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天然产物激发的新型吲哚基手性支架通过离子失衡介导细胞死亡杀死人疟疾寄生虫

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发表时间:2019-12-01 14:25作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

天然产物激发的新型吲哚基手性支架通过离子失衡介导细胞死亡杀死人疟疾寄生虫

摘要

天然产品提供了丰富的各种新颖的脚手架来源,激发了下一代抗疟疾药物的发展。基于这一愿景,以手性双环内酰胺为原料,以台阶/支架比为1.7:1的手性双环内酰胺为模板,合成了以天然生物活性生物碱为灵感的支架库。通过对支架库对疟原虫生长抑制作用的评价,我们发现了一个含有IC的支架材料。50在低微摩尔范围内。它通过破坏Na来抑制寄生虫的生长。+动态平衡。P型ATP酶,pfATP 4负责维持原虫Na。+动态平衡,是一个很好的目标抗疟疾。与我们的支架分子对接表明,它很适合于PfATP 4的结合口袋。此外,钠的抑制作用+-依赖于我们的支架的ATP酶活性表明它通过抑制PfATP 4来靶向寄生虫,从而导致离子失衡。然而,离子失衡如何归因于寄生虫的死亡尚不清楚。我们发现脚手架引起的离子不平衡。7通过线粒体膜电位(ΔΨm)的丧失和DNA的降解,诱导寄生虫发生凋亡。我们的研究为药物发现提供了一种新的策略,并深入了解了离子失衡介导的疟疾寄生虫死亡的分子机制。

导言

目前针对致命疟原虫的抗疟疾化疗方案,疟原虫,主要包括青蒿素联合治疗(ACT),其中包括青蒿素及其衍生物与配伍药物如阿莫地喹、甲氟喹、磺胺嘧啶-吡啶胺(SP)和鲁米芬三嗪(Lumefan Trine)相结合。1,2...最常用的组合是非洲地区的蒿甲醚-lumefan trine和青蒿琥酯-amodiaquine,南亚国家的二氢青蒿素-哌喹,以及印度和一些非洲国家的青蒿琥酯-磺胺-吡啶甲胺组合。2...然而,疟疾继续对人类健康构成威胁,因为目前抗疟疾治疗的耐药率不断上升。3,4...对目前可用的疟疾第一线治疗的抗药性需要一种更激进的方法来开发新的抗疟疾药。

文献表明,天然产品在发现抗疟疾等人类疾病药物的铅化合物方面发挥了重要作用。5...生物碱是一类主要的天然衍生化合物,具有抗疟活性,奎宁是这类化合物的最佳例子。吲哚基天然生物碱。乌山巴林、10‘-羟基琥珀酸、18-羟基异山津、桑古林、去核碱A、钠核苷等是从亚热带和热带地区获得成功的生物碱类化疗药物的另一个例子。6,7,8.

2010年,罗特曼等人...报道发现了一种以吲哚为基础的抗疟药KAE 609(cipargamin或NITD 609),目前正在进行第二阶段的临床试验(具有抗血期疟原虫的亚纳米粒效力)。9...KAE 609比目前金标准治疗青蒿素对无性血液期更有效。P. [医]恶性疟原虫也能阻止蚊子的传播10...在另一个例子中,波士顿大学化学方法和图书馆发展中心(CMLD-BU)发现了一个脚手架,它来自于一组以吲哚为基础的天然产品,被证明是抑制疟疾生长的理想基因为。11...该支架的几种类似物对5株疟疾菌株表现出较低的微磨牙活性。

Meyers推广的手性双环内酰胺等人...是一种多才多艺的分子,它描述了手性辅助物的作用,同时也是一种积木。12,13,14,15,16...基于这些双环内酰胺的大量合成方法,导致了几种天然产物。17,18...关键的反应要么是对映选择性碱,要么是亚甲基α上的烯醇化,然后是酰胺羰基,最终导致加成,芳基化和环化,或者通孔相应硫代半乳糖的硫代克拉森重排19,20.

具有相同化学结构的对映体在与体内的酶、蛋白质、受体等的相互作用中表现出明显的生物活性差异。21...一种异构体可能负责产生预期的治疗效果,而另一种则可能造成毒性或不起作用。市场上的许多药物都是外消旋混合物。以一种对映体为主要生物活性异构体的外消旋药物的一些例子是心血管药物,如S(−)-普萘洛尔,它比R(+)异构体强100倍,钙通道激动剂S(−)-维拉帕米比R(+)-维拉帕米的药效高10-20倍。22,23,24,25,26...手性的另一个重要方面是目标特异性。一种对映体可能比另一种更适合于催化/结合口袋,并可解释生物靶点的选择性增强,从而比使用对映体混合物更好地改善治疗指标和药代动力学。

目前管道中大多数有前途的抗疟疾药物属于螺环吲哚类、氨基吡唑类等,主要是由钠引起的离子平衡中断而导致寄生虫死亡。+流入寄生虫27,28...这是通过干扰P型ATP酶PfATP 4的功能来实现的.PfATP 4含有高度保守的酸性基序,这是钠转运所必需的。+-Na中的离子+-下真核生物中存在的外排ATP酶(ENAs),包括一些原生动物,强烈支持PfATP 4作为ENA在疟原虫中的作用。

