宿主免疫应答可能参与了儿童的发病机制。肺炎支原体肺炎(MPP)在本研究中，我们研究了对照组、轻度MPP和重度MPP儿童细胞因子水平的变化，以确定细胞因子信号是否与MPP有关，是否与疾病严重程度相关。用Luminex系统测定88例MPP患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)和26例异物吸入(FB)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中的13种细胞因子。采用线性判别分析法建立轻度MPP和重度MPP的预测模型。在线性判别分析中，我们观察到重度MPP组、轻度MPP组和对照组几乎完全分离。11种细胞因子在MPP患儿中显著升高，7种细胞因子与MPP严重程度呈显著上升线性相关。与对照组相比，轻度组和重度组IFNγ/IL4比值和IFNγ/IL 13比值均升高。我们的结果表明，儿童MPP可以改变与疾病严重程度相关的BALF细胞因子信号，并具有明显的气道分子表型，从而提高Th1/Th2比值。

肺炎支原体(MP)是儿童社区获得性肺炎(CAP)最常见的病原体之一。1,2. 肺炎支原体肺炎(Mpp)通常是自我限制的，可以用大环内酯有效地控制。3...然而，严重的MPP经常发生，并伴有胸腔积液、肺不张和肺实变等并发症。根据文献和我们的临床经验，补充皮质类固醇可以有效地改善这些严重感染儿童的临床症状和胸部X线表现。4,5,6...虽然这种疾病的严重程度似乎与宿主对感染的免疫反应程度有关。7MPP的发病机制尚不清楚。

本研究的目的是确定MPP患儿细胞因子的异常分布是否与疾病严重程度相关。支气管肺泡灌洗液(BALF)来源于病变的肺组织表面，直接反映受感染的局部肺组织的炎症和免疫反应。本文采用线性判别分析方法，对儿童重度MPP与轻度MPP及健康对照组进行鉴别。这是一种对BALF中细胞因子水平进行高维数据还原的监督方法。这些细胞因子是根据其与肺感染相关的MPP或免疫细胞的生物学相关性来筛选的(见附表)。沙一)。MPP患儿中有11种细胞因子高于对照组。7种细胞因子可能与MPP的严重程度密切相关，其中5种是促炎细胞因子，可能导致这些儿童所经历的许多症状。进一步研究儿童MPP BALF中的免疫改变可能为该病的发病机制提供更多的临床线索。

临床标本基本数据

儿童临床资料列于表中1...重度MPP患儿16例，轻度MPP患儿16例，均为肺叶性肺炎。29例轻度MPP患儿合并节段性肺炎。18例FB患儿在异物吸入当天行支气管异物切除治疗。8例FB患儿在支气管异物切除后1周复查。FB组儿童明显低于MPP组。轻度MPP组与重度MPP组发热持续时间、C反应蛋白(CRP)、外周血中性粒细胞计数及外周血淋巴细胞计数差异有显着性(P<0.05)。

细胞因子浓度与线性判别分析

用Luminex系统测定了BALF标本中肿瘤坏死因子α、IL6、IL1β、MCP 1、IL 4、IL 10、IFNγ、IL 13、IL5、sCD40L、Flt3L、IL2和IFNα2的含量。2).

对FB、轻度MPP和重度MPP患儿进行线性判别分析。1A)。利用所有值的方差，导出了两个判别函数，占数据集方差的100%。结果表明，三组均有较好的分离效果。判别分析结果如图所示。1B...原始分组法能正确识别96.2%的对照组、75.6%的轻度MPP患儿和65.1%的重度MPP患儿。交叉验证组法能正确识别88.5%的对照组、66.7%的轻度MPP患儿和53.5%的重度MPP患儿。逐步判别分析显示Flt3L、IFNα2和IL1β对轻度MPP、重度MPP和FB儿童的分化作用最大。这三种细胞因子对这三组细胞因子的鉴别准确率为72.8%(交叉验证分析的准确率为71.9%)。

线性判别分析结果。(a)由13个因子生成的判别函数的散射图。每个数据点代表单个BALF样本。图中描述了重度MPP儿童(红色方)、轻度MPP儿童(绿色三角形)和FB儿童(蓝色圆圈)的聚类和清晰分离。深蓝色钻石代表组质心。(b)显示了原分组案例和交叉验证分组案例的分类准确性。

