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MUC5B粘蛋白聚合物主要由重复的结构基序控制,其拓扑结构受钙和pH值的调节

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发表时间:2019-11-25 15:35作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

MUC5B粘蛋白聚合物主要由重复的结构基序控制,其拓扑结构受钙和pH值的调节

聚合粘蛋白MUC5B提供了呼吸粘液的结构和功能框架,将粘弹性和抗菌性能赋予了这一重要的保护性屏障。虽然已确定MUC5B形成二硫键连接的线性聚合物,但这与它们在分泌性颗粒中的包装及其在粘液中的分子形式的关系如何仍待充分阐明。此外,未完全描述中央重度O-糖基化的粘蛋白域在MUC5B构象中的作用。在这里,我们已经完成了对从唾液中纯化的天然MUC5B聚合物的详细结构分析,随后研究了钙浓度和pH的变化如何对MUC5B构象产生影响,钙蛋白和pH的变化是粘蛋白颗粒内包装和分泌后膨胀的重要因素。结果表明,MUC5B具有沿聚合物轴重复的珠状结构,并表明这些重复的基序来自不同的糖基化模式。此外,我们证明了这些高度纠缠的线性聚合物的构象对钙浓度和pH值变化敏感。在钙(钙2+,10 mM)在pH 5.0时,MUC5B采用紧密构象,在用EGTA去除钙后或通过将pH升高至7.4失去。这些结果表明粘蛋白崩溃的途径使细胞内包装和分泌后驱动粘蛋白扩展的机制成为可能。他们还指出了在粘蛋白生物合成和分泌的不同阶段以及产生正确的粘液屏障特性的过程中严格控制钙和pH的重要性。

介绍

粘液是一种复杂而动态的水凝胶,位于粘膜上皮细胞的内腔表面,可作为防止病原体和其他外来侵害的屏障。粘液层具有高度适应性,可应对上皮表面经历的多种不同损伤。这样,这些屏障是由组织特异性分泌物形成的,并且针对局部环境和每个粘膜表面1面临的独特挑战而定制在疾病状态如囊性纤维化(CF),增加的粘液浓度导致高度粘合剂和阻塞性粘液层的形成23另外,气道表面液中离子含量的变化也可能是影响分泌后粘蛋白膨胀4从而改善粘液特性的因素CF进展过程中发生在黏液屏障中的大分子变化尚未完全阐明,并且需要深入了解黏蛋白和黏液结构及其与功能的关系。

形成聚合物凝胶的粘蛋白MUC5B和MUC5AC形成气道粘液屏障的结构骨架。这些大的糖蛋白以网状形式排列,提供了粘液层5的凝胶状特性由于由O-连接的聚糖链赋予的生物物理限制,粘蛋白形成长的线状结构,O-连接的聚糖链修饰了蛋白质的中心区域。这些聚糖链代表蛋白质的主要生物活性区域,并且可以动作以维持上皮片水合,防止感染,以及用于其它分泌的分子提供附着的节点167

MUC5B是有效的粘液纤毛清除必需8,并且是通过由二硫键介导的C端二聚化和N-末端多聚化形成的线性聚合物910电子显微镜(EM),原子力显微镜(AFM),小角X射线散射(SAXS)和小角中子散射(SANS)等结构技术为粘蛋白聚合物拓扑学提供了新的见解,并高度强调了所述糖基化粘蛋白结构域的伸展构象111213虽然EM和SAXS MUC5B N-和C-末端结构域的分析已经证明了它们的球状性质914此外,通过使用尖端增强拉曼光谱技术,戴维斯及其同事已经证明,在MUC5B聚合物中发现的球状结构域以β-折叠结构为主,而糖基化的粘蛋白结构域则保持无序15

最近的证据表明,分泌后粘膜下腺衍生的MUC5B作为称为粘蛋白束的复杂高阶结构的一部分存在16据信这些结构许多相互作用粘蛋白聚合物以形成并在粘蛋白网状组织代表一种新概念1718,但是机械细节托换它们的形成有待阐明。MUC5B的超分子拓扑结构的变化在分泌后扩张和颗粒内包装过程中都很重要。甲降低的pH和增加钙浓度,提出了通过N末端多聚体的形成,以驱动粘蛋白缩合919这种压实对于将MUC5B有序包装到分泌颗粒20的范围内是必不可少的,但是由于分泌后粘蛋白的异常展开,会导致CF中的粘膜粘液病21尽管最近从使用重组粘蛋白蛋白质的研究取得了这些进展914,它仍然不清楚如何全长粘蛋白聚合物是通过在钙变化的影响2+浓度和pH。这些知识对于获得对粘蛋白包装/拆包的更完整的了解非常重要。

