众所周知，昼夜轮班对免疫系统有负面影响.其潜在机制仍有待进一步调查。益生菌对免疫功能有调节作用。本研究旨在探讨益生菌摄入对DEC 205的预防作用。+白昼夜班护士树突状细胞功能障碍。在这项研究中，我们从那些吃酸奶或不吃酸奶的轮班护士那里采集血液样本。C.丁香)在夜班(NS)。用相应的免疫学方法评价其功能。我们观察到NS后护理人员的免疫耐受功能和白细胞介素-10(IL-10)表达均受到影响。HDAC 11在NS后明显上调的去癌细胞中检测到。DDC中HDAC 11水平与免疫耐受功能呈负相关。在NS过程中摄入含益生菌的酸奶能有效地抑制Bmal1和HDAC 11的水平，并上调脱DC的免疫调节功能。总之，NS对去DC免疫耐受功能有负面影响，可以通过在NS期间摄入含有益生菌的酸奶来预防。

昼夜节律紊乱经常发生在日常生活中，如昼夜轮班和时差等。1...累积的报告表明，昼夜节律紊乱与许多疾病的发病有关，如糖尿病。2、高血压3和慢性头痛4...免疫细胞活性随时间变化5...炎症病理也与昼夜节律紊乱有关。6...公布的数据表明，分子时钟，如bmal 1、clock和rev-erbα，控制着基本的免疫反应。7...然而，导致昼夜节律紊乱的因素仍有待进一步了解。

我们先前的研究表明，在从事夜班轮班的护士中，调节B细胞的功能受到干扰。8...机体的免疫系统由免疫调节细胞(如调节性T细胞(Treg)、调节性B细胞(Breg)或DEC 205)组成。+树突状细胞(Decdc)和免疫调节介质[如白介素(IL)-10和转化生长因子-β]9...公布的数据表明，免疫调节系统的功能障碍与许多疾病的发病机制有关，例如过敏性疾病。9自身免疫性疾病10...然而，免疫调节系统功能障碍的病因尚不完全清楚。

人们已经认识到昼夜节律紊乱与免疫疾病之间的联系。2,3,4...由于机体的免疫反应受到免疫调节系统的严密调节，免疫炎症状态反映了免疫调节系统功能失调的状态。众所周知，益生菌具有免疫调节功能。11...益生菌是分布在人体内的活微生物；如果给予足够的量，就会给宿主带来健康好处。12...摄入益生菌可以减轻免疫紊乱，如炎症性肠病。13...AS NS影响人体免疫活动14我们假设摄入益生菌可以调和NS对损害免疫功能的影响。因此，在本研究中，我们观察了益生菌对NS护士降直流功能的调节作用。于NS前后抽取护士血样。用免疫分析的方法评价其脱DC特性。

NS对DC免疫耐受功能的影响

为评价NS对机体免疫调节功能的影响，在NS前后采集护士外周血标本。从血液标本中分离出PBMCs，用流式细胞仪进行分析。结果表明，NS对去癌基因频率无明显影响。1A，B)。然后从PBMCs中分离出去DC。脱衣细胞与CD4共培养。+CD 25−T细胞在PMA/离子霉素(非特异性细胞激活剂)存在下作用4d。流式细胞仪分析。结果表明，NS能明显抑制DEDC的免疫耐受功能，NSP诱导的1型调节性T细胞(TR1)明显低于NSB前采集的NSBdecDC(NS后从护士收集)。图形1C-E)。结果表明，NS虽不改变脱DC的发生频率，但对其免疫耐受能力有一定的影响。

NS可降低DC的免疫耐受功能。在护士(NSB)和NSP(NSP)NS前(NSB)和NSP(NSP)后分别采集护士(NSB)和护士(NSP)20人的血液标本，其中20人仅在护士(非NS，或NNS)同一时间点采血。(A，B)分离外周血单个核细胞(PBMCs)，用流式细胞仪对其进行分析。门控点图显示出低密度集落的频率(A)。小提琴的情节显示出十进制的总频率(B). (C-E)从PBMCs中分离出脱DC。CD4+CD 25−从正常人外周血单个核细胞中分离T细胞。在IL-2(10 ng/ml)、PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯；0.1M)和离体霉素(100 ng/ml)的作用下，以1：5的比例共培养DCS和T细胞，共培养4d。(C发展中国家首先被排除在外。(D门控点图显示TR1细胞的频率。(E)小提琴图显示TR1细胞的总频率。面板(B，E)中的每个点表示从一个样本中获得的数据。统计：Anova+Bonferroni检验。