全尺寸图像

MPP组细胞因子增加

我们进一步比较了两组之间的蛋白质浓度的统计分析。BH调整前后的p值列于表中。3...首先，轻度MPP患儿和重度MPP患儿均有11种细胞因子的表达。α、IL6、IL1β、MCP 1、IL4、IL 10、IFNγ等7种细胞因子在轻度MPP组较对照组明显升高，重度MPP组进一步升高。这些细胞因子在所有各组中均有逐渐增加的趋势，这些变化在BH调节后也有显着性变化。第三，轻度MPP组和重度MPP组IL13、IL5、sCD40L和Flt3L细胞因子均显著高于对照组。但重度MPP组与轻度MPP组儿童差异无显着性(P>0.05)。最后，轻度MPP患儿IL2和IFNα2水平与对照组比较无显着性差异(P>0.05)。但在重度MPP患儿中，两者均显著升高，这可能有助于区分重度MPP与轻度MPP及对照组。

值得注意的是，α、IL6、IL1β、MCP 1、IL4、IL 10和IFNγ在轻度MPP中明显升高，在重度MPP中进一步升高，提示这些蛋白可能在儿童MPP的发生和严重程度中起重要作用。为了比较这些蛋白的表达模式，我们用聚类分析方法对结果进行了分析。2A)。表达模式证实轻度MPP高表达，重度MPP表达最高，对照组最低。在所有细胞因子中，MCP 1水平最高。肿瘤坏死因子α的表达模式与IL 6相近，而IL 1β、MCP 1和IL 4的表达模式与IL 6和IL 6相似。IL 10和IFNγ的表达模式非常接近。

支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α、IL6、IL1β、MCP 1、IL4、IFNγ和IL 10的表达水平分析(a)聚类分析结果显示各组具有代表性的表达模式。(b)蛋白质相互作用(PPI)网络图，显示了蛋白质之间相互关系的证据。已知或预测的三维结构的蛋白质显示在圆圈内。交互证据的类型如下：黄线代表文本挖掘证据；黑线代表共同表达证据；紫色线代表实验证据。(c)蛋白质相互作用类型的PPI网络图。箭头线代表正动作，T型线代表负动作，圆头线代表未指定动作.黄线表示转录调节，红线表示抑制，蓝线表示结合，灰色线表示反应。

全尺寸图像

为了进一步探讨肿瘤坏死因子α、IL 6、IL 1β、MCP 1、IL 4、IL 10和IFNγ之间的相互作用，我们利用String数据库分析了这些细胞因子水平。这些细胞因子之间有密切的相互作用(图一)。2)和无花果。2B显示了相互作用的证据。文本挖掘证据(黄线)可以在这两种细胞因子之间找到。肿瘤坏死因子α和MCP 1与其他细胞因子的相互作用基于共同表达的证据(黑线)。肿瘤坏死因子α和干扰素γ(紫色系)之间也有实验证据。图形2C显示了两种细胞因子之间的紧密分子作用网络。其中大部分为转录调控(黄系)，只有部分存在蛋白质-蛋白质反应(灰色系)。某些细胞因子之间的相互作用不明确，在不同的情况下可能是积极的或消极的作用。

MPP患儿Th1/Th2平衡

MPP患者炎症因子的争论主要集中在Th1/Th2平衡上8,9...图形3A研究了Th1相关因子IFNγ和Th2相关因子IL4对Th1和Th2细胞分化以及Th1和Th2细胞平衡的影响。IFN、γ和Tbet促进Th0向Th1的分化，IL4和GATA 3促进Th0向Th2的分化。为探讨MPP患儿支气管肺泡灌洗液中Th1/Th2平衡情况，计算了干扰素γ/IL4比值。3B，c)。轻度MPP组和重度MPP组IFN-γ/IL4比值均明显高于对照组(图4)。3B，p[医] < 0.05) while there was NO significant difference between mild MPP and severe MPP groups. We combined the results of mild MPP group and severe MPP group as the results of MPP group. The IFNγ/IL4 ratios significantly increased in MPP group compared to control (Fig. 3C，p[医] < 0.01). As IL13 is a Th2 related cytokine expressed in lung, the ratios of IFNγ/IL13 were also calculated. Similarly, the ratios of IFNγ/IL13 in mild MPP group and in severe MPP group rose significantly compared with control group (Fig. 三维空间，p[医] < 0.01) while there was NO significant difference between mild MPP group and severe MPP group. IFNγ/IL13 ratios significantly increased in MPP group compared to control (Fig. 3E，p[医] < 0.01). These results show that the increase of Th1 related cytokine (IFNγ) is much higher than the increase of Th2 related cytokines (IL4 and IL13) in both mild MPP and severe MPP children.