在这里,结合使用透射电镜(TEM)和定向单颗粒分析,我们对MUC5B总体架构进行了结构分析。这使我们能够确定MUC5B聚合物内的不同基序和特征,直到最近才认为它们是高度无序且无结构的大分子。此外,近来已经使用重组表达的蛋白质的Ca所示2+在调节的MUC5B N-和C-末端结构域的非共价组件的形成中起关键作用914然而,钙如何影响MUC5B聚合物的结构仍不清楚。因此,我们在有钙或无钙的情况下进行了MUC5B聚合物的结构比较,确定了MUC5B拓扑结构的显着全局变化,从而证明了钙是粘蛋白网络组织的关键介体。

结果

折叠的蛋白质结构域赋予MUC5B结构弹性,导致形成高度柔性的大分子

据公认,MUC5B形成高分子量,线型聚合物2223,但是,MUC5B的建筑特色保持不明确的。为了评估其超分子拓扑,我们使用TEM观察了MUC5B的聚合形式,单体形式(还原和羧甲基化)和糖肽形式(还原和羧甲基化,然后经胰蛋白酶处理)(图   1A))。在负染色过程中,聚合物被嵌入重金属离子层中,该重金属离子与电子束强烈相互作用。由于MUC5B是一种薄的糖基化多肽,而且这种类型的大分子对比度差,因此形成的污渍排除模式(因此为阴性染色)使我们能够以低温成像无法观察到的分子整体结构。

图1
图1

MUC5B具有相当大的结构灵活性。A)突出显示MUC5B大分子结构成分的卡通。B)通过TEM观察5μg/ ml的天然纯化的MUC5B聚合物。C)将5μg/ ml的MUC5B还原并羧甲基化以产生MUC5B单体,其随后通过TEM可视化。D)将5μg/ ml的MUC5B还原,羧甲基化并用胰蛋白酶处理以产生MUC5B粘蛋白域“糖肽”。其结构通过TEM成像。代表性图像显示在BD中,比例尺为200 nm。E)在TEM可视化之后,测量MUC5B聚合物,单体和糖肽的轮廓长度。F)MUC5B及其组成部分的持续长度通过测量端至端的距离(R)的一个函数的均方确定(沿链轮廓的两个不同点之间的距离)。G)MUC5B轮廓长度走线。每个分子的初始切线在0 nm处对齐,以实现不同结构的可视化。

MUC5B聚合物,单体和糖肽显示出高度柔性和纠缠的结构,表现为线性大分子。正如预期的那样,MUC5B在大小上表现出明显的异质性,聚合物平均长度为10.7±1.6μm(范围为4–20μm),单体平均长度为671±11 nm(范围为579–752 nm),糖肽平均范围为130长度为±6 nm(介于105–308 nm之间)(图   1B–E)。

粘蛋白分泌后经历的戏剧性结构转变要求聚合物表现为高度柔性的分子12这种固有的灵活性使粘蛋白在结构上适应环境的变化,这是形成功能性粘液屏障的重要因素。最近,Georgiades及其同事证明了MUC5AC和MUC2聚合物的结构灵活性,并报道了粘蛋白的持续长度在8–10 nm之间13尽管这说明了粘蛋白聚合物内的高柔韧性,但对于各个亚结构域如何促进这种结构柔韧性仍不清楚。我们使用TEM测量了MUC5B聚合物,单体和糖肽的持久性长度,试图定义如何赋予MUC5B柔韧性。持久长度定义了聚合物的刚度:如果持久长度大大小于聚合物轮廓长度的长度,则认为分子是柔性的,持久长度越短表示聚合物越柔软24发现还原的单体MUC5B是最灵活的分子,其持久长度为7±2 nm。有趣的是,MUC5B糖肽表现出最高的持久性长度(18±4 nm),而聚合的MUC5B表现出15±1 nm的持久性长度,因此表明糖基化粘蛋白结构域(此处称为糖肽)代表了MUC5B分子最不灵活的区域(图   1F–G)。与单体MUC5B聚合物相比,单体MUC5B的持久性长度较低,这可以通过还原过程来解释,这导致了球形蛋白结构域(N和C端结构域以及内部富含半胱氨酸的结构域(图   1A))的展开和增加了灵活性。

虽然EM已被用作一种用于确定生物聚合物的持续长度的存在与使用这种技术潜在的局限性2526例如,动态3D分子的2D表示可能会受到各种形式的MUC5B(聚合物,还原的单体和糖肽)与EM网格的差异相互作用的影响,例如,聚合物和还原的单体中蛋白质区域的比例较高增强与表面的附着力。但是,对于被分析的3个物种,其附着在网格上的可能性可能相当,因为它们都具有主要的糖基化结构域,并且它们都以与其大分子特性相对应的方式出现扩展(即具有不同长度的柔性线状分子)(图。 1B–E))。结果还显示出一致的行为,表明与网格的绑定具有可重现的模式。此外,持续长度测量为MUC5B聚合物比得上那些在其他研究中通过任AFM或SANS调查任MUC5AC或MUC2粘蛋白聚合物报道,从而突出聚合粘蛋白的内在灵活性1213

