证明了V-β-纯域可以与其个体敏感性的轻微下降联系在一起,从而产生小型的、双功能的、基于β的汽车和TCR。原则上,针对不同的pMHCs部署合适的TCRVβ,可以在单个工程T细胞中构建由两个pMHCs激活的杂交分子,既不存在与多个转移亚基错配相关的问题,也不受当前病毒基因转移载体的大小限制。

有趣的是,与单独测试的结合域相比,双功能TCRs显示出更好的功能选择性(如图所示)。5B,d)。特别是,MAGE-A3 SvD TCR在HLA-A2阳性T2细胞中显示了一些非目标激活的证据。然而,在双功能格式中,这种背景几乎消失了。虽然我们对这一变化没有一个简单的解释,但它表明,这种双功能形式至少与稳定的、行为良好的表面受体的产生是相容的,这些受体可以具体地结合配体。

方法

细胞培养

采用Hek-293 T(ATCC CRL-3216™)、Jurkat克隆株E6-1(ATCC TiB-152™)、T2(ATCC CRL-1992™)、SUP-T1(ATCC CRL-1942™)、A 375(ATCC CLR-1619™)和K 562(ATCC CCL-243™)细胞株。用含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM保存Hek-293 T和A 375细胞。将Jurkat和SUP-T1细胞保存在RPMI中,加入10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素。T2细胞在加20%FBS和1%青霉素/链霉素的IMDM中维持。稳定表达单链NY-ESO-1-β的K 562细胞工程2M-HLA-A2三聚体27在添加10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI中产生并维持GFP。细胞在37℃5%CO中孵育2.

质粒构建

所有构造,除了从HuTARG中恢复的Vβ专用池外TM平台(专利WO2017/091905),由金门组装成Plenti主干,其中有一个EF1α启动子。控制车上的ny-eso-1和mag-a3 scfv是使用hutarg从粘合剂屏幕上获得的。TM站台。分别从US8143376B2和W02012054825A1专利中获得对照NY-ESO-1和MAGE-A3 TCRs序列。

胡塔格TM

详情见WW 2017/091905专利。简单地说,HEK293.2sus(ATTCCRL 15733™)细胞被设计成包含β链TCR位点所有未重排的V、D和J片段组合的文库。由于宿主细胞的构建是为了包含一个单一的氧氟沙星整合位点,每个细胞转染后的文库最多包含大约1,800个V-D-J(64×2×14)基因片段中的一个整合拷贝,每个片段两侧都有一个重组信号序列(RSS)。当通过加入激活RAG 1表达的外源诱导剂重新排列时,rsss介导分子内位点特异性重组,从而使细胞群产生大量的tcrβ链,这些链被进一步用于帧内重组体的药物选择;tcrβ链被表达为与普罗霉素抗性基因的融合。这些细胞还包含一个代孕单α链,用于配对和表面表达。

转染

利用Neon转染系统(ThermoFisher Science,Cat)对T细胞进行瞬时转染.没有。(MPK 5000)根据制造商的指示。细胞在1500 V下脉冲3次,宽度为30毫秒。采用Fugene HD转染法(Promega,Cat)对HEK-293 T细胞进行瞬时转染。没有。(E 2311)根据制造商的指示。

FACS分析

转染后18h,用FACS缓冲液(PBS+0.1%BSA)冲洗3次。用与PE-Cy7(LifeTechnologies,Cat)结合的TCRβF1(8A3)抗体孵育细胞。第25576641号,CD3 epsilon抗体与FITC结合,AlexaFluor 647-链霉亲和素(Jackson,Cat)。编号016-600-084)-标记MHC I级A*02:01 SLLMWITQV(NY-ESO),或Alexa Fluor 647-链霉亲和素标记的MHC I类A*02:01 FLWGPRALV(MAGE-A3),在4°C下洗1小时,然后用DAPI或近红外死细胞染色试剂盒试剂(Thermo Fisher,Cat)染色两次。没有。L 34976),并重新悬浮在FACS缓冲液中进行流式细胞仪分析。数据采集采用BD Canto仪器和软件。用FURJO软件对数据进行分析。