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ddc IL-10在NS中的表达下调

白细胞介素-10(il-10)是低密度DC的主要免疫调节介质之一。15...为了研究NS对去核细胞IL-10表达的影响，我们从PBMC中分离出了去白细胞介素-10(IL-10)。采用RT-qPCR和Westernblotting对细胞进行分析。我们观察到脱DC中IL-10的表达在NS后明显降低(图1)。2A，B)。我们还发现IL-10的表达与TR1诱导的脱DC能力呈正相关(如图所示)。2C)。结果提示，NS下调去DC中IL-10的表达，从而降低DC的免疫调节能力。

NS下调去DC中IL-10的表达。DEDC是从PBMC中分离出来的(参见图1)。1传说)。(AIL-10mRNA在去癌组织中的表达。(BIL-10蛋白在去癌细胞中的表达。(CIL-10mRNA与去DC诱导的TR1细胞呈正相关。每个点呈现从一个样本中获得的数据。每组收集蛋白质样本。这些数据代表了3个独立的实验。统计数字：(A): t测试一下。(C)：Pearson相关分析。(“补充材料”中介绍了全长凝胶)。

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NS增加去癌细胞HDAC 11的表达

已发表的数据表明，hdac 11可以抑制IL-10的表达。16...因此，我们接下来评估NS和HDAC 11在去癌中的可能联系。结果发现，NS后低密度DC的HDAC 11水平明显升高。结果表明，NS能上调去DC中HDAC 11的活性。3A，B)。我们进一步发现，NS后护士HDAC 11水平与低密度DC中IL-10的表达呈负相关(图5)。3C)。HDAC 11基因表达的下调恢复了HSP护士组织中IL-10的表达(图1)。3D，E)。HDAC 11在非NS护士中的过表达抑制了IL-10的表达.结果表明，NS通过增加HDAC 11的表达而抑制DDC IL-10的表达。

NS可增加去癌细胞HDAC 11的表达。DEDC是从PBMC中分离出来的(参见图1)。1传说)。从去DC中提取RNA和蛋白质，用RT-qPCR和WESTERNBLOTTING进行分析.(AHDAC 11 mRNA在去癌组织中的表达。(B)DDC中HDAC 11蛋白水平。(C)HDAC 11 mRNA与IL-10 mRNA在低密度DC中呈负相关。(D、E)用HDAC 11 RNAi(HDAC 11 RNAi)治疗NSP护士的低密度DC。D)并在培养中暴露于LPS中24小时。小提琴的情节(E)显示IL-10mRNA在低密度DC中的表达。用hdac 11表达质粒转染nnsb护士的F-G、decDC，使HDAC 11(F)。细胞在培养24小时内暴露于LPS中。G)显示IL-10mRNA在低密度DC中的表达。每个点呈现从每个样本中获得的数据。统计数字：(A): t测试一下。(C)：Pearson相关分析。(“补充材料”中介绍了全长凝胶)。

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NS对去DC生物钟蛋白Bmal1的上调作用

众所周知，NS可以改变生物钟蛋白的表达。14...为了寻找昼夜节律蛋白与解除功能调控之间的联系，我们对NS护士的昼夜节律相关蛋白的表达进行了筛选。我们发现，在20种昼夜节律蛋白中，NSP护士的脑肌Arnt-like 1(Bmal1)活性明显高于NSB样本和非NS护士(图1)。4A-C)。结果表明，NS增加了NS护士脱DC中Bmal1的表达。DDC中Bmal1mRNA水平与HDAC 11 mRNA水平呈正相关(图一)。4D)，提示Bmal1可能调控HDAC 11在去癌组织中的表达。