这些结果共同表明,MUC5B中的蛋白质球状结构域负责赋予聚合物以柔韧性,富含聚糖的粘蛋白结构域形成了相当硬的区域。

MUC5B粘蛋白结构域包含不同的结构基序

通过最近的单粒子EM和拉曼光谱分析,出现了更详细的MUC5B拓扑图,其中,由无序蛋白骨架组成的无序蛋白骨架组成的粘蛋白域将高序球形N和C末端域打孔915粘蛋白结构域充当重度O-糖基化的位点,尚不清楚是否可以将某些结构赋予聚合物。为了研究全长粘蛋白内的结构域结构,进行了单颗粒EM分析,由此我们能够沿着MUC5B聚合物绘制结构基序。

为了在结构上定义粘蛋白聚合物内存在的基序,对MUC5B进行了负染色并通过TEM进行了成像,并收集了约200张显微照片。通过使用EMAN2.1软件,使用重叠的45×45 nm盒子来挑选覆盖MUC5B聚合物全长的颗粒(图   2A)。选择具有最小重叠的盒子,并手动选择每个区域,以使直纤维区域位于每个盒子的中心。未选择弯曲严重或染色不良的区域27经过10轮迭代分析后,从约9000个粒子中生成了五十个类的参考自由类平均值(图   2B,C)。从这些类别平均值中观察到了明显的结构基序,代表了MUC5B中的球形和糖基化结构域。由串珠形拓扑组成的类最常见。这些区域在原始数据中显而易见,但在求平均值后会更清晰地定义。这些直径约5 nm的珠粒具有明显的周期性,并且发现在整个聚合物中重复出现。

图2
图2

MUC5B包含重复的结构基序。A)使用TEM使MUC5B聚合物成像。使用45×45 nm框选择并隔离图像上沿聚合物轴的区域,生成约9000个粒子集,将其进行迭代的比对和分类平均(使用EMAN2 44)。比例尺:100 nm。其代表性的颗粒显示在(B)中。C)产生五十个类别平均值以突出发现在整个聚合物中重复的不同基序。

为了定义这些结构基序在MUC5B聚合物中的位置,我们对MUC5B进行了还原和烷基化,然后进行了胰蛋白酶消化,从而将糖基化的粘蛋白结构域与聚合物的``裸露''球状区域隔离开来,该区域被该处理破坏了。然后将这些糖肽进行负染色并通过TEM成像。再次使用45×45 nm盒,采用相同的策略,选择了约6000个颗粒,从而覆盖了MUC5B粘蛋白结构域的全长。从这些粒子中产生了五十个等级的平均值(图   3A))。在大多数类别中都观察到串珠的图案,范围在4-7 nm之间。随后使用SPIDER软件生成MUC5B糖肽的3-D模型。看到MUC5B粘蛋白结构域由重复的珠状拓扑组成,其中“珠”形成直径约5nm的球状结构(图   3B)。

图3
图3

MUC5B糖肽形成重复的串珠结构。A)通过TEM观察MUC5B糖肽,将单个糖肽分子的单个颗粒装箱(45×45 nm盒),并进行反复的比对和类平均。B)MUC5B粘蛋白结构域的3-D重建。颗粒从对准糖肽纤维被重建为使用单个粒子重建方法(使用FindEM和信息平台的3D模型之前提取的3940)。比例尺:5 nm。C)序列徽标,突出了MUC5B共有重复序列中氨基酸的保守性。这些重复序列主要由丝氨酸和苏氨酸残基(以绿色显示)占主导,它们代表表征粘蛋白结构域的O-连接聚糖的位点。破坏这些糖基化位点的主要是疏水性氨基酸(以黑色/蓝色/紫色显示)。

最近的结构研究表明,MUC5B粘蛋白域以无序构象存在。尽管有这种紊乱,但据信衍生自糖基化区域的结构模式会在粘蛋白骨架15上赋予某些结构我们在此呈现的珠状拓扑结构代表沿粘蛋白结构域的这些糖基化模式是可行的。为了对此进行研究,我们对MUC5B粘蛋白结构域进行了序列分析研究。使用RADAR软件,我们鉴定了MUC5B中央糖基化结构域中存在的72个重复序列。然后使用WebLogo 3.4软件对这72个重复序列进行比对和分析,以创建代表MUC5B共有序列的序列徽标(图   3C))。徽标由30个氨基酸序列组成,该序列在整个MUC5B粘蛋白结构域中重复,并为我们提供了有关这些区域内氨基酸保守性的详细信息。最近一项对来自聚集蛋白聚糖(含软骨素的蛋白聚糖)的O-聚糖附着区的内在无序肽的研究表明,当未糖基化时,这些分子包含半规整的结构,每单位长度质量为770 Da nm -1糖基化后(〜620 Da nm -1减少了25%假设氨基酸的平均质量为100 Da,则相当于每nm〜6个氨基酸28因此,令人鼓舞的是,假设这里报道的5 nm珠结构代表单个30个氨基酸重复,也许非糖基化的PPVL序列在珠之间形成连接区。