关于离子不平衡引起死亡的机制,人们对此知之甚少。P. [医]恶性疟原虫...在此,我们提出了一种新的、更有效的抗疟疾药物设计策略,该策略涉及开发新的天然产物,以吲哚为基础的抗疟支架,通过离子不平衡诱导细胞死亡。我们强大的脚手架扰乱了Na+引起Na的稳态+导致寄生虫自噬过程的内流。在进一步的研究中,我们观察到治疗后疟原虫细胞凋亡的经典特征,线粒体电位的丧失和DNA片段的断裂,提示疟原虫细胞死亡的凋亡类型。

结果

手性双环内酰胺为构筑物合成强效抗疟支架

我们设想了一个由抗疟吲哚天然产品Usambarine和阿斯地卡品(indolo[2,3--)启发而来的图书馆。a手性双环内酰胺类喹啉嗪和斯皮罗[吲哚-3,3‘-吲哚啶]类生物碱13作为积木(方案1)。我们打算将特定于网站的功能13在站点a和b,这是两个可以用来生成库的最活跃的站点(图1)。1)。遵循了两条路线,其中第一条路线涉及到1B将双环内酰胺转化为乌山巴林和阿斯匹卡品支架,在路线2中转化适当的双环内酰胺。1Ac对Usambarine支架及其五个成员的同系物进行功能化(图1.1)。这些功能从简单的烷氧基和芳基结构到特权支架,如吡咯烷酮和吲哚(图1)。1).

图1
figure1

天然化合物激发支架合成策略综述。

首先,我们的目标是脚手架6, 7,和9,这是我们从1A/路线1.综合1B5-甲基丙戊酸酯与S-色氨酸在催化作用下缩合而成。p甲苯为溶剂的甲苯磺酸29...为了丰富1B具有必要的功能1导致形成2...后续乙酰化2生成3作为它的附属物的等距混合体。芳香亲核取代(S)NAr)与2,4-二硝基氟苯和Michael与硝基苯的加成反应3混合成4/58分别。加氢4/510%W/WPd-C和H2室温(RT)接TiCl4和三乙硅氢化物的螺旋环化反应生成的后续中间体67,用高效液相色谱法进行纯化。2)。类似的加氢8然后与钠/萘和TiCl进行去甲基化46-内切环化导致了9...NOESY实验证实了这些化合物的相对立体化学。因此,这个序列提供了三个脚手架。6, 79从现成的原料和丰富的多样化和优秀的步骤,每脚手架比例为2:3。

图2
figure2

化合物的合成:6, 79.

下一组支架是通过路线2/位点b制备的。1A1B用乙醇盐酸处理,转化为熔融支架。1011在数量上。氧化10去羧化12...平行反应12在甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇和三氟乙醇中,二苯存在下生成化合物。13A-E...以类似的方式,11被氧化成相应的羧酸,通过酯化得到14...类似的平行反应14,以甲醇、异丙醇、正丁醇和乙醇为原料15A-d(无花果)3).

图3
figure3

化合物合成13A,b15Ad.

吲哚基支架库的筛选体外生长恶性疟原虫

支架筛选是有利的,因为它提供了一个良好的起点材料,以建立一个更有效的化学类型库。因此,支架库的代表性成员,如6、7、9、13a、14和15a,在标准浓度为50μM的情况下,被初步筛选出对寄生虫一个完整的红细胞内生命周期的生长抑制作用(表)。1)。脚手架7及其非对映异构体6,对疟原虫的生长抑制率达80%以上。初步表型筛选后获得的两种药物在一个完整的红细胞内寄生虫生长周期(1、5、10、25、50和100μM)上进一步受到剂量反应(图1、5、10、25、50和100)。4A)。半最大抑制浓度即IC50被确定为脚手架67分别为32.4μM和21.8μM。支架7,低集成电路50,在连续两轮的进出和入侵过程中进一步获得寄生虫生长抑制活性,从而降低了IC。50至7.8μM.4B)。两例均以未经治疗的寄生虫为对照,流式细胞仪检测其生长抑制率。脚手架7检测了其对哺乳动物细胞株HepG 2的细胞毒性,其浓度为IC的两倍。50脚手架7也就是说,在50μ时,处理的HepG 2细胞与对照组一样健康(补充图)。1)。此外,脚手架7在哺乳动物细胞株HepG 2和COS 7中,即使在磨牙水平也是无毒的。

表1红血球内生长抑制P. [医]恶性疟原虫以吲哚为基础的脚手架库。
图4
figure4

抑制恶性疟原虫红细胞内生长。用不同浓度(1~100 M)的化合物6和7处理环期寄生虫。a)支架的剂量依赖性效应67寄生虫在一个完整的红细胞内生命周期上的生长。(b)支架的剂量依赖性效应7在两个连续的红细胞内生命周期中寄生虫的生长。(c)显微图像P. [医]恶性疟原虫IC孵育培养50支架浓度7...在处理过的寄生虫中,生长周期在滋养体阶段停止。(d)派图显示寄生虫在每一个时间点的不同周期阶段的分布情况。Spiro脚手架7在摄食阶段停止寄生虫的生长,即滋养体。

强效手性支架7对大鼠血液期生长周期的影响恶性疟原虫

生物系统将两种对映体或非对映异构体识别为两种二聚体分子,因此它们之间的相互作用引起了不同的反应。脚手架7用较低的集成电路50比脚手架6...阶段特异性效应7在它的集成电路上50在感染后12、32和42小时,通过对处理后寄生虫形态的分析,检测其浓度。每个时间点有近5,000个细胞/幻灯片重复计数。在对照组中,疟原虫健康,并在48 HPI时完成了其生命周期产生环。但在处理后的培养中,没有观察到环状的形成。90%以上的寄生虫在滋养体早期/中期停滞。4C)。这清楚地表明,在非对映异构体存在的情况下,疟原虫无法完成其生长周期。7在滋养体阶段生长停止,如饼图所示。4D).

