化疗后ctDNA变化对转移性结直肠癌（mCRC）患者临床结局的影响尚不清楚。本研究评估了ctDNA水平的早期变化作为接受化疗的mCRC患者客观反应和临床结局的预测指标的临床意义。我们调查了二线化疗开始后2周和8周后ctDNA水平的前后比对客观反应率（ORR），无进展生存期（PFS）和总体生存期（OS）的影响。使用基于扩增子的深度测序检测ctDNA，该分子条形码包含14个与结肠癌相关的基因中> 240个热点突变的分子条形码。在多变量分析中，与基线相比，化疗开始后8周ctDNA水平较低（≤50％）的患者与ctDNA水平较高（> 50％）的患者相比，其PFS和OS明显更长。在达到部分缓解或疾病稳定的患者中，化疗开始后8周ctDNA水平的前后比显着低于进行性疾病患者。本研究表明，ctDNA水平的早期改变可能是预测mCRC患者化疗疗效和临床结果的生物标志物。

液体活检是检测癌症患者血浆中的肿瘤相关突变的非侵入性方法1，2，3。它使循环肿瘤细胞，循环无细胞DNA（cfDNA）的分析，并从肿瘤细胞分泌的外来体4，5，6。相比于组织活检，活检液体涉及对患者最小的程序的风险和较便宜1，5。此外，它有利于癌症和肿瘤复发的检测早期诊断，作为用于组织检查的替代品，并且能够有效地监测和化疗耐药性的早期效应5，6。如在该测序技术检测和量化的癌症相关的基因组的变体在cfDNA近期进步的结果，在循环肿瘤DNA（小牛胸腺DNA）的研究正在迅速增加7，8。cfDNA从经历凋亡或坏死健康，发炎，组织和癌组织释放2，5。叶绿体DNA是cfDNA的一小部分，从肿瘤细胞起源，通常特征在于体细胞变体的存在2，5。美国食品和药品监督管理局批准的cobas表皮生长因子受体（EGFR）突变v2的测试，以确定患者的非小细胞肺癌患者血浆中的T790M突变9，10。然而，没有可靠的基因组测试，以指导治疗转移性结直肠癌（mCRC的）的治疗决定在目前的临床实践11，12，13。一些研究报道RAS使用数字PCR（DPCR）及其可能的临床意义在结肠癌患者中cfDNA突变14，15，16。以前的研究表明，基于扩增子的下一代测序（NGS）用分子条形码检测血浆中的多个突变维持灵敏度可比DPCR 17，18。也有人报告说，叶绿体DNA水平化疗过程中改变，并通过计算机断层扫描（CT）所证实之前的肿瘤标记物的水平或疾病进展的高度的增加注意到5，19。然而，只有少数的研究发现和生存在转移性结直肠癌患者谁接受化疗（这是由深度测序方法采用与分子条形码基于扩增子检测NGS）的叶绿体DNA的早期变化之间的相关性，20，21。此外，由于二线化疗的反应率很可能低于一线化疗，因此，开发新的替代肿瘤的临床反应（生存）替代指标（除肿瘤缩小以外）对于提供重要意义mCRC患者具有有效的二线化疗。在本研究中，我们旨在研究具有NGS的深度测序系统在mCRC患者中ctDNA的早期反应与化疗后临床反应之间的相关性，并评估ctDNA的反应可能减轻临床决策过程。

患者特征

为了检测血浆中的ctDNA，我们招募了接受二线化疗的29名mCRC患者。表1总结了这29例mCRC患者的特征   。他们在招募时的中位年龄为57岁（39-76岁）。在这29位患者中，有14位是男性（48.3％）。肝是最常见的转移部位（93.1％），其次是肺（48.3％），腹膜（31.0％）和淋巴结（24.1％）。十名患者（34.5％）在其肿瘤组织中带有野生型RAS，其中有6名（20.7％）患者在血液样本采集前接受了抗EGFR抗体治疗（表   1）。

检测血浆中的体细胞突变

在该研究招募的29名患者中，在26名（89.7％）患有以下疾病的患者中检出了8个大肠癌相关基因（KRAS，TP53，APC，PIK3CA，SMAD4，FBXW7，NRAS和MAP2K1）中的一个或多个体细胞突变。mCRC，而在其余6个基因（AKT1，BRAF，CTNNB1，EGFR，ERBB2和GNAS）中未检测到突变。在突变KRAS，TP53和APC基线时分别在20例（69.0％），13例（44.8％）和6例（20.7％）患者中检出（图   1）。PIK3CA和SMAD4也分别在5位（17.2％）和3位（10.3％）患者中频繁突变（图   1）。与其他基因相比，FBXW7（6.9％），NRAS（3.4％）和MAP2K1（3.4％）的突变较少见（占患者的10％）（图   1）。

