本研究将急性奥洛夫热患者分为早期血清转换(基线为IgM/IgG阳性)或晚期血清转换(基线为IgM/IgG阴性)，在第1~3天、4~7天、8~10天和≥11天测定趋化因子和细胞因子产生的时间动力学。与健康献血者(HD)相比，所有OOV发热患者在基线时血清CXCL 8和IFN-α水平均较高，而TNF和IL-10水平较低。早期和晚期血清转换组CCL 2、CXCL 10、IFN-γ水平低于HD组，CCL 2、CXCL 10、IL-6和IL-17A水平高于HD组。早期血清转化蛋白在发病时间线上表现为CCL 2水平升高，晚期血清转化蛋白在发病数天后表现为CCL 2、CXCL 10和IL-6水平下降。值得注意的是，IFN-α被认为是人类orov热的通用生物标志物，而CXCL 8&IL-5和CXCL 10&IL-17在早期和晚期血清转化器中得到一致观察。因此，我们的结果表明，干扰素-α，CXCL 10和IL-17的产生先于血清转换，为奥洛夫病引发的免疫事件带来了新的见解。

Oropouche病毒(Orov)属于RNA病毒最大、最多样化的家族之一，正丁鱼科，其中包括几种树突状病毒，导致人类许多重要的急性但自我限制的发热疾病，以及出血性发热和脑炎。1,2...关于流行病学方面，最近的一次审查报告说，在过去60年间，包括巴西、秘鲁、巴拿马、特立尼达和多巴哥等受影响地区在内的奥洛夫热爆发了30多起疫情，包括50多万例临床病例。在巴西，亚马逊地区发生了规模最大的奥洛夫热流行，也是奥罗夫最大的流行区。3,4...事实上，直到最近，奥洛夫热仍是巴西第二常见的树状病毒感染，仅次于登革热。现在该交最近的基孔肯雅和寨卡病毒流行病，奥洛夫热被认为是第四。TH这个国家最流行的树突状病毒病。OROV正引起公共机构的关注，因为它可能在地理上扩散，并出现在天真的地区，这就要求从国际上了解它的重要性。奥洛夫病是由感染的节肢动物咬伤引起的，通常是由蚊引起的。中华绒螯蟹，它的主要城市载体，允许病毒进入和复制在肌肉细胞，然后系统性传播到几个器官和血液，导致高病毒血症检测到在2-4天的症状。4...临床表现为急性发热，有皮疹、头痛、发热、肌肉和关节疼痛等常见症状和体征。3...病毒可能引起脑膜炎，导致脑膜刺激的典型临床表现，然后跨越血脑屏障，感染神经元，在更易受感染的个体中产生脑炎。5...然而，奥洛夫热通常由于其轻微和自我限制的表现而得不到诊断，或由于其与登革热、基孔古尼亚、齐卡、其他树状病毒疾病甚至疟疾的临床特征相似而最终被误诊。4.

通常，在检测特异性IgG和IgM抗体的基础上，使用不同抗原的血清学检查来诊断orov感染。4...尽管在流行病学调查中，IgG和/或IgM ELISA检测到的血清转换是流行病学调查中的“金标准”方法，但在我们的临床经验中，在发病后血清转换存在时间依赖性差异。事实上，有些患者在发病时已出现IgM/IgG阳性，而另一些患者则表现出较晚的血清转换谱，这可能导致在急性期疾病期间对orov感染产生假阴性诊断。对于在感染期间引发的导致奥洛夫热后早期和晚期血清转换的免疫事件，人们知之甚少。免疫生物标记物的分析可能有助于理解这一现象的机制。

一般来说，病毒感染会触发免疫系统，从而激活先天和适应性细胞，产生强烈的炎症反应，这些炎症反应是由多种炎症细胞因子和趋化因子介导的，如I型干扰素(IFN)，这是抗病毒防御所必需的。一般来说，Ⅰ型干扰素信号可以触发数百个基因的表达，参与阻断病毒的进入、复制、翻译和组装，以及调节炎症和适应性免疫。6...Ⅰ型IFN反应是在病毒复制周期的早期阶段触发的，其重要性已在奥洛夫病小鼠模型中得到证实。7...此外，离体实验表明，在感染后的第一个小时，干扰素-β的mRNA水平升高，并迅速下降，在感染后24小时达到极低水平。7...然而，细胞因子动力学是如何在人类奥洛夫热期间发展的，目前还没有报道。