支架7干扰Na+内平衡恶性疟原虫

在其他真核生物中,已知由各种阳离子交换物介导的离子不平衡导致线粒体功能紊乱,最终导致凋亡细胞死亡。30,31...Na等阳离子的作用+单独的或与其他离子相一致的离子也与刺激细胞死亡有关。32,33,34,35,36...有趣的是,管道中即将出现的抗疟疾药物已经被报道通过引起胞质Na的升高而导致寄生虫死亡。+浓度,[Na]+],创造Na+不平衡10,37,38,39...但在P. [医]恶性疟原虫,对离子失衡介导的寄生虫死亡的认识是非常初步的。所以我们寻找细胞内[Na]的变化+]在寄生虫治疗后用有力的支架。令我们感兴趣的是,基于共焦显微成像P. [医]恶性疟原虫用绿钠染色,脚手架7经治疗的寄生虫胞浆[Na]增加。+与控制寄生虫相比(图1)。5A)。计算了对照和处理寄生虫中钠绿的平均荧光强度,并对[Na]的升高进行了量化。+]在治疗过的寄生虫中(见图。5B)。通过对流式细胞仪数据的分析,进一步证实了共聚焦成像数据。5C).

图5
figure5

脚手架7致钠+流入P. [医]恶性疟原虫以钠为目标+依赖ATP酶(a)具有代表性的共焦显微图像P. [医]恶性疟原虫钠绿染色显示钠含量上升+治疗寄生虫的水平。脚手架7增加Na的胞浆浓度+. (b)条形图描述了对照和处理寄生虫中钠绿的平均荧光强度。(c)流式细胞仪数据支持细胞内Na的升高。+在Scaffold 7种治疗过的寄生虫中。(d)抑制钠+寄生虫膜中ATP酶活性的依赖关系。我们观察到钠的抑制率在40%到60%之间。+支架中ATP酶活性的依赖关系7治疗过的寄生虫。

支架7靶膜ATP酶恶性疟原虫

直接测试是否有效的吲哚基支架7,这是一种螺氨酮,抑制Na。+本文对纯化的滋养体膜制剂中的ATP酶活性进行了研究。首先,我们从未处理的支架中分离出膜组分。7处理后的寄生虫,然后用孔雀石绿色测定,以评估ATP酶的活性,如材料和方法部分所述。在整个膜ATP酶池中恶性疟原虫,我们发现Na+依赖型ATP酶贡献33.4%+/−4.34%的活性。因此,Na+依赖ATP酶活性在寄生RBCs膜相关ATP酶活性中占显著比例.支架治疗寄生虫分离膜的实验研究7在100毫米钠的存在下+,钠+与对照相比,依赖ATP酶活性分别下降到65.6%±5.6%(25 M)和42.4%±2.8%(50 M)。5D)。然而,用支架处理膜组分7低(0.5毫米)[钠]+]溶液对ATP酶活性无明显影响(附图)。2),从而意味着螺旋吲哚酮(脚手架)7)敏感的ATP酶活性在高[Na]条件下存在。+]条件。

在支架7及其对映异构体的硅相互作用中,支架6与PfATP 4相互作用

P. [医]恶性疟原虫保持较低的胞浆[Na]+]由P型Na介导的环境。+-ATPase‘PfATP 4’定位于寄生虫表面40...近年来,由于该蛋白的突变被报道对新型抗疟药物产生抗药性,包括螺氨酸酮、吡唑类、二氢异喹诺酮类等,PfATP 4的突变引起了人们的关注,这表明PfATP 4是开发新的抗疟药的关键靶点。27,28...二苯乙烯异构体67被发现符合重叠结合口袋的PfATP 4(图4)。6)并通过极性接触(H键)与构成蛋白质活性位点的氨基酸残基相互作用。但与此同时,手镯的手性变化允许脚手架。7与支架材料相比,PfATP 4结合能(−8.3KCAL/mol)能更好地与PfATP 4结合在一起。6(−7.3千卡/摩尔),这反映在集成电路的差异50两个脚手架的价值。脚手架7与GLU-895(3.6Au)和Lys-1094(3.4Au)和Lys-1094(2.9)形成三个H键。