转移性结直肠癌（mCRC）患者的无细胞DNA（cfDNA）中的突变等位基因频率。29名mCRC患者血浆中检测到的突变的基因组格局。显示了在29位患者中检测到的8个基因中突变等位基因的数量和频率。灰色面板，未检测到突变；白色面板，未经测试。

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二线化疗后ctDNA水平的早期变化与临床结局之间的关联

为了评估化疗后mCRC患者ctDNA水平早期变化的临床意义，我们调查了二线化疗开始后2周和8周ctDNA水平与无进展生存期（PFS）和总体生存（OS）。化疗开始后第2周（ctDNA中位水平，6.8％;范围，0％至65.1％）和第8周（ctDNA中位水平，3.8％;范围，0％至72.7％）的ctDNA水平可能较低比基线（中值水平叶绿体DNA，17.8％;范围，0.17％至78.1％）。如图1所示   2A（2周VS基线; P  = 0.09，8周VS基线; P = 0.20）。化疗前后患有进行性疾病（PD）和部分反应（PR）或稳定疾病（SD）的患者ctDNA水平的变化如图2B所示   。

二线化疗治疗的mCRC患者ctDNA水平的变化。所有患者（A）和PD，SD或PR （B）患者在基线，开始二线化疗后2周和8周时的ctDNA分析。通过CT图像评估治疗反应。

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Kaplan-Meier估计表明，化疗开始后2周ctDNA水平前后比≤50％的患者的PFS明显大于50％以上的患者（中位PFS：5.8与3.3个月； HR，0.33 ； 95％CI，0.10-1.04；P  = 0.04，中位OS：NA vs 7.8个月； HR，0.30； 95％CI，0.07-1.29；P  = 0.08，图   3A，B）。同样，在化疗开始后8周ctDNA水平前后比≤50％的患者，PFS和OS明显高于> 50％的患者（中位PFS：5.6 vs 2.1个月； HR，0.16； 95％ CI，0.06-0.46；P  = 0.0001，图   3C，中位OS：14.1 vs 8.1个月； HR，0.10； 95％CI，0.02-0.52；P = 0.001；图   3D）。为了评估mCRC二线化疗期间ctDNA绝对计数变化的临床有效性，我们使用ctDNA绝对计数进一步估算了PFS和OS的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier估计表明，在开始化疗后2周绝对ctDNA绝对计数比之前/之后≤50％的患者与> 50％的患者之间，PFS和OS均无显着差异（补充图   1A， B）。另一方面，在化疗开始后8周后显示ctDNA绝对计数比之前/之后≤50％的患者，其PFS和OS明显长于50％以上的患者（中位PFS：5.8与2.1个月； HR，0.18 ; 95％CI，0.07-0.49; P  = 0.0002，补充图 1C和OS中位数：NA vs 9.6个月；HR，0.17；95％CI，0.03-0.81；P  = 0.01；补充图   1D）。此外，我们使用由接收者工作特征曲线计算出的ctDNA水平后/前比率的最佳截止值评估了PFS和OS的Kaplan-Meier曲线。ctDNA水平前后比率的临界值为84.1％，可以在2周内实现最佳分层，灵敏度为42.9％，特异性为91.7％（AUC，0.67； 95％CI，0.41-0.93）和39.4在第8周时的％，敏感性为90.0％，特异性为75.0％（AUC，0.83； 95％CI，0.67-0.99）。Kaplan-Meier估计表明，开始化疗后2周ctDNA水平前后≤84.1％的患者的PFS明显高于> 84.1％的患者（中位PFS：5.6 vs 2.1个月； HR，0.28） ; 95％CI，0.09-0.95; P = 0.029，中位数操作系统：NA vs 7.5个月；HR，0.14；95％CI，0.03-0.72；P  ＝ 0.006，补充图   2A，B）。同样，开始化疗后8周ctDNA水平前后比≤39.4％的患者，PFS和OS显着高于> 39.4％的患者（中位PFS：5.8 vs 2.1个月； HR，0.15； 95％ CI，0.05-0.43；P  = 0.00006，补充图   2C，中位OS：NA vs 9.6个月； HR，0.10； 95％CI，0.02-0.53；P  = 0.001；补充图   2D）。

Kaplan-Meier对二线化疗治疗的mCRC患者的ctDNA水平的PFS和OS进行了估计。在开始二线化疗后2周，ctDNA水平大于50％且小于等于50％的患者中PFS （A）和OS （B）的比较。在开始二线化疗后8周，ctDNA水平大于50％且小于等于50％的患者中PFS（C）和OS（D）的比较。使用对数秩检验计算P值。