因此，本研究旨在研究奥洛夫热发病后早期和晚期血清转化物中的可溶性免疫标志物，包括循环细胞因子和趋化因子。结果表明，两组间细胞因子和趋化因子水平存在显著差异，说明OROV调控的天然免疫应答模式与血清转化密切相关。

急性期奥洛夫热患者发病的血清学状况分析

为了解急性感染患者血清IgM/IgG抗体水平，采用MAC ELISA法检测不同发病天数患者血清中IgM/IgG抗体水平。根据基线血清学，将RT-qPCR诊断为orov病的患者分为阳性(IgM/IgGPos，n=48)和阴性(IgM/IgGNeg，n=27)。1，顶板)。这些结果显示了早期和晚期血清转换的特征。在评价IgM/IgG滴度时可观察到两组：(1)自发病初期起呈高滴度的患者，分为早期血清转换型和(Ⅱ)在发病后8天左右出现高滴度的患者，被认为是晚血清转换者(图一)。1、中间板)。按发病天数分为1~3组、4~7天、8~10天和≥11组。早期血清转换组的IGM/IgG滴度在1~3、4-7亚组高于晚期血清转换组。

急性期奥洛夫热患者发病后不同天循环IgM/IgG的血清学特征。采用MAC-ELISA法测定IGM/IgG滴度，根据基线时IgM/IgG血清学(上图)将OROV患者分为阳性组(n=48)和阴性组(n=27)。抗体滴度在发病后的几天内测定，并以散点图作为连续时间来描述两组被划分为早期和晚期血清转换(中间图)的奥洛夫热患者。根据发病天数(1-3，4-7，8-10和≥11)，条形图代表了4个早期和晚期血清转换子组的标准差(血清稀释反向)的平均滴度。多组比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn后测进行顺序配对比较。星号突出了子组之间的差异。**p≤0.01，*p≤0.001(下图)。

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然而，早期(1-3和4-7)的血清转换群(早期和晚期)与晚(8-10和≥11)的时间点(图11)相比，呈现出明显的和显著不同的IgM/IgG滴度。1、底部面板)。

奥洛夫热患者循环趋化因子和细胞因子的总体变化

根据IgM/IgG血清学结果，采用流式细胞术对急性期奥洛夫热(IgM/IgG)患者血浆中总趋化因子和细胞因子进行检测，基线结果为早期(基线为IgM/IgGPos)或晚期(基线为IgM/IgGNeg)。2)。结果表明，奥洛夫热患者血清CXCL 8和IFN-α(粉红色背景)水平高于HD(蓝色背景)，血清TNF和IL-10水平低于HD(蓝色背景)。早期血清转化蛋白CCL 2、CXCL 10和IFN-γ水平较低。2，蓝色背景)。相反，晚期血清转换器的CCL 2、CXCL 10、IL-6和IL-17A水平高于HD(图1)。2、粉红色背景)。此外，晚期血清转换组CCL 2、CXCL 10、IFN-α、IL-6和IL-17水平高于早期血清转换组(图1)。2、粉红色背景)。

急性期奥洛夫热患者血清趋化因子和细胞因子水平的研究。采用CXCL 8、CCL 21、CXCL 9、CXCL 10、IFN-α、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素-10(IL-10)的检测方法，对急性期奥洛夫热患者在发病时和健康献血者(HD=60，灰色圈)中分为早期(48例，阅读圈)或晚期(27例，橙色)血清转化物(HD=60，灰环)进行检测。数据表示为单个值的散射(PG/mL)。多组比较采用Kruskal-Wallis检验，Dunn后测连续成对比较，并将显着性差异描述为星号和连接线。与HD相比，OROV亚组的彩色背景(浅粉色)、下降(浅蓝色)和未改变(灰色)的血清生物标志物水平明显增加，星号也显示出差异。*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，**p≤0.001.

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急性期奥洛夫热患者循环趋化因子及细胞因子的动力学研究

分别于发病后1~3天、4~7天、8~10天和≥时间点测定奥洛夫热患者血浆中趋化因子和细胞因子的时间线动力学，并将其分为早期和晚期血清转换(图1)。3和4)。在整个时间线动力学过程中，两组CXCL 8的水平均高于HD(灰色地带)。在早期和晚期血清转化器中，CCL 2的产生有明显的动力学变化。早期血清转化蛋白在发病后1~3天和4~7天较低，在发病后8~10天和≥较高，晚血清转换者仅在发病后1~3天高于HD和发病后11天的时间点≥。CXCL 9在发病后11天的≥早期血清中水平较低。有趣的是，在被归类为早期血清转化器的患者中，几乎所有的时间点都观察到CXCL 10的水平较低，而在那些被认为是晚期血清转化器的患者中，CXCL 10的产量在发病后1-3天和4-7天与HD相比有所增加。此外，在晚期血清转化器中，在发病后1~3天，CXCL 10的水平也高于发病后8~10天和≥(如图1所示)。3).