图6
figure6

PfATP 4三维结构的同源模型及与支架分子相互作用的研究6 & 7...利用兔钙模型建立了ATP 4的同源模型2+ATP酶(PDB ID:2 DQS)为模板(中间)。化合物6和7的化学结构及其能量最小化模型分别用ChemD劳Ultra 12.0.2和Chem3D Pro 12.0生成。PfATP 4和支架的分子对接研究6 & 7使用AutodockVina工具1.5.6执行。(a,b两种支架均符合预测的PfATP 4活性结合袋(红色)。(c)脚手架的结合方式6装在口袋里。发现ATP 4的Glu-193和Ile-397与支架相互作用。6通过极性相互作用(H键,用虚线表示)和键长,分别为3.1和2.0(左)。(d)脚手架的结合方式7装在口袋里。发现ATP 4的Glu-895和lys-1094与支架相互作用。7通过H键,键长分别为3.6、3.4、2.9(右)。手性的变化使脚手架成为可能7与支架相比,以更多的负自由结合能(−8.3KCAL/mol)合理地融入结合口袋6(−7.3KCAL/mol)。利用PyMOL分子图形系统(1.7.4.5 Schr dinger,LLC)对蛋白质结构和相互作用进行了三维可视化。

支架7引起的离子失衡恶性疟原虫

ATG8被认为是自噬的经典标志,因为它与前自身噬菌体膜以及自噬体与溶酶体的融合过程有关。这个过程是通过RAB 7和各种陷阱来实现的。41,42...最近,托林斯等人...报道称,在应激或饥饿状态下,pfatg8共定位于食物液泡附近或内部的双膜结构/囊泡,表明自噬。43...确定脚手架是否7诱导性自噬,用支架治疗寄生虫7用抗重组ATG8和RAB 7蛋白的抗血清观察PfATG8和PfRAB 7的亚细胞分布。在对照组中,两种蛋白的分布部分重叠,而在治疗中观察到共同定位。7A)。具有代表性的散点图和平均皮尔逊相关系数均来自对照组和治疗组:r控制=0.42±0.05,n=25;r经处理在x轴上显示红色强度(PfATG8),在y轴上显示绿色强度(PfRAB 7),在x轴上显示红色强度(PfATG8),在y轴上显示绿色强度(PfRAB 7)。散点图上的黄色点显示了共同定位(图1)。7b,d)。由imaris显微镜图像分析软件获得的对照和处理寄生虫的三维图像,清楚地表明了支架对寄生虫的治疗作用。7ATG8与RAB 7的共定位结果(图7)。7C)。从这个实验可以推测出那个脚手架7通过干扰寄生虫环境中的离子平衡,导致自噬。

图7
figure7

离子失衡引发的自噬导致细胞凋亡恶性疟原虫,从而诱导PfATG8和PfRAB 7共同定位。(a)用抗PfATG8兔血清和抗PfRAB 7大鼠血清染色的裂殖体中PfATG8和PfRAB 7亚细胞分布的荧光显微图像。用DAPI对细胞核DNA进行染色。在支架治疗的7种寄生虫中,PfATG8与PfRAB 7共定位,表明寄生虫正在发生自噬。(b)用散点图对共焦图像进行共定位分析。应用奥林巴斯细胞三维成像软件,对对照组和治疗组的典型散点图和平均皮尔逊相关系数(R)进行分析。红色通道(PfATG8)显示在x轴上,绿色通道(PfRAB 7)显示在y轴上。散点图上的黄色点显示出共定位。(c)用Imaris显微图像分析软件获取的共焦z叠图像的三维重建。PfATG8代表红色,PfRab7代表绿色。支架7治疗寄生虫导致ATG8和RAB 7共定位。(d)PfATG8和PfRAB 7在治疗寄生虫中的共定位,通过计算Pearson相关系数(R),以条形图的形式表示。

支架7诱导的自噬通过线粒体膜电位的丧失触发细胞凋亡

当细胞损伤无法修复时,自噬往往导致细胞凋亡。总结脚手架引起的死亡类型7我们研究了治疗后寄生虫凋亡的经典事件。线粒体膜电位损失(Ψ)m)是寄生虫发生凋亡的关键现象之一。44...因此,Ψ中的任何更改m用脚手架治疗寄生虫7用JC-1染色观察。JC-1是一种细胞通透性亲脂染料,其荧光发射从绿色(~529 nm)向红色(~590 nm)转移,在线粒体中表现出Ψm依赖性的聚集。45...健康线粒体的高Ψm导致JC-1聚集体的形成,产生强烈的红色荧光,而Ψm的丢失则导致弱的红色荧光。因此评估Ψ的损失m计算了JC-1(红色)/JC-1(绿色)寄生虫的比值。在对照寄生虫中,健康的线粒体表现出强烈的红色荧光JC-1聚集体,在疟原虫细胞质中有弥散的绿色荧光(JC-1单体)。相反,在处理过的寄生虫中只观察到绿色荧光。7相对于控制,暗示Ψ的丢失m(无花果)8A)。总体而言,经过治疗后,JC-1(红色)/JC-1(绿色)寄生虫的比例较低,即脚手架的比例为0.4。7,表明线粒体膜电位丧失。8B(1))。这一结论通过观察到脚手架而得到进一步加强。7在无细胞体系中,在无细胞支架存在的情况下,通过测量激发波长为488 nm的jc-1(2μM)的荧光发射光谱,不干扰jc-1的聚集。7...我们注意到在含有<1%DMSO的水溶液中离体在几乎所有jc-1都以聚集体存在的条件下,488 nm激发的jc-1在595 nm处发射,在无支架和支架存在的情况下具有相似的发射强度。7,表示那个脚手架7不干扰JC-1聚合。同时,在35%dmso(jc-1均以单体存在的条件下)存在时,在无支架和无支架存在的情况下,jc-1的发射峰均在530 nm处。7(无花果)8B(2)).