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在单变量Cox比例风险分析中，在8周后，原发肿瘤位置，肺转移，ctDNA水平的变化（ctDNA水平的比率之前/之后），CEA和CA19-9的水平（CEA和CA19-9比率之后/之前）开始化疗是PFS的预测因素（表   2）。同样，化疗开始8周后ctDNA水平和CA19-9水平的变化是OS的预测因素（表   2）。在多变量分析中，化疗开始后8周ctDNA水平的变化是PFS（HR，0.17； 95％CI，0.06-0.47；P  = 0.0006；表2）和OS（HR，0.10；P =   0.000）的预测因素。 95％CI，0.02-0.52；P  = 0.006；表   2）。

化疗后ctDNA的早期变化与治疗反应之间的关系

接下来，我们分析了mCRC患者开始二线化疗后2周和8周，客观反应与ctDNA水平变化之间的关联。客观缓解率（ORR）和疾病控制率（DCR）分别为6.9％和55.2％（2 PR和14 SD）。尽管PD组和SD组或PR组之间在开始化疗后2周ctDNA水平没有显着差异，但达到SD或PR组的患者在开始化疗后8周的ctDNA水平显着低于PD组（2周：P  = 0.25，8周：P  = 0.006，图   4A）。此外，与化疗后> 50％的患者相比，化疗开始后8周后ctDNA水平的比率≤50％的患者表现出更好的客观反应（P  = 0.003，表   3）。在开始二线化疗后8周，ctDNA水平的变化与肿瘤缩小显着相关（r = 0.52，P  = 0.006，图   4B）。这些结果表明，ctDNA可以作为预测mCRC患者二线化疗预后的生物标志物。

化疗后ctDNA反应与临床反应之间的关联。（A）在接受二线化疗的mCRC患者中，ctDNA应答（在开始化疗后8周ctDNA水平比率之前/之后）与客观应答显着相关（P  = 0.006）。（B）化疗开始后8周ctDNA反应与肿瘤缩小率密切相关（r = 0.52，P  = 0.006）。通过Spearman相关法计算P值并进行线性回归。

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本研究表明，在接受二线化疗的mCRC患者中，ctDNA水平的早期变化与ORR，PFS和OS之间存在显着关联。化疗开始后2周和8周，ctDNA水平下降至≤50％的mCRC患者表现出对化疗的较好反应。以前的报道表明，早期肿瘤收缩率（ETS）是在转移性结直肠癌的患者的治疗效果的关键的早期预测器，尤其是在那些具有分子靶向药物治疗22，23，24。在这里， 单因素分析显示，化疗开始后2周ctDNA水平的变化可能是PFS的预测指标（HR，0.33； 95％CI，0.10–1.04；P = 0.059；表   2）。此外，化疗开始后第8周ctDNA水平的变化是PFS的独立预测因子（HR，0.17； 95％CI，0.06-0.47；P  = 0.0006，多变量分析；表   2）和OS（HR，0.10）。 ，在多变量分析中为95％CI，0.02-0.52；P  =  0.006；表   2）。另一方面，在本研究中，ETS定义为与基线（≥20％肿瘤缩小）相比，第8周肿瘤最长直径的总和的相对变化，但它并不是PFS的重要预测指标（ HR，0.17； 95％CI，0.02-1.33；P  = 0.09，单变量分析；表   2）或OS（HR，0.48； 95％CI，0.15-1.54；P 在单变量分析中= 0.22; 表   2）在我们的研究中。我们的数据表明后/前后二线化疗的叶绿体DNA水平的比率可以是化学治疗功效比ETS一个更好的预测在转移性结直肠癌的患者20，25。

肿瘤标志物诸如CEA和CA19-9被广泛用于监测化疗期间的mCRC的肿瘤负荷和进展26，27。以前的报告中指出，CEA水平和存活患者负相关接受化疗和抗EGFR的结合抑制剂28，29。在我们的研究中，单因素分析和对数秩检验表明，在化疗开始后8周，显示CEA和CA19-9水平的前后比率降低的mCRC患者与PFS呈负相关（CEA：HR，0.37； 95％ CI，0.14-0.96；P 单变量  = 0.036，P 对数秩  = 0.03，CA19-9：HR，0.31； 95％CI，0.10-0.99；P 单变量 = 0.049，P log-rank  = 0.04；表   2和补充图   3A，C）。此外，在化疗开始8周后表现出较低的CA19-9前后比率的mCRC患者与OS呈负相关（HR，0.07； 95％CI，0.01-0.49；P 单变量  = 0.006，P log-等级  ＝ 0.0005；表   2和补充图   3D）。然而，第8周时ctDNA水平的变化（比率前后）仍然是PFS（P  = 0.0006；表   2）和OS（P  = 0.006；表   2）的独立指标。）进行多元分析。据报道，在完成第一个化疗周期后，ctDNA的变化可能是对化疗反应的成功预测指标，而CEA不能作为预测指标[ 20]。总的来说，这些发现表明，ctDNA可以作为早期治疗反应的可靠预测生物标记。有必要进行深入研究，以进一步确立ctDNA作为mCRC患者对化疗反应的预测标志物的关键作用。

