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肿瘤坏死因子抑制对SKG小鼠脊髓炎症和脊髓强直的影响

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发表时间:2019-12-01 15:26作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

肿瘤坏死因子抑制对SKG小鼠脊髓炎症和脊髓强直的影响

摘要

为预防强直性脊柱炎脊髓的进展,建议尽早开始TNF-抑制剂的治疗。然而,这些结果在以前的临床研究中是不一致的。在此,我们研究了肿瘤坏死因子(TNF)单独抑制在小鼠关节炎发展过程中对脊髓进展的影响。我们给8周龄的SKG小鼠注射了curdlan(curdlan组).第一次注射阿达利莫单抗(ADA组)后3周和9周注射阿达利莫单抗。ADA组在第一次注射阿达莫单抗后3周,其周围性关节炎的临床评分下降。采用正电子发射断层扫描-磁共振成像和组织学检查,可观察到脊髓炎症在curdlan组,在ADA组明显减少。而OsteoSense 680 EX和骨代谢相关细胞因子如核因子受体激活因子-κB配体、骨保护素、Dickkopf-1和除IL-17A外的硬化剂水平在两组间差异无显着性(P>0.05)。结论单用TNF抑制剂可降低关节周围关节炎评分和脊髓炎症反应,但对脊髓成骨细胞活性无明显影响,对脊柱强直影响不大。

导言

强直性脊柱炎(AS)是关节炎的慢性炎症形式,主要影响脊柱和骶髂关节。AS是脊椎炎(SpA)的原型,其特征是同生植物和轴向骨骼的强直。1...过度的骨形成是影响疾病预后的一个重要因素,因为它会影响脊柱的活动。这就扰乱了患者的日常活动,降低了患者的生活质量。2...AS中骨形成的确切病理过程尚不清楚;然而,脊髓炎症可能与不受控制的骨性增生有关,往往导致受影响关节的融合。3.

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在AS的炎症反应中起重要作用.此外,AS患者滑膜和血清中的肿瘤坏死因子-α水平升高。4...肿瘤坏死因子-α抑制剂治疗可明显改善对常规治疗无反应的患者的功能结局、疾病活动和生活质量。1...然而,先前的研究报告了关于肿瘤坏死因子-α抑制剂治疗对AS患者脊柱X线进展的影响的不一致的发现。5,6,7,8,9在银屑病性关节炎和类风湿关节炎(RA)中,骨侵蚀占主导地位的银屑病和类风湿关节炎(RA)的结构损伤和疾病活动得到了有效的预防。10,11.

肿瘤坏死因子-α在AS骨形成和炎症中的作用尚未完全阐明。前人体内研究表明脊柱的骨形成和炎症是不耦合的。12,13表明骨形成受骨形态发生蛋白、转化生长因子和wnt蛋白的控制。14,15...同时,炎症可能通过对AS患者的炎症应激进行不适当的修复而触发同步植物的产生。16最近的临床研究表明,肿瘤坏死因子抑制剂减缓了脊柱X线检查的进展,特别是在早期AS患者没有同步体的情况下。17,18,19,20,21...然而,TNF抑制剂的作用很难清楚地证实,因为在临床研究中,包括非甾体抗炎药物在内的标准治疗是允许的。

skg小鼠在全身暴露于葡聚糖后会发展为慢性自身免疫性炎症性关节炎。22...SKG小鼠ZAP-70的sh2结构域存在一个基因突变,它是T细胞中的一个关键信号转导分子。23,24因此,SKG小鼠体内存在过量的致艺术T细胞。22...这导致慢性关节炎和关节外表现.虽然SKG小鼠最初被用作RA的模型,但是Ruutu等人...报道说,系统性注射科德兰后,SKG小鼠出现了SpA的临床特征,包括骶髂关节炎、脊椎炎症、末梢炎、外周关节炎、葡萄膜炎和肠道炎症。25...因此,SKG小鼠可作为建立的动物模型,观察TNF抑制对脊髓炎症的治疗作用。

在本研究中,我们旨在研究TNF抑制剂在周围期关节炎发生时对SKG小鼠脊髓炎症和骨形成的影响。

结果

SKG小鼠发生骨关节炎表型

如图所示。1B所有SKG小鼠在第一次腹腔注射3-mg科德兰后2~3周内,在周围关节出现炎症性关节炎,而注射磷酸盐缓冲液的SKG小鼠则没有任何炎症特征。注射凝乳素10周后,观察到尾部发红、肿胀和畸形,上身弯曲(见图)。1B).