同源模型与疏水斑块计算

以MAGE-A3 TCR(TRAV 21/TRBV 5-1家族,PDBID:5 BRZ)的晶体结构为模板,在素同调建模套件(Schr dinger,LLC)中建立了三维结构模型。所有结构都是使用Schr dinger蛋白制备向导编写的。41在进一步计算之前。

利用蛋白质表面分析工具对同源模型表面的疏水斑块和晶体结构进行了计算和可视化,并在Biolumate中实现了这一工具(Schr dinger,LLC)42.

分子动力学模拟

该系统使用Desmond System Builder(Schr dinger,LLC)进行了求解。加入钠离子可中和该体系。所有计算都使用了OPLS3e力场。43...该系统使用Schr dinger包中实现的松弛协议进行平衡。利用Desmond(D.E.Shaw Research)在300 K和1 atm压力下对NPT系综进行了分子动力学模拟。采用可逆参考系统传播算法(RESPA),时间步长为2 PSEC,每6个PSEC计算一次长距离静电相互作用。44...在9A°和光滑粒子网格Ewald(PME)方法中,范德瓦尔斯和短程静电相互作用被切断。45应用于远距离静电相互作用的计算。温度由鼻胡佛链恒温器控制。46压力由Martyna-Tobias-Klein气压调节器控制。47...用最后一帧作为象限P 5000 GPU卡上的初始坐标,每1.2 ps保存一次坐标,进行三次模拟。

NFAT荧光素酶分析

NY-ESO-1肽(SLLMWITQV),是天然肽的一个变体,其第9位的半胱氨酸突变为Valine。48,用Genscript(Piscataway,NJ)合成了MAGE-A3肽(FLWGPRALV)。目的肽从100μM开始连续稀释3倍,在RPMI中加载到10,000个T2细胞上,加1%BSA和0.1%青霉素/链霉素。18小时后,12,000转染nFAT荧光素酶报告基因的Jurkat细胞重新悬浮于rpmi/10%fbs/0.1%青霉素/链霉素中,加入多肽负载的T2细胞中。共培养6小时,置于37℃,一步荧光素酶检测系统(BPS Cat)。根据制造商的指示,在100 ms的微板光度计上读取发光。每个实验一式两份。

原发性T细胞转导与活化

从ALSTEM中获得外周血单个核细胞(PBMCs)和慢病毒。根据制造商在X-体内培养基中的指示,用人T细胞处理™激活PBMC.在细胞内直接加入慢病毒10,在含1%人血清、0.1%青霉素/链霉素、10 ng/ml IL-15和10 ng/ml IL-21的X-体内培养基中扩增原代T细胞。在检测前,细胞静置48小时,不受刺激或细胞因子的影响。

细胞毒性及干扰素γ检测

转染A 375细胞核定位GFP(IncuCyte NucleLight Green),筛选出稳定整合的A 375细胞。用10μM的NY-ESO-1或MAGE-A3肽接种5000株A 375细胞。18小时后,用10μg/ml丝裂霉素C处理细胞1h,冲洗3次。在37°C和5%CO条件下,用IncuCyte S3活细胞分析系统(Essen生物科学)增加了5000个转导T细胞(根据四聚体染色法测定的转导百分率),并对其进行了监测。2...每两个小时用10X目标拍摄一次42小时的图像。每个时间点的绿色面积被归一化为时间为零,以测量活目标细胞的损失。实验一式两份。

细胞毒性试验共培养24小时取上清液.根据制造商的指示,采用BD细胞计量型微珠阵列系统测定干扰素γ水平。

统计分析

对于所有的数据比较,学生的t测试是使用GraphPad Prism软件进行的。欧共体50用非线性回归法拟合肽浓度依赖的NFAT-荧光素酶读数。




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