本次调查的样本量很小。此外，在患有CRC在我们的研究是与那些在组织DNA不一致叶绿体DNA突变的基因的频率报告了突变数据库，包括癌症基因组图谱（TCGA）30，31。所述的突变频率APC在CRC组织中的基因已被报道为〜80％30，32。但是，我们在血浆中仅观察到20.7％的频率，该频率明显低于以前在组织中报道的频率33。这种不一致可能部分是由于APC中突变的覆盖范围不足该研究中使用的基因组可以保证的基因。进一步检测突变检测系统中其他突变和基因重排的技术改进，可以提高mCRC患者血浆中突变检测的敏感性。

总之，我们发现在接受化疗的mCRC患者中，ctDNA水平的早期变化代表了治疗反应的高度敏感的早期预测指标20。未来应进行大样本的前瞻性临床试验，以验证ctDNA变化的临床影响，并支持其作为对二线化疗反应的新型早期预测生物标记物的应用。

耐心

这项研究旨在研究二线化疗治疗的mCRC患者早期ctDNA反应与PFS，OS，ORR的相关性（表   1）。自2017年2月至2018年3月，在日本癌症研究基金会癌症研究所医院接受二线化学疗法治疗的29例mCRC患者前瞻性纳入本研究。使用TNM恶性肿瘤分类（第7版）确定肿瘤和淋巴结的状态。本研究得到了日本癌症研究基金会（日本东京，机构注册号：2017-1009）的机构审查委员会的批准。所有患者均获得书面知情同意书以使用血浆和组织样本。所有方法均根据赫尔辛基宣言进行。

血液样本，ctDNA分离和测序

按照制造商的说明将血样收集在EDTA管中。采集血样的时间点刚好在二线化疗开始之前以及二线化疗开始之后的2周和8周。通过在4°C下以1600 g离心10分钟获得血液中的血浆，然后在4°C下以16,000 g离心  10分钟以去除细胞碎片。使用MagMAX cfDNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国），按照制造商的说明从2 mL血浆中提取cfDNA。如先前所述进行文库的制备和质量控制，模板制备和测序34。十四个基因具有> 240个热点（单核苷酸变体和短插入缺失），包括AKT1，BRAF，CTNNB1，EGFR，ERBB2，FBXW7，GNAS，KRAS，MAP2K1，NRAS，PIK3CA，SMAD4，TP53和APC都淹没在该测定中34，35。干净的读数被映射到人类参考基因组（hg19）序列。使用Torrent Variant Caller筛选并调用每个基因的目标区域中的突变34，35。在这项研究中，每个变体的检出限为0.15％。血浆中的ctDNA水平定义为当检测到两个或更多突变时，每个患者在每个时间点检测到的突变等位基因的最高等位基因频率。

肿瘤组织DNA测序

基因组DNA从来自活组织检查或手术切除获得的固定的石蜡包埋的组织如先前所描述提取36，37。对于组织KRAS和NRAS测试，使用了RASKET KIT（日本MBL），该试剂盒按照制造商的规程应用了聚合酶链反应-逆序列特异性寡核苷酸方法（PCR-rSSO）。我们检查12个突变RAS外显子2，八在RAS的外显子3和4在RAS使用的Luminex 100/200（Luminex公司，日本）和UniMAG（MBL，日本）如先前所描述的系统外显子4 38，39。

统计分析和肿瘤评估

使用RECIST指南1.1版通过CT成像评估肿瘤反应。PFS定义为从第二线治疗的第一天到疾病进展或因任何原因死亡的第一客观证据的时间。OS定义为从第二线治疗的第一天到死亡的时间。使用Kaplan-Meier方法评估PFS和OS，并使用对数秩检验评估临床结果与临床参数（ctDNA，CEA和CA19-9水平）之间相关性的统计学显着性。ORR表示对二线化疗完全缓解或PR的患者比例，DCR表示对疗法完全缓解或PR或SD的患者比例40。ETS是在肿瘤的最长直径的总和在第8周的相对变化与基线相比，（≥20％的肿瘤缩小）24，41。统计检验提供了两个方面的P值，并且P  <0.05被认为是显着的。在Cox比例风险分析中， 单变量分析中P <0.05的因素包括在多变量分析中（后退逐步方法）。使用基于R and R commander 42的统计软件“ EZR”（Easy R）进行了统计分析。