这些结果共同为MUC5B拓扑结构提供了新的结构见解,并表明在糖基化的粘蛋白结构域内发现了不同的结构基序,以前认为这些结构基序由无序随机线圈组成。

钙是MUC5B网络拓扑的关键调节器

钙最近已经显示出介导的同型MUC5B N-末端结构域相互作用的形成,和异型N-和其被认为以驱动所必需的构象压实变化到颗粒C末端结构域相互作用91419然而,在这些研究中使用重组表达的结构域尚不清楚钙如何在结构上影响全长聚合MUC5B。为了研究钙和pH如何影响粘蛋白的结构,我们通过TEM在变化的pH和钙浓度下观察了MUC5B,并评估了大分子构象的变化。

将MUC5B置于低pH,高钙环境(pH 5.0,10 mM Ca 2 +)下。在这些条件下,MUC5B形成了高度缩合的结构,聚合物以紧凑单元的形式出现,各个链彼此之间没有区别。在许多情况下,这些结构的中心区域包含致密的材料,该材料由围绕其排列聚合物链的节点组成(图   4A)。通过在pH 7.4下用10 mM EGTA处理钙,这些结构在钙螯合后显着反转。在不存在钙的情况下,MUC5B表现为线性化的单个纤维,导致开放和扩展的粘蛋白网络(图   4B)。

图4
图4

钙促进MUC5B缩合。AF)未经TEM处理(pH 7.4或pH 5.0)或与10 mM Ca 2+或10 mM EGTA 孵育后,通过TEM观察5 µg / ml天然纯化的MUC5B G)可视化的分子(来自每种处理的30个)被分类为3个缩合,扩展或线性化的类别,最能描述它们的外观。

为了进一步评估钙在定义粘蛋白结构中的作用,我们在不改变MUC5B样品钙浓度的情况下改变了pH值。在pH 5.0下,粘蛋白形成冷凝结构(图   4C);然而,这些分子没有形成在pH 5.0的10 mM钙存在下所见的独特结构,而这些结构中没有中央节点区域。相反,在pH 7.4下,MUC5B表现为聚合物的线性网络,但是,在pH 7.4下用10 mM EGTA处理后,未观察到MUC5B的拉直外观,这些分子采用更纠缠的构象(图   4D)。

为了剖析钙和pH对MUC5B结构的独立影响,我们在pH 7.4的10 mM钙和pH5.0的EGTA存在下对MUC5B进行了成像。在这两种条件下,MUC5B都形成相似的结构,但是与EGTA pH 5.0处理的分子(图4F相比,在存在pH 7.4的钙(图4E)的情况下,聚合物的密度稍高一些   (图4F。   可以影响粘蛋白的构象,但是一起对大分子结构具有主要的协同作用。

Kesimer和同事以前曾利用电子显微镜技术将MUC5B在分泌后成熟的不同阶段可视化,从而允许根据构象差异对这些分子进行分类20在这里,我们使用了类似的分类方法将MUC5B聚合物分类为缩合(例如,图   4A,C),缠结(例如,图   4D–F)或线性化(例如,图   4B),从而可以量化上面突出显示的结构差异(图5。   4G)。

由于钙和pH值对MUC5B结构的增强作用,我们决定集中精力研究钙和低pH值如何共同影响MUC5B聚合物的生物物理特性。通过使用速率区域离心和SEC-MALLS分析进行沉降分析,确定了MUC5B响应于钙浓度和pH值变化的溶液行为变化。在pH 7.4的条件下,在无钙的情况下(EGTA处理),MUC5B缓慢沉淀,在约15%的蔗糖上形成一个峰。相反,添加过量的钙并将pH值降低至5.0会导致粘蛋白沉降曲线发生变化,MUC5B的沉降速度更快,且蔗糖浓度范围很广(18–30%)(图5A)。 )。此外,已经观察到单独的pH可以影响粘蛋白的沉降行为。pH值从7.4降低到5.0导致MUC5B的沉降曲线发生适度变化,在较低pH值下检测到更快的沉降分子(图   5B)。但是,这种变化不如10 mM Ca 2+ pH5处理的样品明显。此外,SEC-MALLS显示表观MUC5B分子量从EGTA pH 7.4处理的样品中的9.6 mDa增加到在pH 5.0进行钙处理后的11.2 mDa(图   5C)。)。分子量的这种明显增加表明MUC5B网络内钙驱动的瞬时交联。此外,与EGTA处理的分子相比,在pH 5.0下的钙处理导致MUC5B的回转半径从129nm减小至109nm(图   5D),表明钙具有驱动粘蛋白凝集的能力。通过确定Mark-Houwink参数α(它是衡量分子刚度的指标;29),我们没有观察到线圈到球状的转变,无论是否存在MUC5B聚合物都保留为线圈(α= 0.5)钙(图   5E)。因此,钙对MUC5B的作用代表了从线性MUC5B聚合物的刚性无规卷曲转变为交联的更紧密形式的聚合物。