图8
figure8

支架-7细胞线粒体膜电位丧失与凋亡样细胞死亡恶性疟原虫寄生虫。(a)具有代表性的共焦显微图像P. [医]恶性疟原虫感染红细胞JC-1染色。JC-1单体在支架作用下线粒体膜电位的丧失7在对照条件下,JC-1聚集体具有强烈的红色荧光。(b(1)条形图描述了JC-1红/JC-1绿色寄生虫在防治中的比例。经处理的疟原虫种群中Jc-1红/jc-1绿比值较低,表明支架引起线粒体膜电位丧失。7. (b(2)488 nm处的荧光发射光谱表明支架7不干扰JC-1在无细胞系统中的聚集.(c)(1)流式细胞仪直方图显示支架后TUNEL阳性寄生虫(FL1)的比例增加。7治疗,表明DNA碎裂。(c(2)表示人口百分比的代表条形图,为TUNEL正。(d)TUNEL染色显示寄生虫原地支架孵育后DNA片段化7...任意股。

DNA损伤引起细胞凋亡P. [医]恶性疟原虫

DNA降解是细胞凋亡死亡的典型标志。TUNEL法是检测片段DNA的金标准方法。44...用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)掺入BrdU标记DNA链断裂的3‘-OH末端。同样,在P. [医]恶性疟原虫,dna断裂是细胞凋亡的一个指标,流式细胞术的tUNEL法已经证实了这一点。46,47...另一种方法,DNA梯状分析法,也经常被用来显示DNA在凋亡过程中的降解。然而,在早期的研究中,有报道称疟原虫缺乏组蛋白变异体h2ax同系物,这是dna梯的特征形成所必需的。48...此外,在寄生虫中没有真正的caspase报道。相反,caspase样活性(Metacaspases)已被描述为在细胞凋亡过程中。49...因此,基因组DNA降解被认为是一种涂片,而不是典型的梯状模式。因此,TUNEL法是检测细胞凋亡的最可靠的方法。P. [医]恶性疟原虫.

我们用APO-BrdU™TUNEL分析试剂盒(分子探针,Invitrogen),TUNEL法对治疗和未治疗的寄生虫进行了DNA片段化研究。这种分析允许原地片段DNA的标记。标记的细胞代表正在经历凋亡死亡的寄生虫。然后通过流式细胞术对标记的寄生虫的数量进行分析,从而可以在单个细胞的基础上分析大量的细胞,从而提供更多的验证性结果。我们发现,在治疗过的寄生虫中,60%以上的寄生虫群为tUNEL阳性,表明用支架治疗。7引起凋亡死亡P. [医]恶性疟原虫...流式细胞仪数据作为直方图绘制。8c1)。三个独立的实验(n=3)的结果被绘制成一个条形图,显示支架中寄生虫的tUNEL阳性群体的百分比。7治疗后的寄生虫(69.91%)和未治疗的寄生虫(7%)。8c2).

为了进一步加强我们的结果,我们用共聚焦显微镜分析了治疗和未处理寄生虫中的凋亡群体(图)。8D)。在治疗过程中,杂合的寄生虫dna明显地表现为荧光的绿色荧光。R488染料标记的抗BrdU抗体突出了寄生虫的凋亡过程。在对照组中,健康寄生虫的绿色荧光可以忽略不计。

结语

以吲哚为基础的抗疟疾药物,无论其来源是天然的还是合成的,都是成功的。6,7,8,9...因此,以吲哚为基础的抗疟化合物的优势促使我们设计了一个具有高sp含量的具有骨架多样性的吲哚类化合物库。3内容,多样的形状和物理性质,可能是潜在的抗疟疾。由于良好的起始支架可以通过各种修饰来产生更强的化学类型,因此支架筛选提供了一种有吸引力的替代方法,以取代传统的高通量筛选最终化合物库的方法。对六种不同结构和立体化学成分的天然生物碱支架进行了研究,评价其对血液阶段疟原虫的疗效,P. [医]恶性疟原虫.

在由氨基酸、糖和脂类等生命物质构成的手性环境中,一种异构体可能表现出与其对映体不同的生物学和药理行为。甚至药物靶标对结合伴侣也是对映体选择性的。21...因此,这两种对映体中的一种可能与靶标的活性部位口袋有更好的结合,从而产生更好的生物反应。脚手架图书馆的两位代表,脚手架7及其非对映异构体6与Spiro[吲哚-3,3‘-吲哚啶]基序3D7疟原虫毒株。脚手架7带IC50在低微磨牙范围(21.8M)和无细胞毒作用的哺乳动物HepG 2中,进一步研究了其作用机制。