图1
figure1

凝乳素注射SKG小鼠的实验设计及表型研究。(a)实验设计。(b注射凝乳素后2周内可观察到眼、鼻周围的周围关节炎和脱发情况,注射凝乳素10周后观察其尾部和脊柱的畸形情况。(c)外周关节炎的临床评分。A中的误差条表示平均值±SEM,*p<0.05,**p<0.01。简称:IP,腹腔注射;curdlan+A,curdlan+adalimumab。

观察了阿达利莫单抗对注射磺胺嘧啶(SKG)小鼠周围性关节炎的影响.每周观察显示,阿达利莫单抗治疗小鼠外周关节炎的临床评分明显改善,从注射阿达利莫单抗后2周开始(如图所示)。1C)。阿达利莫单抗治疗小鼠第一次注射阿达利莫单抗9周后,对周围性关节炎的疗效持续16周,而未给予阿达莫单抗治疗的小鼠关节炎临床评分不变。

增TH17+注射科德兰的SKG小鼠脾细胞中的细胞群

为探讨磺胺嘧啶(Curdlan)和阿达利莫单抗(Adalimumab)治疗对SKG小鼠T细胞数量的影响,我们观察了BALB/c小鼠、PBS注射SKG小鼠和未经阿达利曼(Adalimumab)治疗的SKG小鼠脾细胞的特性。在未经adalimumab治疗的科德兰注射的SKG小鼠中,脾脏和淋巴结的大小是最大的。2A)。流式细胞仪测得CD3的频率无显着性差异(P>0.05)。+CD4+细胞(CD4)+T细胞)。2B)。白细胞介素-17a显著增加。+细胞(T)H(17细胞)和CD 25的减少+Foxp 3+细胞(T)雷格(细胞)在注射柯德兰后。然而,T的种群H17和T雷格与未用阿达利莫单抗治疗的SKG小鼠相比,科德兰注射的SKG小鼠的细胞没有显著差异(图1)。2B).

图2
figure2

科德兰和阿达利莫单抗治疗对SKG小鼠脾脏和T细胞数量的影响。(aBALB/c小鼠、PBS注射SKG小鼠和注射阿达莫单抗的SKG小鼠脾脏和淋巴结的大体标本。(b)流式细胞仪图显示CD3的比例。+CD4+、IL-17A+,以及CD 25+Foxp 3+脾细胞间的细胞。*p<0.05。简称:curdlan+A,curdlan+adalimumab。

adalimumab治疗减少18PET-MRI对F-FDG的摄取及脊髓组织中炎性细胞的浸润

18F-FDG在小鼠脊柱摄取PET-MRI显示如图所示.3...柯德兰注射的SKG小鼠表现出更高的水平18F-FDG摄取优于PBS注射SKG小鼠.然而,ROIS的定量结果表明,与未经治疗的SKG小鼠相比,阿达莫单抗治疗组的胸椎SUVR明显降低。这些结果在组织学检查中得到了进一步的证实,显示了注射科德兰的SKG小鼠椎体内炎性细胞的积累。在阿达利莫单抗治疗的小鼠中未见炎性病变。此外,注射kkg小鼠的致病性病变主要由肿瘤坏死因子-α组成。+和F4/80+巨噬细胞。这些损伤在adalimumab治疗的小鼠中减少了(见图)。3).

图3
figure3

阿达莫单抗治疗对脊髓炎症的影响。18用正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)、苏木精和伊红染色(白色箭头,×200)摄取F-FDG。脊髓组织免疫荧光染色(黑箭头)图像。*p<0.05。缩写:curdlan+A,curdlan+adalimumab。

adalimumab治疗对kkg小鼠脊髓成骨细胞活性的影响

用荧光法测定了羟基磷灰石对成骨细胞活性的影响。体内双膦酸盐显像剂(OsteoSense 680 Ex)图形4A显示了小鼠脊柱荧光信号的代表性生物分布。与PBS注射的SKG小鼠相比,柯德兰注射SKG小鼠具有更高的荧光信号,骨形成明显增加.然而,adalimumab处理并没有降低成骨细胞的活性,这是进一步确定的定量分析(图一)。4A)。骨代谢相关细胞因子在显像时的血清水平如图所示。4B...注射凝乳素的SKG小鼠血清OPG水平显著高于PBS注射的SKG小鼠,而RANKL水平无明显差异,提示注射凝乳素的SKG小鼠具有抑制破骨的作用。然而,注射阿达利莫单抗的SKG小鼠不能恢复OPG、RANKL、DKK-1和硬化剂的水平,这与影像学结果相一致。考虑到T的增加H17+在注射柯德兰的SKG小鼠脾细胞中,我们还测定了血清IL-17A的水平,并证明与PBS或curdlan注射SKG小鼠相比,Adalimumab处理的SKG小鼠血清IL-17A水平升高(见图二)。4B).