NS上调Bmal1在去癌组织中的表达。收集20名护士在NS前后的血样。(A)从样品中分离出脱DC，用PCR芯片进行分析。热图显示NSB和NSP的昼夜节律相关基因活性。(B)Bmal1mRNA在低密度DC中的表达。(C)Bmal1蛋白在低密度DC中的表达水平。(DBmal1mRNA与HDAC 11 mRNA在低密度DC中的表达呈正相关。非护士。护士上夜班。B：在NS之前。P：发布NS。每个点呈现从每个样本中获得的数据。统计数字：(B): t测试一下。(D)：Pearson相关分析。(“补充材料”中介绍了全长凝胶)。

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Bmal1增加低密度DC中HDAC 11的表达

为探讨Bmal1在调节HDAC 11表达中的作用，从健康对照组(HC)中分离出脱DC，转染Bmal1表达质粒，表达Bmal1(如图1所示)。5A)。这显着地提高了HDAC 11在低密度DC中的水平(如图所示)。5B、C)，IL-10的表达水平随后下调(如图所示)。5D)。为验证HDAC 11在Bmal1抑制IL-10表达中的作用，制备了HDAC 11缺陷型低表达DC。5E)转染Bmal1表达质粒。HDAC 11的缺失确实消除了Bmal1抑制的IL-10在低密度DC中的表达(如图1所示)。5D)。此外，BMAL 1的耗竭(图1)。5F)也增加了IL-10的表达。5D)。结果表明，Bmal1通过上调HDAC 11的表达，抑制去癌组织中IL-10的表达。另一方面，HDAC 11的缺失并不影响DDC中Bmal1的表达。5G)，表明Bmal1位于信号转导通路的上游。

Bmal1通过上调HDAC 11抑制DC中IL-10的表达。从正常人外周血单个核细胞(PBMCs)中分离出DEDC。为促进IL-10的表达，LPS刺激培养24h。A)通过转染表达Bmal1的质粒，可获得高表达的(OE)Bmal1。(B、C)IL-10在低密度DC中的表达。(D)培养上清液中IL-10水平。(E)HDAC 11 RNAi的结果。cRNAi：细胞用对照RNAi处理。(F)Bmal1的RNAi结果。(G)Bmal1mRNA在低密度DC中的表达。H-RNAi：HDAC 11 RNAi。非护士。“补充材料”中提出了全长凝胶。统计：Anova+Dunnett‘s测验。

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益生菌对NS诱导的去DC功能障碍的预防作用

以前的报告表明益生菌能提高免疫功能。17...因此，我们测试了含益生菌酸奶的摄入在对抗NS诱导的去DC功能障碍方面的作用。抽取100毫升牛奶或100克酸奶(含10克左右)的护士血液样本。10丁香(C.butyricum)。从血样中分离出脱DC，并对其耐受性进行分析。我们发现在NS中摄入酸奶一个月可以有效地维持脱DC诱导TR1细胞的能力。6A，B)和IL-10的生产。6C)，并保持HDAC 11和Bmal1水平不受NS的影响(图1)。6d，E)。结果表明，摄入含有益生菌的酸奶可保护NS护士的脱DC免受免疫耐受功能的损害。

酸奶摄入可防止NS所致的去DC功能障碍。护士在NS期间服用牛奶100 ml(n=20)或酸奶(100 G)(n=20)，持续一个月。在摄入牛奶或酸奶之前和之后，从每个护士那里采集血液样本。从样品中分离出PBMCs，从PBMCs中进一步分离出脱DC。CD4+CD 25−从正常人血中分离T细胞。在IL-2(10 ng/ml)、PMA(0.1M)和离体霉素(100 ng/ml)的作用下，以1：5的比例共培养DCS和T细胞，共培养4d。(A)流式细胞仪分析。DCS首先被排除在外(未显示)。检测残留T细胞中TR1细胞的频率。门控点图显示TR1细胞的频率。(B)A小组的总结数据(C)培养上清液中IL-10水平(ELISA法)。(D、E)用Westernblotting分析。免疫印迹显示HDAC 11蛋白水平。D)和BMAL 1(E)在低密度区。每点B、C)提供从一个样本中获得的数据。统计：Anova+Bonferroni检验。