在传统的药物发现方法中,细胞IC50在纳米摩尔范围内的HIT化合物被认为是临床上有用的浓度。然而,文献挖掘和市场上的FDA批准的药物概述表明,广泛使用的化合物是有效的,在低微摩尔范围内,没有细胞毒性作用的人细胞株,甚至高浓度。这些药理学药物要么单独使用,要么作为组合药物治疗的一部分,在一个单一剂量的处方中由两个或多个有效成分组合而成。早期的证据之一来自于IC的研究50一种被广泛接受的抗寄生化合物,用于治疗氯喹抗药性。P. [医]恶性疟原虫疟疾,据报告大于10毫克50...另一项证据来自人类肾上腺类固醇激素脱氢表雄酮(Dhea)类似物dhea-s(dhea-S),它对氯喹敏感菌株具有抗疟疾活性。P. [医]恶性疟原虫在IC50通过增强环期寄生红细胞的吞噬作用51...时间监测体外易感性恶性疟原虫多西环素,另一种广泛使用的抗疟化合物,证明了它的平均IC501996至1999年为9.6立方米,2005年为13.1海里52...类似地,阿奇霉素是红霉素的一种类似物,对间日疟原虫疟疾,显示IC508.4μM对多药耐药的评价P. 恶性疟原虫K1应变53.

虽然脚手架7有IC50在低微磨牙范围内,它作为一种潜在的抗疟疾化疗药物,无论是作为一种独立的药物,还是与其他药物的合作,都有着巨大的前景。此外,它还具有很大的空间,可以通过取代支架周围的基团来获得更强的铅化合物。7.

支架7靶Na+与管道中的下一道抗疟疾药一样,寄生虫的平衡也是一样的。入侵后P. [医]恶性疟原虫在宿主红细胞膜上建立新的通透性通路,使被感染的细胞吸收养分。54,55,56...除了营养,还有钠+流入,导致[Na]增加+]在感染的红细胞胞浆中达到较高水平。然而,红细胞内的寄生虫却保持着较低的胞浆[Na]。+]40...质膜P型阳离子转运ATP酶‘PfATP 4’在这一过程中起着至关重要的作用。因此,pfATP 4已成为目前抗疟疾类化合物中最有希望的靶点,如螺氨酸酮、吡唑类、二氢异喹诺酮类等。27,28...这似乎是我们强有力的支架7的可能靶点,从支架的分子对接可以看出这一点。7装进PfATP 4的口袋里。此外,钠的抑制作用+支架7处理后的疟原虫膜组分中的ATP酶活性表明,它的作用靶点是位于寄生虫质膜上的PfATP 4,从而导致Na的产生。+以其他方式保持低[Na]水平的寄生虫的流入+]在其胞液中。尽管它是下一代抗疟疾药物最有潜力和最有利的目标,包括我们的脚手架。7然而,由PfATP 4的破坏所造成的离子不平衡所引起的死亡类型直到现在还不清楚。

细胞凋亡(自我杀伤)和自噬(自食)这两个已知的维持细胞整体内稳态的过程具有复杂的功能相互关系。它们可能被共同的信号激活,这可能导致联合自噬和凋亡过程。离子不平衡常常导致细胞自噬。在自噬中,自噬小体的形成是中心事件,由自噬相关蛋白(ATG)介导.ATG蛋白之一Atg 8因其与前自噬体膜的结合以及自噬体与溶酶体的融合而被认为是自噬的经典标志。自噬体和内小体与溶酶体的融合是通过RAB 7和snares(N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白(SNAP)受体)介导的。41,42...2013年,托林斯等人...报道了在饥饿条件下,血期寄生虫PfATG8共定位为双膜结构/囊泡,PfRAB 7位于食物液泡附近或内部,预示着自噬的开始。我们在脚手架上发现了类似的染色模式。7经处理的寄生虫43...最常见的死亡原因疟原虫是细胞凋亡。Ψm的丢失和DNA的降解是凋亡死亡的两个最常见的特征。我们研究了支架细胞凋亡的两个经典特征。7治疗过的寄生虫。Jc-1染料以单体形式存在或以聚合形式存在,取决于线粒体的膜电位,在处理后的疟原虫中产生强烈的绿色荧光,表明Ψ丢失。m...为了研究DNA片段化,我们采用了TUNEL法,这是证明DNA损伤最理想的方法。在……里面P. [医]恶性疟原虫,dna片段被认为是细胞凋亡的标志,并已用tUNEL法进行了研究。46,47...由于没有组蛋白变异体H2AX同系物和真正的caspase在P. [医]恶性疟原虫,这是形成特征dna阶梯所必需的,降解的基因组dna被观察为一种涂片,而不是经典的梯状模式。48,49...因此,TUNEL法是显示细胞凋亡的最佳方法。P. [医]恶性疟原虫...因此,我们用支架进行了dna断裂的金标法tUNEL检测。7经处理的寄生虫和观察到,60%以上的处理过的寄生虫群体都经历了DNA降解,表明支架7诱导凋亡样细胞死亡P. [医]恶性疟原虫.

最后,我们提出了一种新的天然产物激发药物设计方法,使我们获得了一种基于吲哚的有效支架,能够调节Na。+寄生虫的稳态。本研究为理解离子型不平衡介导的寄生虫细胞死亡提供了重要的帮助,这种死亡是通过诱导自噬而最终导致细胞凋亡的(图一)。9).

图9
figure9

离子失衡介导疟原虫凋亡死亡。脚手架7致钠+内流导致自噬,刺激寄生虫凋亡死亡。PfATP 4,a Na+依赖ATP酶可能成为支架的潜在靶点7.