图4
figure4

adalimumab对脊髓成骨细胞活性的影响。(a) 体内注射OsteoSense 680 EX探针后的成像及荧光值的定量分析。(b)BALB/c小鼠、PBS注射SKG小鼠和给予阿达莫单抗治疗的SKG小鼠血清中骨代谢相关细胞因子和IL-17A水平。*p<0.05,**p<0.01。缩写:NS,无意义;curdlan+A,curdlan+adalimumab。

讨论

以前的临床研究5,6,7,8研究表明,肿瘤坏死因子抑制并不能阻止AS患者的脊柱X线改变,而肿瘤坏死因子抑制剂则能减缓结构损害的进展,特别是在早期不伴苔藓的AS患者中。17,18,19,20,21...此外,一项MRI研究显示脂肪浸润(炎症后变化)可预测新的同步植物的骨形成。26提示早期减轻脊髓炎症的重要性,为AS新骨形成的潜在起点。然而,以往的临床研究并没有禁止维持非甾体抗炎药物,这些药物很难仅仅验证TNF抑制剂的作用。因此,我们研究了肿瘤坏死因子(TNF)抑制对周围期关节炎患者脊髓炎症和骨形成的影响。

在本研究中,我们在周围期(第一次注射curdlan后3周)注射阿达利莫单抗,并观察到肿瘤坏死因子(TNF)在这一点上抑制了随后注射的kkg小鼠的脊髓炎症。此外,阿达利莫单抗治疗小鼠椎旁组织中炎性细胞浸润不明显.然而,TNF的抑制并没有降低脊柱成骨细胞的活性,尽管炎症反应在本研究中有所减少。高成骨细胞活性与AS的骨增殖及继发强直有关。27...用近红外荧光双膦酸盐标记的双膦酸盐探针(OsteoSense 680 Ex)能通过成骨细胞与新合成的羟基磷灰石结合。28因此,荧光强度指示成骨细胞的活性,随后的骨增殖进一步代表AS的严重程度。29...在此,阿达利莫单抗治疗并没有降低荧光双膦酸盐成像评估的成骨细胞活性,尽管脊髓炎症的影响。

OPG是一种细胞外细胞因子受体,由成熟的成骨细胞分泌,通过抑制破骨细胞的激活而促进骨形成。30,未被阿达利莫单抗对注射的SKG小鼠的抑制作用。此外,血清DKK-1和硬化剂均不受阿达利马布治疗的影响,提示存在其他与TNF无关的骨增殖途径。在研究中,我们发现阿达利莫单抗治疗的SKG小鼠血清IL-17A水平升高.IL-17A,一种具有破骨潜能的细胞因子31,已被报道通过促进间充质干细胞群中的成骨细胞分化,以及随后通过激活JAK 2/STAT 3信号通路而激活成骨细胞来加速成骨过程。32...沃尔特斯HM等人.33此外,还报道了用可溶性TNF受体抑制TNF信号的重组蛋白依那西普治疗青少年特发性关节炎患者血清IL-17A的升高。因此,除Wnt信号外,adalimumab诱导的IL-17A通路可能是TNF不依赖骨增殖的途径之一。

T雷格/TH17失衡与自身免疫性关节炎的发病机制34...据报道TH17细胞是主要的致艺术细胞,在自身免疫性关节炎(如RA、银屑病性关节炎和AS)患者的血液中显著升高。35,36...T族雷格SPA还没有对细胞进行全面评估,但有几项研究显示T细胞减少了。雷格其他自身免疫性疾病患者的外周血中37,38,39...此外,先前的研究表明,肿瘤坏死因子-α导致T细胞的失败。雷格通过降低Foxp 3基因的表达抑制效应细胞的增殖,在RA等自身免疫性关节炎条件下,用tf-α抑制剂可以逆转这种抑制作用。40,41...在我们的研究中,脾细胞分析显示IL-17A显著增加。+细胞(T)H17)和CD 25减少+Foxp 3+细胞(T)雷格)与PBS注射的SKG小鼠比较.这一发现与以前的研究结果是一致的。35,36,37,38,39然而,adalimumab治疗没有显着地恢复T。雷格/TH17.在注射科德兰的SKG小鼠中观察到不平衡。这种现象的一个可能的解释是肿瘤坏死因子抑制剂在此模型中的抗炎作用主要由免疫细胞如巨噬细胞、肥大细胞或中性粒细胞介导,而不是由T细胞介导。42,43.