图5
图5

MUC5B聚合物在pH 5.0的钙存在下进行缩合。通过蔗糖密度区带离心和SEC-MALLS分析评估了钙浓度和pH值变化对粘蛋白行为的影响。A)将50μg/ ml的MUC5B与pH 5.0的10mM Ca 2+或pH 7.4的10mM EGTA 一起温育通过用MAN-5BIII抗血清进行免疫检测来评估MUC5B沉降曲线的变化。B)将50μg/ ml纯化的MUC5B在pH 7.4或pH 5.0下进行速率区域离心,通过MAN-5BIII免疫检测评估沉降行为。C)50μg/ ml MUC5B与10 mM Ca 2+孵育通过SEC-MALLS分析pH为5.0或pH 7.4的10 mM EGTA。与EGTA处理的聚合物相比,钙处理被认为增加了MUC5B的分子量。虚线示出了折射率(RI)曲线。D)与EGTA处理的分子相比,在pH 5.0的钙存在下,平均MUC5B回旋半径降低。ë),用于分子的大小和形状之间的关系可以通过的Mark-Houwink参数α来表示,从关系式R获得ģ = AMR α,其中A是与分子每单位长度的质量有关的常数。α可以用作MUC5B刚度的指标;对于棒状分子,α= 1,对于随机线圈,α= 0.5–0.6,对于紧凑球体,α= 0.33。该图表明,在两种情况下,MUC5B均在溶液中表现为线圈。F)将1mg / ml与NaCl(10mM和50mM)或CaCl 2(10mM和50mM)在pH 7.4或pH 5.0 下孵育的MUC5B糖肽进行AUC。这些分子的沉降系数在所有条件下均保持恒定。

接下来,我们进行了分析超速离心,以评估高度糖基化的粘蛋白结构域是否促成上述MUC5B拓扑结构中依赖钙和pH的变化。发现无论存在酸性(pH 5.0)还是中性(pH 7.4)pH,MUC5B糖肽(1 mg / ml)的沉降系数在钙存在下(最高50 mM)和钙水平下均不受影响(图   5F)。

这些结果一起表明在控制MUC5B聚合物结构拓扑钙和pH的重要性,以前只能在重组MUC5B N-和C-末端的蛋白质结构域提出了通过研究914在这里,对MUC5B聚合物的直接评估通过证明MUC5B聚合物采用高度组织化和稠密的结构(由钙和pH依赖性蛋白质域之间的相互作用驱动),提供了扩展我们对粘蛋白结构组织的认识的证据。从而提供进一步的洞察力,例如在CF中,在细胞外环境发生变化的条件下,如何改变全长MUC5B聚合物结构。

讨论区

在这里,我们提出了在全长MUC5B上使用单颗粒分析的新颖演示,使我们能够定义整个聚合物中不同的总水平结构基序。通过对分离的MUC5B粘蛋白域进行单颗粒分析,我们已经能够鉴定出聚合物的高度糖基化区域中存在的结构基序,这些结构基序很可能代表了蛋白质的总体重复以及相关的但实际上是无序的糖基化。糖肽类平均数显示,尽管存在严重的糖基化,粘蛋白域仍包含具有独特结构的独特单元。这些图案表现为“珠状”结构,沿聚合物轴重复(图   6)。),其直径在4-5 nm之间变化,这与Round和同事通过AFM测量人员报告的MUC5AC的直径在〜3 nm 12时是一致的虽然尚未进行MUC5B和MUC5AC之间的直接结构比较,但我们建议可比较的直径测量结果可能反映了两个大分子上存在相似的糖基化水平。这项工作支持Davies及其同事的研究,他们暗示了糖基化模式修饰粘蛋白结构域的可能性15有鉴于此,我们建议糖基化的单个补丁可以赋予这些区域以顺序和结构。支持这一点的是,最近对内在无序的多肽的研究表明,这些序列实际上确实包含半序结构,当糖基化时会形成僵硬的构象,从而为粘蛋白域如何组织提供了证据28这种将粘蛋白结构域视为一个有组织的分子区域的观点,包含独立的结构化聚糖补丁,代表了一种新颖的概念,它为粘蛋白结构域采用类似于洗瓶刷的构象增加了细节30通过对MUC5B粘蛋白结构域的序列分析,我们将这些糖基化斑块映射到了独特的重复氨基酸序列上。因此,我们建议这里给出的珠状结构是这些重复序列的有序糖基化的结果(图   6)。在针对MUC5B糖肽测量的18 nm持久长度的背景下考虑这些重复的5 nm珠子,我们可以得出关于粘蛋白分子固有柔韧性的结论。观察到的5 nm亚结构暗示MUC5B糖肽内存在固有的结构组织水平,但微珠之间的柔性端对端接触可以弯曲18 nm。