材料和方法

生物分析

离体培养P. [医]恶性疟原虫和哺乳动物细胞系HepG 2

恶性疟原虫本研究使用的实验室菌株3D7是在O中培养的。+Ve红细胞在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中加入0.5%白蛋白I(Invitrogen)、50 mg/l次黄嘌呤(Sigma)、10 mg/l庆大霉素(Invitrogen)和25 mm碳酸氢钠(Sigma)(如Trager和Jensen和Singh,S.等人.57,58...寄生虫培养在混合气体环境(5%O)中进行。2,5%CO290%氮2)。正如前面所描述的,通过连续两轮山梨醇处理,培养在环阶段是紧密同步的。58,59.

人肝癌细胞株HepG 2在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(Invitrogen,USA)中培养,加入10%FBS(吉布科,美国)和青霉素(100单位/ml)和链霉素(100 mg/ml)。所有培养物都是在37℃、5%CO的加湿气氛中培养的。2.

新型吲哚基支架生长抑制作用的评价

6种化学支架在50μM浓度下进行初步筛选,观察其对寄生虫生长的抑制作用。两种有效支架在1~100μM浓度范围内进一步进行剂量依赖性评价,未处理为对照。简单地说,早期寄生虫血症为1%和2%红细胞压积的晚期寄生虫被用化合物治疗,如Kumar,N.等人.60...孵化后,用pbs洗涤寄生虫,用溴化乙锭(10μM)染色30分钟,用夏尔马,V.等人.61...用PBS洗涤两次后,采用流式细胞仪对BD-LSRFortessa™细胞分析仪上的细胞进行流式细胞术分析。荧光信号(FL-2)用590 nm带通滤波器用488 nm激发激光检测,每样采集10万个细胞。在获得后,用细胞Quest法测定FL-2阳性细胞的比例来估计寄生虫血症.

生长抑制(%抑制)计算如下:

%Inhibition=[1%Parasitemia(Treatment)/%Parasitemia(Control)]100.

统计分析

在条形图中,集成电路的数据503种独立实验的平均±标准差(SD)分别表示为两次试验的值和百分比。61...集成电路50数值的计算使用原始专业评估,2008 b图形和分析软件。除经统计学处理外,差异均有统计学意义(P<0.05)。

生长进程测定

支架效应7用稀释为0.5%的寄生虫血症和2%的红细胞压积(相当于IC)的浓度来评价寄生虫的生长进程。50在大院里。环状培养(12-14 HPI)在96孔板中一式两份,溶剂为对照。在24,48和56 HPI时监测寄生虫的无性血液期的进展。在每个时间点,Giemsa染色的薄血涂片P. [医]恶性疟原虫在光镜下测定了5,000多个红细胞(RBCs)的数量。61.

HepG 2细胞毒试验

采用96孔微滴度板对HepG 2细胞进行细胞毒性试验,接种密度为每井3万细胞,并可在37°C下过夜粘附,如前所述。61...支架治疗HepG 2细胞7在50μM浓度下24小时。用活细胞切割MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴)(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)的细胞毒性效应,如Bathula,C.等人...和Hati,S.等人.62,63...晶体在DMSO(二甲基亚砜,Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)中溶解.用分光光度计在590 nm波长处读出比色法。

细胞内Na的测定+水平P. [医]恶性疟原虫

胞内钠离子+]i在37°C下,用胞内钠测定浓度。+敏感染料,绿钠(分子探针,Invitrogen)。将纯化的Percoll寄生虫重新悬浮在不完全rpmi中,在37℃下用10μM钠绿负载30 min,用不完全rpmi洗涤两次,用支架处理。7四个小时。治疗后,用1 XPBS清洗寄生虫。绿钠的激发波长为507 nm,发射波长为532 nm。用共聚焦显微镜和流式细胞术对标记的寄生虫进行分析。

膜组分ATP酶活性恶性疟原虫在脚手架存在的情况下

利用孔雀绿磷酸盐生物分析试剂盒(生物分析系统,POMG-25H),通过测定孔雀石绿、钼酸盐和游离正磷酸盐(PO)之间形成的绿色配合物(PO),对疟原虫膜组分的ATP酶活性进行了测定。43−)在ATP酶反应过程中释放。如前面所述,遵循了协议。64...将纯化的滋养体用0.1xPBS加蛋白酶抑制剂鸡尾酒冷冻解冻,然后在4°C下以13,000 rpm离心30 min。得到的球团(膜部分),然后在钠中洗涤三次。+-耗尽分析缓冲液(50毫米Tris-HCl,20毫米K+,2毫米毫克2+,100毫米钠+)在它被立即用于检测之前。膜组分在任何一种高[Na]中再悬浮+溶液(100毫米)或低[钠]+]溶液(0.5毫米),在没有不同浓度的Spiro支架或存在不同浓度(25 M和50 M)的情况下7...在37°C下孵育,20 min后在平板阅读器(655 Nm)上测定显色。