我们的研究有几个局限性。首先,注射阿达利莫单抗(在周围期关节炎期间使用)可能还不够早,不足以抑制脊柱骨形成,尽管脊髓炎症减轻了。然而,在实际的临床情况下,关节炎的识别时间可以被认为是最早开始治疗的时间。第二,在本研究中未明确阐明骨增殖过程的机制。如上所述,adalimumab治疗并不降低成骨细胞的活性(OsteoSense 680 Ex),而且也不影响骨代谢相关的细胞因子水平。需要进一步的研究来阐明SpA脊柱骨形成的机制。第三,完全人源化的抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(Adalimumab)的剂量或治疗间隔可能不足以或不足以在小鼠模型中显示对肿瘤坏死因子-α的抑制作用。然而,在这项研究中,阿达利莫单抗治疗改善了外周关节炎和脊髓炎症。此外,先前的研究还显示了adalimumab对雌性BALB/c(H-2d/d)大鼠等几种动物模型的抗炎作用。44胶原诱导的小鼠关节炎模型45,Sprague-Dawley大鼠46,而不是人类转基因动物模型。

总之,早期使用肿瘤坏死因子抑制剂可显著减少注射kkg小鼠的周围性关节炎和脊髓炎症,但几乎无法阻止脊柱骨的形成。

材料和方法

小鼠

具有BALB/c背景的雌性SKG小鼠最初是从日本大阪大学S.Sakaguchi博士那里获得的。22...老鼠被保存在位于韩国首尔的Asan生命科学研究所(Asan Institute For Life Sciences)的无病原体设施中。所有动物手语都是根据阿桑生命科学研究所动物照料和使用机构委员会批准的议定书(2015-14-135)进行的。

实验时间表

如图所示。1A8周龄雌性SKG小鼠分别于0和2周分别腹腔注射0.2 mLPBS(n=20)或0.2 mLPBS(对照组,n=5)悬液3 mg curdlan(日本瓦科)。8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射PBS 0.2mL,对照组5只。所有小鼠均接受长达16周的监测。注射kkg小鼠半数(n=10)接受adalimumab治疗(体重10 mg/kg)(完全人源化抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体,abbvie,美国)。47第一次注射柯德兰后3周和9周。

周围性关节炎的临床评分

每周监测一次周围性关节炎的临床特征,评分为0-4(0=无肿胀,1=足尖轻度肿胀和红肿,2=足部严重肿胀和红肿,3=手腕或踝关节严重肿胀和红肿,4=手腕或踝关节及手指严重肿胀和红肿)。25...受影响的关节总数。

脾细胞制备

注射柯德兰后16周,用100μm尼龙滤器过滤脾脏,用红细胞溶解缓冲液溶解滤过细胞中的红细胞(BioLegend,CA,USA)。用离心法收集细胞。用固定活性染料排除死亡细胞(eFluor 506;eBioscience,CA,美国)。获得流式细胞术数据(FACS CantoⅡ;BD生物科学,CA,USA),并进行分析(Flow Jo软件;TreeStar,OR,USA)。

表面和细胞内染色及流式细胞术

用抗小鼠CD 16/32(BioLegend,克隆:93)阻断FC受体,表面标记物染色如下:FITC结合抗CD4(BioLegend,克隆:RM 4-5),BV 421-结合抗CD3(BioLegend,克隆:145-2C11)和APC/Cy7结合抗CD 25(BioLegend,克隆:3C7)。细胞因子和转录因子经固定和通透性后用以下抗体染色:PerCP/Cy5.5结合抗RORγt(BD生物科学,克隆:Q31-378),PE/Cy7-IL-17A(BioLegend,克隆:TC11-18H10.1)和AlexaFluor 647结合抗-FOXP 3(生物遗传,克隆:150 D)。