图6
图6

MUC5B结构组织的模型及其受钙离子影响的方式。在粘蛋白分泌颗粒占主导的条件下(酸性pH和高钙浓度),MUC5B缩合通过粘蛋白N端二聚体之间的非共价钙依赖性同型相互作用以及N端二聚体和C-之间的异型相互作用而发生。终端二聚体(具有在这种结构中没有直接作用的高度糖基化粘蛋白结构域),其结果具有高度组织和紧凑聚合物91437MUC5B的内部富含Cys的域在此过程中的作用尚待研究。钙螯合和pH值升高(分泌到细胞外粘液层后的环境)会导致粘蛋白线性化和结构重塑。气道脱水和无效钙螯合,在CF提议3345,将导致有缺陷的膨胀和改变的粘液的性质。MUC5B聚合物的整体结构拓扑固有地与其糖基化状态相关,聚糖补丁(带阴影的椭圆形)将结构组织赋予MUC5B聚合物。*表示潜在的O-糖基化位点。

尽管在理解粘蛋白是如何组织的结构的最新进展79,仍缺乏关于如何粘蛋白结构上形成功能性粘液屏障的知识,并且该结构是如何在其特征在于,在黏液离子含量变化条件下修改。总体而言,此处提供的数据突出了MUC5B固有的结构灵活性,并为我们提供了有关粘液离子含量变化如何改变粘蛋白构象的新见解。众所周知,在诸如CF的疾病状态下,粘液屏障结构受到损害。通过模仿升高钙环境(2-4毫米)中发现的CF粘液屏障内3132,我们提供了有关如何在CF中聚合MUC5B进行结构排列的结构信息。此外,由于酸性pH(〜pH 6)和分泌颗粒的高钙环境(〜200 mM),我们在这里呈现的结构也可能与细胞内包装的粘蛋白33的一些近谱相联系MUC5B在pH 5.0下响应钙处理显示出显着的结构敏感性。高度压缩的结构显示出回转半径的减小和密度的同时增加。这些紧密分子与9提出的建模结构显示出显着相似性其中由N端结构域二聚体组成的蛋白质节点被提议相互作用以形成焦点,围绕该焦点组织糖基化的粘蛋白结构域。因此,这些高度组织和紧凑的结构表示包装的粘蛋白某些方面的准确表示是可行的。Kesimer及其同事提出了类似的MUC5B拓扑结构,他们观察到紧密的聚合物组织在直径20的10–20 nm的许多节点周围我们建议仅在酸性pH值,高钙环境(如在分泌颗粒中发现)内,才能形成由电子致密核主导的组织结构(图   6)。

功能性粘液屏障的形成依赖于粘蛋白从浓缩形式到扩展的线性构象的转变。这种大分子重组被认为在分泌后迅速发生34,粘蛋白的膨胀是由抗衡离子置换过程(Ca 2+离子置换为Na +35驱动的粘液系统的渗透压的变化被认为触发了从凝结态到膨胀态的相变36增加细胞外环境中的钙浓度会严重阻碍黏蛋白的扩张和黏液肿胀32因此,突出了在黏液屏障内维持调节的离子平衡的重要性。因此,通过EGTA螯合去除钙,并将pH维持在7.4,我们旨在模拟细胞外空间中存在的离子条件。我们的数据表明,在这些条件下,MUC5B采用开放和扩展的构象,粘蛋白网络由高度线性化和拉直的聚合物组成,其拓扑结构可能代表成熟的粘蛋白网络。这支持了Kesimer及其同事的工作,他们假设离子含量的分泌后变化是粘蛋白膨胀的驱动因素20此外,我们提供的证据表明,MUC5B的钙驱动缩合是通过单独在MUC5B的蛋白质结构域内的相互作用而发生的,而钙对粘蛋白结构域之间的相互作用几乎没有影响。这些结果与Raynal及其同事的研究相结合,他们证明还原后或通过使用离液剂37失去了钙依赖性粘蛋白的交联,这使我们对粘蛋白的紧实有了更全面的了解,并且强调了这一点MUC5B中非糖基化结构域的组成是聚合物的关键调控成分。

天然纯化的粘蛋白从浓缩状态过渡到扩展状态的能力为我们提供了有关粘蛋白结构柔韧性和分泌后加工的重要信息。MUC5B响应离子含量的变化而容易改变构象的能力,可能同时采用颗粒内和细胞外结构,这表明这些分子以适应性但稳定的形式保持完整。这与Ridley及其同事的研究一致,后者表明MUC5B N末端域在颗粒释放后仍保持完整10此外,通过比较log Rg和log平均分子量之间的关系,我们已经表明,MUC5B通过钙驱动的缩合产生构象快速变化的能力表明了网络交联,而不是线圈到小球的过渡。