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本实验结果表明，NS可通过抑制IL-10的表达，下调脱DC的免疫耐受能力。我们观察到NS增加了DecDC中Bmal1的表达，Bmal1增加了HDAC 11的表达，后者抑制了IL-10在DecDC中的表达。摄入含有益生菌的酸奶可防止NS所致的去DC功能障碍。

夜班轮班在从事特定职业的人中经常发生.NS是医院的一种定期轮班。公布的数据显示，NS可以改变昼夜节律。18...有几种疾病发生在从事夜班轮班的人比其他职业的人更多。例如，夜班工作是导致2型糖尿病患者血糖控制较差的原因之一。2...从事夜班轮班一年有高血压的风险。3...夜班轮班的护士报告频繁或慢性头痛的发生率较高。4...目前的数据提供了进一步的证据，说明NS可能会损害人类健康。

结果表明，NS后，DEDC的免疫耐受效果受到损害。脱衣细胞是机体免疫调节活动中的一个重要的细胞部分。脱DC通过释放免疫调节介质，诱导调节性T细胞。19...以前的报告显示，在食物过敏患者中，树突状细胞功能失调。20...在激素抵抗型哮喘患者中，髓系DC表型增加。21...然而，目前还不太清楚DecDC功能障碍的病因。研究结果表明，NS后DEDC的免疫耐受能力受损，提示NS可能是引起脱DC功能障碍的致病因素之一。

结果发现，NS后，去癌组织中IL-10的表达降低.IL-10是一种典型的免疫调节介质。22...IL-10缺乏可导致免疫炎症。23不能产生免疫耐受24...在本研究中，我们观察到NS诱导的Bmal1与IL-10在低密度DC中的表达呈负相关。Bmal1是一种昼夜节律蛋白。Bmal1的表达可受昼夜节律紊乱的调控。睡眠剥夺是促进bml表达的因素之一。25...我们的数据表明NS上调了DecDC中Bmal1的表达。由于Bmal1和IL-10的表达被NS所改变，这两种因子在去癌细胞中的表达可能存在联系。

我们还发现NS后去癌组HDAC 11水平升高。HDAC 11是HDAC家族的一员。hdac家族在生理条件下基因转录调控中起着重要作用。26...HDAC的调节失调与多种疾病的发病机制有关。抑制HDAC已被用于治疗癌症等多种疾病。27、糖尿病28和过敏性疾病29...我们的数据与以前的报告一致。我们发现HDAC 11与去癌组织IL-10水平呈负相关。此外，研究结果表明，NS能提高去癌组织中HDAC 11的水平，提示NS是调节HDAC 11活性的因素之一。

目前的数据表明，NS增加了HDAC 11，进而降低了DC的耐受性。这是一个有害的事件，对免疫动态平衡的身体。然而，没有很多的补救措施可以防止损害DC的耐受性或恢复受损的DC的耐受性。目前的研究结果表明，摄入含有益生菌的酸奶可以预防NS诱导的去DC功能障碍。益生菌已被用作免疫紊乱疗法的补充物。17...我们的数据与以前的研究一致，表明摄入益生菌可以防止NS对人体免疫耐受活动的影响。

综上所述，NS可以通过增加Bmal1和HDAC 11来降低脱DC的耐受性，抑制DDC中IL-10的表达，而摄入含益生菌的酸奶可以阻止这种作用。

试剂

HDAC 11(sc-106896)和Bmal1(sc-38165)shRNA试剂盒和抗IL-10(sc-32815)、HDAC 11(sc-390737)和Bmal1(sc-365645)的抗体是从圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz，CA)购买的。荧光标记抗体，包括PE-DEC 205，FITC-CD11c，PE-Foxp 3和Alexa Fluor 647-IL-10，购自BD生物科学(富兰克林湖，NJ)。IL-10 ELISA试剂盒是从研发系统(明尼阿波利斯，明尼苏达州)购买的.QuantiTect反转录试剂盒和SYBR Green qPCR主混合物是从齐根(Germantown，MD)购买的。RT-qPCR和WESTERNBLOTTING的材料和试剂是从Invitrogen(加州Carlsbad，CA)购买的.