PfATP 4的同源建模

.的顺序恶性疟原虫从质体数据库(PF3D7_1211900)获得阳离子ATP酶PfATP_4。利用Modeller对PfATP 4三维结构进行了同源性建模,该程序是一个在满足空间约束条件下对蛋白质结构进行比较建模的程序。65,66,67...兔钙2+ATP酶(PDB ID:2 DQS)是以PfATP 4的结构类似物为模板。选择了最佳结构模型,并使用PyMOL分子图形系统(1.7.4.5 Schr dinger,LLC)对其进行可视化。68...利用ModRefiner算法对结构进行了进一步的细化,这是一种用于原子级高分辨率蛋白质结构细化的算法。69...由此产生的精细结构模型显示,rmsd和TM-分数分别高达0.567和0.9975,随后用于对接研究。结果模型的质量验证结果表明,在Ramachandran地块中,92.1%的残余物位于最有利的区域。

支架6&7和PfATP 4的分子对接

支架的化学结构67用ChemDraw Ultra 12.0.2绘制,然后用Chem3D Pro 12.0生成能量最小化的三维模型,如Yadav,P.等人.70...利用AutodockVina工具1.5.6对支架进行分子对接研究,使支架的抑制活性合理化。67诉PfATP 470,71...根据SiteHound-web预测的配体结合口袋,基于化学探针与pfATP 4结构之间的总相互作用能,我们在构建虚拟对接网格时确保了活性位点残基的覆盖。72...结合这些预测残差,利用AutoDock工具的AutoGrid模块,构建了能量中心x、y、z坐标分别为38.596、−12.341和57.353的24×28×24虚拟三维网格。根据支架的最负自由结合能选择高分对接构象,用PyMOL分子图形系统观察与PfATP 4氨基酸残基的极性接触(如果有的话)。

自噬标记物、自噬相关蛋白的免疫染色

自噬相关蛋白ATG8是一种已知的自噬过程标记物。在自噬过程中,pfATG8与晚期内质体标记pfRAB 7共定位。41,42,43...脚手架的作用研究7共同定位,P. [医]恶性疟原虫用脚手架处理含裂体的培养7溶剂单独涂抹在玻璃玻片上,干燥后用甲醇固定,用抗PfATG8兔血清和稀释1:50和1:100的抗PfRAB 7大鼠血清探测,如Agarwal,S.等人...还有Iyer,G.R.等人.73,74...1小时孵育后,用PBS冲洗3次,用Alexa 594结合山羊抗兔IgG抗体稀释1:500或稀释1:200抗鼠抗大鼠IgG抗体,用DAPI抗Fade试剂(美国分子器件)进行核染色,孵育1h。利用奥林巴斯细胞三维成像软件在奥林巴斯FV 3000共焦显微镜下获取图像。两个通道(红色:PfATG8;绿色:PfRAB 7)的共定位分析是在一个像素的基础上使用相同的软件进行的。在散射图中,根据通道的强度水平绘制图像中的每个像素,然后估计Pearson的相关系数(R)。利用Imaris显微图像分析软件获取图像的三维视图。为了评估‘r’,我们使用软件中提供的感兴趣区域(ROI)工具选择了一个感染和染色的RBC。从这个ROI区域来看,r值是由ROI统计软件给出的。61.

JC-1染色法测定线粒体膜电位

MitoProbe™JC-1染料(分子探针,生命技术)的荧光依赖于线粒体膜电位状态。当线粒体膜电位(ΔΨm)丢失时,染料仍以单体形式存在(最大发射波长为530 nm,绿色荧光),但正常或较高的膜电位会形成jc-1聚集体(发射峰在590 nm处,红色荧光)。45...如前面所述,遵循了协议。61...简略地说,寄生虫在使用强力支架治疗后7用2μM JC-1在37°C下孵育30 min,用PBS冲洗两次,立即用奥林巴斯FluoView FV 3000共聚焦显微镜成像。在每个条件下,对随机选择的100种寄生虫的红绿荧光比值进行了估算。为了估计每个通道的荧光强度,使用奥林巴斯细胞Sens尺寸成像软件提供的感兴趣区域(ROI)工具选择了一个感染和染色的红细胞。从这个ROI区域,荧光强度是由ROI统计软件给出的。用这些数值计算了每一组寄生虫培养的100个RBCs的红绿荧光比值。

总结如果脚手架7不干扰jc-1在无细胞体系中的聚集,在无支架存在的情况下进行荧光发射光谱。7...按照Perelman,A.等人.75...在<1%(0.065%)或35%二甲基亚砜存在下,JC-1被溶解到2μM。用Varioskan Flash多模阅读器(Thermo Science)测定了488 nm处的发射光谱。

TUNEL介导的DNA片段化评估

用apo-brdu™TUNEL分析试剂盒(分子探针,Invitrogen)对处理后和未处理寄生虫的dna片段进行检测,并进行流式细胞术分析。61...简单地说,样品用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich,Fluka化学品)和0.0075%戊二醛固定在PBS中30分钟,用PBS洗涤,用0.01%Triton-100渗透。随后,rbc与tdt酶,brdUtp和dh的dna标记混合在一起。2在37°C恒温水浴中保温2h。在潜伏期结束时,用试剂盒中提供的漂洗缓冲液,在2000转/分时,清洗标有标签的寄生虫5分钟。用荧光染色分析凋亡细胞。R488染料标记抗BrdU抗体1:100稀释30 min,RT。然后用流式细胞仪和共聚焦显微镜对样品进行分析。




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