在这里,我们建立了离子环境变化与MUC5B网络结构变化之间的关系。此外,我们表明粘蛋白聚合物具有固有的柔性,并且钙驱动的MUC5B构象变化是可逆的。在考虑对CF肺病进行潜在治疗时,这种结构可塑性至关重要:治疗必须能够在结构上影响粘蛋白网络并逆转粘蛋白凝结。钙从CF粘液屏障中的位移被认为是驱动这种构象变化的重要因素32,并且我们已经看到了MUC5B对钙螯合剂EGTA的治疗反应如何。观察到的响应于钙去除的MUC5B线性化为我们提供了有关粘蛋白如何在健康的粘液屏障内组织的信息,并使我们得出有关潜在CF治疗必须如何在结构上影响粘蛋白网络拓扑结构的结论。

实验步骤

天然MUC5B纯化

汇集从10个健康个体捐赠的整个人类唾液并将其溶解在0.1 M NaCl,20 mM Tris pH 7.4中,从而允许通过适应性的两步等密度密度梯度离心法纯化天然MUC5B聚合物,如前所述37简而言之,在唾液溶解后,将CsCl添加到样品中,产生的起始密度为1.4 g / ml,并在Beckman Ti45中使用Beckman OptimaTM L-90K超速离心机在40000 rpm和15°C下进行密度梯度离心65小时。转子。离心后,合并含粘蛋白的级分,并以1.5 g / ml的起始密度在CsCl中进行第二轮等密度离心。在先前的条件下将样品离心,然后将粘蛋白富集的级分合并,并进行缓冲液交换,以加入10 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl,pH 7.4。

该研究的伦理学许可已从曼彻斯特大学研究伦理委员会(参考号08293)获得,并获得了所有参与者的知情同意。所有研究均按照相关指南和法规进行。

粘蛋白单体和糖肽的制备

通过还原和羧甲基化过程产生粘蛋白单体。通过与20 mM二硫苏糖醇(DTT)在37°C孵育3小时来减少纯化的粘蛋白。然后在黑暗中在室温下用50 mM碘乙酰胺(IAA)将样品烷基化45分钟。通过使用Vivaspin 5-10 kDa MWCO色谱柱将缓冲液交换成10 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl,pH 7.4,从粘蛋白单体中除去DTT和IAA。

粘蛋白结构域被高度糖基化并且对胰蛋白酶消化具有抵抗力。为了产生这些大的糖肽,如上所述制备粘蛋白单体。随后以1:1的比例将0.1 M碳酸氢铵添加到样品中。然后将蛋白质组级胰蛋白酶(Promega,麦迪逊,美国)以1:20(w / w)的比例添加到样品中,并在37°C下孵育过夜。使用Vivaspin 5–10 kDa MWCO色谱柱从消化的样品中回收粘蛋白糖肽,离心后保留了糖基化的粘蛋白结构域,并允许其通过消化的胰蛋白酶肽。随后使用Vivaspin 5-10 kDa MWCO色谱柱将粘蛋白糖肽交换为10 mM NaCl / 10 mM Tris-HCl,pH 7.4。

为了确认MUC5B单体和糖肽的生成,对这些分子进行了SEC-MALLS分析,并与聚合的MUC5B样品进行了比较(补充图   1)。

MUC5B治疗

MUC5B的构象对粘液屏障中的离子变化敏感,为了研究这种敏感性,将纯化的MUC5B置于不同的条件下并评估其结构变化。将纯化的MUC5B样品稀释在10 mM NaCl,10 mM Tris pH 7.4中,产生的浓度在0.5μg/ ml和1 mg / ml之间。然后将粘蛋白的pH调节至pH 5.0或7.4,并在4°C下与10 mM CaCl 2或10 mM EGTA 孵育24小时

免疫检测

使用Minifold II 72孔狭缝印迹歧管将样品(50μl)狭缝印迹到硝酸纤维素膜上。在缝隙印迹之后,硝酸纤维素膜在ddH 2 O 中短暂漂洗,然后用5%(w / v)溶于PBS pH 7.4的干燥奶粉封闭1小时。然后将膜在10 mM Tris-base / 150 mM NaCl / 0.1%(v / v)/ Tween-20,pH 8.0(TBST)中洗涤1分钟,然后与兔多克隆MAN-5BIII孵育12小时(1 :2000稀释)抗血清38溶于TBST。在TBST中洗涤3 x 5分钟后,随后将膜与IRDye 800CW驴抗兔IgG(1:10000稀释; Li-COR Biosciences,林肯,美国)在黑暗中孵育1小时。孵育后,将膜再次在TBST中洗涤5次,每次5分钟。使用LI-COROdyssey®CLx红外成像系统(Li-COR Biosciences,林肯,美国)对二抗进行可视化,并在条带强度上进行光密度测定。