急性期奥洛夫热患者发病后不同天循环趋化因子的动态变化。在被认为是早期血清转换(n=48，左面板)或晚血清转换(n=27，右面板)的奥洛夫热(Orov)患者的血浆中，CXCL 8、CCL 2、CXCL 9和CXCL 10分别于发病后1-3、4-7、8-10和≥水平进行了评估。条形图以标准差(PG/mL)和灰色框表示均值，参考值范围为HD组均值的95%CI。多组比较采用Kruskal-Wallis检验，Dunn后测连续成对比较，并将显着性差异描述为星号和连接线。HD和Orov热亚组在不同发病时间的差异表现为星号。*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，**p≤0.001.

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急性期奥洛夫热患者发病后不同天循环细胞因子的动态变化。分别于发病后1~3天、4~7天、8~10天、8~10天、1~3天、4~7天、8~10天、11天测定血清干扰素-α、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-γ、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素-10(≥)水平。条形图以标准差(PG/mL)和灰色框表示均值，参考值范围为HD组均值的95%CI。多组比较采用Kruskal-Wallis检验，Dunn后测连续成对比较，并将显着性差异描述为星号和连接线。HD和Orov热亚组在不同发病时间的差异表现为星号。*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，**p≤0.001.

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在细胞因子产生方面，两组患者在整个时间线动力学过程中的IFN-α水平均高于HD(灰色地带)。两组患者血清肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-γ(IFN-)和白细胞介素-10(IL-10)的产生均低于HD组。与HD相比，发病后8~10天和≥患者血清IL-5水平明显升高。相反，在发病后1~3天和4~7天，晚期血清转化器的IL-6和IL-17A水平高于HD(图1)。4).

急性期奥洛夫热的血浆标志物特征

为了评价不同发病日血清转换早期和晚期可溶性生物标志物的总体特征，将连续数据转化为分类数据。为此，计算了所有测试组的全球中位数，并将其作为切断点来区分每种趋化因子和细胞因子的高和低生产者。这一战略允许产生生物标记水平高于全球中位数的受试者比例，后者被指定为高生产者。高生产者的比例越来越大，在测试的每个时间点(从上到下)为每一个生物标记物(左到右)创造了上升的特征。高生产者比例在50以上的生物标志物TH百分位数用灰色选择。其中，三种改变的生物标记模式被观察到和突出的符号，如图所示。5.

急性期奥洛夫热血清标志物特征的动力学研究。以各细胞因子(PG/mL)指数的整体中位数为切入点，绘制信号曲线，区分细胞因子/趋化因子的高低产生者与早期(左侧)和晚期血清转化者(右侧)。每条线对应于疾病发病后不同天的生物标志物特征，以确定感染期间细胞因子/趋化因子的总体变化。灰色盒子突出了超过50%的奥洛夫热患者所观察到的高于全球中位数的生物标记物。几何符号(矩形、菱形和子弹)分别描绘了那些被认为是“通用”的生物标记物和专门存在于“早期血清转换器”和“晚期血清转换器”中的生物标记物。

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与早期血清转化者相比，发病后1~3天和4~7天，晚期血清转化器中的生物标志物的分布范围较广，且产率较高。

值得注意的是，在早期和晚期血清转化器检测的所有时间点，干扰素-α信号始终较高，被认为是人类急性期奥洛夫热的通用生物标志物。CXCL 8和IL-5高生产者的比例在整个时间线动力学中持续升高，有选择地在早期血清转化器中。相反，CXCL 10和IL-17A高生产者的比例在所有测试的时间点都被强调为后期血清转换器。