伦理陈述

实验程序由山西医科大学人类伦理委员会批准。所有方法均按照有关准则和条例进行。每个人都得到书面的知情同意。

人类主体

本研究随机招募从事昼夜轮班工作1~4年的护士。人口统计数据载于表中。1...有以下任何一种情况的受试者被排除在本研究之外，包括过敏疾病、自身免疫性疾病、严重器官疾病、癌症、因任何原因接受糖皮质激素或其他免疫耐受剂治疗。

外周血单个核细胞(PBMC)的制备

每例病人于每次换药前、后经尺静脉穿刺取血(NS移位时间为12h)，每次20 ml。为了避免抽血压力，护士在实验前对研究目的进行了解释。采用Percoll梯度密度离心法分离PBMC。

细胞培养

细胞在RPMI 1640培养基中培养。培养液中添加胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(2mm)、青霉素(100 U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)。在2~3天内改变培养基。台盼蓝拒染法测定细胞存活率大于99%。

免疫细胞分离

DCS、B细胞和CD4+采用流式细胞术从外周血单个核细胞中分离T细胞。用荧光结合抗体孵育标记细胞，用流式细胞仪进行分类。如果分离细胞的纯度不能达到95%，细胞分选就会重复进行。

流式细胞术

细胞收集自相关实验。在表面染色中，用4°C荧光标记的感兴趣抗体或同型IgG标记抗体染色30 min，细胞内染色用1%多聚甲醛(含0.1%TritonX-100以增加细胞膜通透性)固定1h，然后用4°C荧光标记抗体或同型IgG染色30 min，用流式细胞仪(流式细胞仪)分析细胞(CSCantoⅡ；Bioscience)。用软件对数据进行分析，以FURJO(TreeStarInc.，Ashland，OR)等型IgG染色数据作为门控参考。

低直流耐受性功能的评价

幼稚CD4+CD 25−从正常人血标本中分离T细胞，NS前后从护士血标本中分离脱DC。CD4+CD 25−在PMA(50 ng/ml)和离体霉素(100 ng/ml)存在下，以5：1的比例与T细胞共培养4d。然后用流式细胞仪对细胞进行分析。IL-10频率+Foxp 3+检测iTr1细胞的免疫耐受功能，并将其作为检测细胞免疫耐受功能的指标。

实时定量RT-PCR

从相关实验收集的细胞中提取总RNA，并按照制造商的指示，用反转录试剂盒将其转化为cDNA。样品在有相应引物的SYBR绿色主混合物的qPCR装置中进行扩增(表)2)。结果用2−∆∆CT方法，并表示为对照的折叠变化。

WESTERNBLOTTING

从相关实验细胞中提取总蛋白，用SDS-PAGA进行分离，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂乳阻断30 min后，将原抗体(稀释1：200~300)在4℃下隔夜孵育，用含0.1%吐温20的三倍生理盐水(TBST)冲洗3次，用过氧化物酶标记的次级抗体孵育2h，用TBST洗涤3次。增强化学发光法在膜上建立免疫印迹，并在成像设备中拍摄(UVP成像；英国剑桥)。

Bmal1或HDAC 11在DEDC中的过度表达

根据制造商的指示，从健康人群中分离出表达Bmal1或HDAC 11的质粒或对照质粒(由上海Sangon BioTeck提供)。Westernblotting检测Bmal1或HDAC 11过表达在48h后的作用。

DDC中HDAC 11的耗尽

按照制造商的指示，用HDAC 11 RNAi试剂对去癌细胞进行处理。48 h后用Westernblotting评价HDAC 11的耗竭效应。

夜班期间摄入酸奶或牛奶

NS护士随机分为两组。其中一组提供酸奶(含丁酸梭菌由中国太原基恩食品有限公司生产。另一组提供牛奶(由中国太原KEINEFoodLTC.生产)。100 ml/NS)。一个月后，如上文所述，从每位护士那里采集血样。

统计

数据为平均值±扫描电镜。两组间的差异采用学生t检验。Anova随后进行Dunnett‘s试验或Bonferroni试验进行多重比较。皮尔逊相关分析法测定两组数据之间的相关性。P<0.05，有统计学意义。