透射电子显微镜

将样品在涂有碳的400目铜网格(Electron Microscopy Sciences,宾夕法尼亚州,美国)上孵育30秒,该网格已在30伏特下放电30秒。然后将网格在ddH 2 O中洗涤10秒,然后用2%(w / v)乙酸铀酰(Agar Scientific,Essex,UK)进行负染色1分钟。使用Tecnai BioTwin显微镜以100 Kv记录TEM数据,并使用Gatan Orius CCD相机获取显微照片。标称放大倍数为23000倍,采样率为3.5Å/像素。记录的图像在0.5和5.0 nm的散焦之间。

单颗粒分析

沿着粘蛋白链将颗粒手动拾取到128个像素框中。最初包含约9000个独特粒子的数据集,然后进行类平均,然后进行对比度传递函数(CTF)校正,并使用20Å低通高斯掩模进行过滤;由于负色斑的分辨率为2–3 nm,因此更高分辨率的信息就是噪音,降低了对比度。然后,使用互相关计分或傅立叶环相关作为主要对齐器,对粒子进行12次无参考类多统计类平均的迭代轮次,生成2-D类。对平移或旋转比对没有任何限制。确定了表示相同域并具有相同串珠重复的类,并将其分组为单独的数据集,

如先前所述39从MUC5B糖肽颗粒生成3-D模型首先,将MUC5B糖肽数据集中的9000个粒子导入SPIDER软件,并生成初始模板图像,以避免参考偏差,该初始模板是未对齐的粒子堆叠的平均图像。然后使用局部投影匹配程序FindEM 40以迭代方式将粒子旋转和平移与初始模板对齐在15个回合中进行了迭代,模板更新为每个回合后对齐粒子的新平均值。每轮迭代后,将未排列的粒子丢弃。使用SPIDER软件,使用C-100对称性(垂直于光纤轴)反投影对齐图像的平均值,以生成初始3-D模型。使用通过FindEM和SPIDER软件进行的投影匹配过程,以迭代方式完善了初始模型。初始模型围绕光纤轴以5°的增量角反向投影,以提供足够的角度采样。使用FindEM,将模型投影用作基于多参考的旋转和平移对齐的参考。通过模型投影与粒子数据集的互相关,分配粒子方向,将具有相同方向的粒子求和,然后在SPIDER中进行反投影,以构建新模型。重复该过程,直到生成稳定的模型为止。

粘蛋白测量

使用ImageJ软件,使用分段线工具来测量不同的粘蛋白参数,包括链长和链宽。这些测量中的差异通过使用GraphPad棱镜软件的参数不配对t检验进行统计分析。

使用Easyworm软件套件24进行持久性长度测量使用以23000x放大倍数记录的电子显微照片,测量了约300种MUC5B聚合物,单体和糖肽的持久性长度。使用Easyworm拟合软件,可以跟踪粘蛋白链的轮廓,从而可以沿着分子的长度拟合参数样条。Easyworm软件从粘蛋白轮廓的长度和形状中通过测量作为l的函数的端到端距离(R)的均方根(沿着链的两个不同点之间的距离)来得出持久长度(P)轮廓)。

速率区域离心

在pH 7.4下于12毫升线性PBS中10-35%蔗糖梯度中进行速率区带离心,如前所述41将500μl样品分层放置在梯度的顶部,并使用Beckman SW40 Ti旋转转子在Beckman L-90超速离心机中于15°C在21000 g下离心90分钟。离心后,从梯度的顶部分馏试管,并收集24个馏分。通过在6 M尿素中溶解(VWR,英国莱斯特郡,英国)回收管底部的沉淀物料。每个部分的蔗糖浓度通过测量折射率来确定。然后通过免疫检测分析级分的粘蛋白分布。

尺寸排阻色谱法-多角度激光散射(SEC-MALLS)

将样品上样到Superose 6 10/30色谱柱(GE Healthcare,Amersham,英国)上,并以0.31 ml / min的流速在0.2 M NaCl / 0.01 M叠氮化钠中洗脱。洗脱液先通过Wyatt在线DAWN EOS激光光度计,然后通过带有准弹性光散射动态光散射附件(Wyatt Technology,Suffolk,英国)的Optilab rEX折光仪。使用0.165 ml / g的dn / dc值,使用ASTRA 6软件(Wyatt,圣塔芭芭拉,美国)得出并分析了光散射和折射率测量值。

分析超速离心

如上所述产生MUC5B粘蛋白结构域糖肽,并在10mM Tris(以及在不同pH下的10mM或50mM NaCl或CaCl 2)中调节至1mg / ml 使用上的Optima XL-A超速离心机(贝克曼仪器公司)在45000转速度实验样品进行分析,如先前所描述9使用SedFit版本13.0b 42确定沉降系数

MUC5B的中央富聚糖区域的序列徽标的生成

使用RADAR软件分析了MUC5B的全长序列(登录号:Q9HC84),该软件识别出MUC5B中央粘蛋白域中存在的72个重复序列。然后使用WebLogo 3.4软件43对这72个重复序列进行比对和分析,以创建代表MUC5B粘蛋白域共有序列的序列徽标。




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