Oropouche病毒(Orov)是最流行的病毒正畸病毒传染在一些南美北部国家，特别是在亚马逊地区。在这些地区，奥罗夫是地方病，但关于奥洛夫热引起的炎症反应的信息很少。本研究是第一次对奥洛夫热早期和晚期血清转化器的趋化因子和细胞因子进行综合研究。关于orov引起的初始反应，orov诱导的先天抗病毒反应是通过干扰素调节转录因子(iff 3和iff 7)、干扰素-α/β受体和线粒体抗病毒信号蛋白(Mavs)介导的，这在动物模型研究中得到了证明。7...奥洛夫热的发病机制实际上被描述为受非髓系细胞中的IFN通路相关信号分子mavs、irf-3、irf-7的限制。7...根据这些发现，一项非常优雅的研究表明正畸病毒，包括：Tacaiuma(TCMV)、Guama(GMAV)、瓜罗亚(Grov)和Carparu(Carv)除了orov之外，病毒还容易受到Interferon-α介导的时间和剂量依赖性的抗病毒攻击。8...事实上，在野生型小鼠中，IFN途径抑制了orov热.这表现在：干扰素-α基因敲除小鼠肝损伤增加，死亡率明显提高，病情进展迅速。7，类似于以前观察到的免疫能力强的叙利亚金黄仓鼠9...重要的是要强调，虽然干扰素-α是一个有用的通用生物标志物的奥洛夫热，它应该考虑与其他临床和实验室记录，因为其他几种病毒也可以诱导干扰素-α的产生。

除了IFN诱导的应答外，TNF信号元件如TNF受体相关因子3(TRAF 3)和干扰素基因刺激因子(Stimator of Interferon gene，SING)似乎对ORV天然免疫介导的控制起着重要的作用。相反，随着感染的进展，这些中介物以依赖病毒的方式被下调.可能，病毒试图通过增加短的非编码同源miRNAs的表达来逃避抗病毒细胞途径。10...因此，在奥洛夫热期间评估的唯一细胞因子是Ⅰ型干扰素，并已证明它对小鼠模型中的耐药至关重要。

与上述结果相一致，OROV患者的IFN-α水平高于HD患者，提示其具有较强的激活作用，且IL-10水平低于HD患者，而不考虑基线时的抗体水平。干扰素-α是唯一的细胞因子，在早期和晚期转化器患者中都是较高水平的细胞因子，其生物标志物特征证明了这一点。事实上，干扰素-α是唯一存在于疾病发病时间点以及早期和晚期血清转化器中的介质，这可能表明Ⅰ型干扰素介导的抗病毒反应可能与抗体的产生没有直接关系。

在本研究中，我们通过测定循环化学因子和细胞因子，证明早期和晚期血清转换曲线的奥洛夫热患者表现出不同的炎症反应模式。早期血清转换器在所有时间点上都显示出较高水平的CXCL 8和IL-5.在早期血清转化器中观察到IL-5的高分泌，这与该细胞因子在诱导B细胞活化和分化为产生抗体的浆细胞中的作用是一致的。这一发现可能意味着这些患者在感染的时间上处于领先地位，或者这可能反映了某些宿主对orov产生更强的免疫反应的内在能力。另一种可能是，这些早期的血清转化物可能会表现出一种独特的血清学模式，这是由于以前感染引起的交叉反应。正畸病毒...后一种假设的可能性较小，因为在基线血清学筛查期间观察到卡拉巴鲁和卡图病毒(滴度<1：40)对这些患者亚组和随访期间形成了较强的OROV阳性反应(滴度从1：640到1：1，280)。

CXCL 10和IL-17的高生产者是奥洛夫热晚期血清转换的标志。然而，由于IL-17水平在所有被检测的OOV患者中都特别低，因此要验证该分子作为奥洛夫热实验室随访的生物标志物是一个挑战。另一方面，在晚期观察到大量的CXCL 10，但在早期变送器中没有观察到大量的CXCL 10。高水平的cxcl 10已经在其他病毒感染中被报道。11,12...CCL 2也有类似的生产模式。CCL 2是一种与单核细胞募集相关的趋化因子，是病毒清除所必需的。12...事实上，CXCL 10和CCL 2都与支持Ⅰ型IFN应答的先天免疫事件密切相关。考虑到这些结果，很明显，cxcl 10和ccl 2在自然获得后也与免疫反应密切相关。正畸病毒疾病，并可作为补充生物标志物的奥洛夫热随访在临床实践中。

产生不同血清转换谱的原因可能是居住在亚马逊地区的巴西人的不同遗传背景所固有的特殊事件，以及大量和多样化的乔木病毒，包括有能力感染和引起人类疾病的各种正畸病毒，这些病毒有可能被暴露。这是可信的假设，之前接触不同的正畸病毒抗原可能影响免疫反应，至少对急性期奥洛夫热。事实上，包括在这项研究中的病人居住在一个地方病区。黄病毒比如登革病毒, 黄热病 病毒和寨卡病毒，也有可能是不同的正畸病毒比如C组，关岛，按蚊A，加利福尼亚州，以及其他引起不同树突状病毒共同循环的季节性和非季节性爆发的病毒。13...病毒血症是一个有趣的生物标志物，将有助于了解不同的血清转换谱。然而，没有发现病毒血症水平与趋化因子/细胞因子谱之间的明确联系，也没有发现本调查中所包括的样本的血清转换状况(数据未显示)。