用Luminex多重细胞因子法和单细胞因子法分析骨代谢相关细胞因子

第一次注射柯德兰后16周获得血清。血液在室温(RT)下至少凝血1h,16,000×g离心15 min(4°C),测定骨代谢相关细胞因子(OPG)、Dickkopf-1(DKK-1)、硬化剂和核因子受体激活因子-kappa B配体(RANKL),用小鼠-骨磁珠板(Milliplex map,EMD Milli孔隙Corporation,MA)测定血清浓度。检测缓冲液稀释血清(1:1),用96孔滤底板与抗体交联的聚苯乙烯珠混合,4°C浸泡一夜,用鼠骨检测抗体在RT下孵育1h。在不吸入剂的情况下,加入链霉亲和素-藻红蛋白,在RT中孵育30 min。随后,该板被另外洗两次,并重新悬浮在鞘液中。所有样品用标准(7点稀释剂)和缓冲液对照的重复测量.使用Luminex系统(Bio-plex 200;Bio-Rad Corp.,CA,美国)进行定量分析。

对各组小鼠血清中IL-17A进行检测,用西莫阿HD-1分析仪(美国马里兰州全特莱)测定小鼠血清中IL-17A的含量。(Gyeonggi-do,韩国)。IL-17A的检出限为0.0110 pg/mL,经8倍的样品稀释后,检出限为0.0110 pg/mL。Lod的测定采用平均空白信号+2.5SD。

脊柱组织学与免疫荧光染色

注射后16周,对照组和治疗组小鼠脊柱固定在10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋。用乙二胺四乙酸脱钙。脊柱切片(4μm)行苏木精和伊红染色。

免疫荧光染色如前所述48...简单地说,使用Opal方法(美国MA的Perkin Elmer),对每一张幻灯片依次应用初级抗体。切片在二甲苯中分离,在乙醇中再水化。用微波处理柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)进行抗原提取。用兔抗肿瘤坏死因子-α(1:500)原代抗体在RT加湿腔中孵育1h,再用Opal聚合物HRPms+Rb检测。用OPAL 540(1:100)显示肿瘤坏死因子-α.将玻片置于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中,微波处理后,与兔抗F4/80抗体(1:500)在RT加湿室中孵育1h。然后用蛋白石聚合物HRP、MS+Rb进行检测。然后用Opal 620(1:100)显示F4/80,并将其置于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行微波处理。用多光谱Vectra扫描仪和定量成像系统(PerkinElmer)对染色片进行扫描。

正电子发射断层扫描-磁共振成像(PET-MRI)

第15周,对小鼠进行全身序贯PET-MRI检查(纳米扫描PET-MRI;匈牙利Mediso有限公司)(图一)。1A)。放射性配体氟18-氟脱氧葡萄糖18禁食12小时后经尾静脉注入F-FDG;0.2MCI/kg,注射放射配体后40 min开始扫描。MRI检查20 min后,PET检查10 min。根据上述方法48,取全身连续轴向切片(1mm)。扫描参数为:重复时间=25s,有效回波时间=3.4ms,视场=64 mm,激发次数=1,频率=128,相位=128。注射后60~70 min动态采集PET扫描数据。18F-FDG所获得的PET图像被重建使用三维全探测器模式,以MRI为基础的衰减收集,能量水平为250-750 kev和0.5毫米体素尺寸。三维感兴趣区(ROIS)是用70%-100%的最大强度阈值绘制在关节上的,而ROIS中的平均信号水平则由一名技术员测量。图像计数/像素转换为放射性浓度,然后对注入的放射性进行校正。结果以标准摄取值比值(SUVR)表示。

荧光成像体内双膦酸盐

在注射柯德兰后16周,用荧光法对小鼠进行全身成像。体内生产双膦酸盐(OsteoSense 680 ex;Mediso Ltd.,匈牙利)。经尾静脉注射双膦酸盐剂OsteoSense 680 ex(PerkinElmer),剂量为2 nmol/100μL pBS。同一天后头发被移除。24小时后,在吸入麻醉(Forane)下,使用激发和发射波长分别为675和720的IVIS光谱系统(Perkin Elmer)获得荧光图像。采集后,图像光谱不混合(LiveImageSoftware;CariperLifeSciences,MA,美国)。放置并测量相同面积的ROIS,作为平均辐射效率。

统计分析

所有统计分析均采用GraphPad Prism 5(GraphPad软件,La Jolla,CA,USA)进行。为了比较两组,曼-惠特尼U进行了测试。多组间比较,采用单因素方差分析和后自组织分析。结果为均值(SEM)的均值±标准差。错误条表示扫描电镜。P值<0.05,有统计学意义。*p<0.05,**p<0.01。




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