为了确定不同的血清转换谱以及趋化因子/细胞因子模式是否与症状有某种联系，我们进行了几种数据挖掘方法，但无法确定单一或联合临床记录与血清生物标志物之间的关联。事实上，在奥洛夫病期间，其保护和发病机制尚未明确。总之，本研究确认IFN-α是人类orov热的一个通用的生物标志物，而CXCL 8&IL-5和CXCL 10&IL-17分别在早期和晚期血清转化器中得到一致观察。因此，我们的结果提示，干扰素-α和CXCL 10的产生先于血清转换，从而为疾病的发病机制带来了新的见解，即奥洛夫热引发的免疫事件。

学习人口

本研究是一项横断面观察研究，包括从Pará血液治疗和血液学基础中心(HEMOPA)和Evandro Chagas研究所(IEC)的血库中获得的135份血清样本。60例健康献血者(HD-HEMOPA)和75例Oropouche暴露患者(OROV-IEC)入选.HD标本对几种经血液传播的病原体进行了分类，并被归类为完全适合献血。奥罗夫热组是由Evandro Chagas研究所的研究人员在2006年在帕拉州Magalh es Barata(纬度：0°47‘53“”、经度：47°36’10“W)发生的Orov热暴发期间和2009年在巴西阿马帕州的Mazag o(纬度：0°6‘58”、经度：51°17’10“)期间临床调查的患者组成的。奥洛夫热患者在发病时被登记，并根据瓦斯康特洛斯进行症状评估。等人2009年：发烧(100%)、头痛(61%)、头晕(54%)、肌肉痛(48%)、畏光症(39%)、恶心(34%)、呕吐(33%)、关节炎(18%)、上腹痛(8%)和疹(4%)。没有出现腹泻和结膜充血现象。本研究的所有受试者都签署了书面知情同意书。储存在−80°C的样品经签署协议(080/2011-GAPRE/HEMOPA)使用。该研究议定书得到了埃万德罗·查加斯研究所(Plataforma Brasil，CAAE#0008.0.72.000-10)道德委员会的批准，所有方法都是按照相关准则和条例进行的。

Oropouche病毒感染诊断的分子和血清学IgM和IgG检测

以实时逆转录聚合酶链反应(RTqPCR)为基础建立参考试验，检测血清中是否存在OROV。RT-qPCR在发热患者急性期血清中有较高的OROV滴度.用mac ELISA法和血凝抑制法(HI)检测抗orov IgM和IgG抗体。3,14...同时对所有样本进行卡巴拉和卡图感染筛查，结果均为阴性(滴度<1：40)。

细胞因子与趋化因子评价

本研究选择患者血浆趋化因子(CXCL 8，CCL 2，CXCL 9，CXCL 10)和细胞因子(IFN-α，IL-6，IL-6，IL-17A，TNF，IFN-γ，IL-5，IL-10)为研究对象。该方法允许使用小样本量同时评价同一检测中的几个可溶性生物标志物。根据制造商的指示测定血浆和人体细胞因子标准，并立即在FACS杯中获得TM流式细胞仪(BD，圣何塞，加利福尼亚州，美国)。采用FCAP阵列软件V1.0(美国加利福尼亚州圣何塞)进行数据分析。四次曲线的平差模型TH采用Logistic参数对检测数据进行最优非线性曲线调整，结果用PG/mL表示。

统计分析

常规统计分析采用GraphPad Prism软件v.8.0(美国加利福尼亚州圣迭戈)。多组比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn后测进行顺序配对比较。在所有病例中，p<0.001.0 1(*)、p<0.0 1(**)和p<0.0 5(*)均有显着性差异。生物标志物的特征分析是按照Luiza-Silva先前的描述绘制的。等人.15...简单地说，计算了细胞因子和趋化因子血浆浓度的全球中位数，并以其作为阈值来确定每个生物标记物的低(低于全球中位数)或高生产者(高于全球中位数)的比例。50%的临界值被认为是在早期和晚期血清转换过程中普遍存在的生物标志物。