MPP患儿Th1/Th2比值分析(a)显示Th细胞分化的模型图。(b对照组、轻度MPP组和重度MPP组IFNγ/IL4比值。(c对照组和MPP组IFNγ/IL4比值。(d对照组、轻度MPP组和重度MPP组IFNγ/IL 13比值。(e对照组和MPP组IFNγ/IL 13比值。本雅明-霍奇伯格调整后的结果为：*padj<0.001.0 5，**padj<0.0 1，*padj<0.001.0 1。

全尺寸图像

为了进一步证实这些发现，我们测量了相关因素的mRNA水平。4)。轻度组和重度组γ水平均显著高于对照组(P<0.001)。4A)。重度MPP组与轻度MPP组无显着性差异。与对照组比较，重度MPP组IL4水平显著升高(p=0.0035)，差异有显着性(P<0.0 1)。4B轻度MPP组和重度MPP组IL 13水平无明显变化(图1)。4C)。轻度MPP组和重度MPP组IFN-γ/IL4比值明显高于对照组(P<0.0 5，P<0.0 5)。4D)。重度MPP组IFNγ/IL 13比值显著高于对照组(P<0.0 5)。4E)。MPP组IFNγ水平明显高于对照组(p<0.001)。4F)。MPP组IFNγ/IL4和IFNγ/IL 13比值显著升高(图1)。4i，jP<0.05)。然而，IL4(图4)。4G)和IL 13(图1)。4HMPP组无明显变化。

支气管肺泡灌洗液中干扰素γ、IL4、IL 13、T-bet和GATA 3的表达。(a)对照组、轻度组和重度组γ的mRNA水平。(b)正常对照组、轻度MPP组和重度MPP组IL4 mRNA水平。(c正常对照组、轻度MPP组和重度MPP组IL 13 mRNA水平。(d对照组、轻度MPP组和重度MPP组IFNγ/IL4比值。(e对照组、轻度MPP组和重度MPP组IFNγ/IL 13比值。(f)γ在对照组和MPP组中的表达水平。(g)对照组和MPP组IL4 mRNA水平。(h)IL 13 mRNA在对照组和MPP组中的表达。(i对照组和MPP组IFNγ/IL4比值。(j对照组和MPP组IFNγ/IL 13比值。(k)对照组、轻度MPP组和重度MPP组T-bet mRNA水平。(l)对照组、轻度MPP组和重度MPP组GATA 3 mRNA水平。(m对照组、轻度MPP组和重度MPP组T-bet/GATA 3比值。(n)T-bet在对照组和MPP组中的mRNA水平。(o)对照组和MPP组GATA 3 mRNA水平。(p对照组和MPP组的T-bet/GATA 3比值。P值分别为：*p<0.0 5，**p<0.0 1，*p<0.001.0 1。

全尺寸图像

另一方面，我们测定了转录因子T-bet和GATA 3的mRNA水平。4K-p)。轻度MPP组和重度MPP组T-bet水平明显高于对照组(P<0.05)。4K)。轻度MPP组和重度MPP组GATA 3水平无明显变化(图1)。4L)。轻度MPP组和重度MPP组T-bet/GATA 3比值明显高于对照组(P<0.05)。4m)。MPP组的t-bet水平也显著高于对照组(P<0.01)。4N)。MPP组GATA 3水平无明显变化(图5)。4O)。MPP组T-bet/GATA 3比值显著升高(P<0.01)。4P).

采用多重法检测45例轻度MPP患儿、43例重度MPP患儿和26例FB患儿BALF中的13种细胞因子。据我们所知，以前没有关于MPP患儿BALF细胞因子多重结果的报道。本研究的主要发现是，13种细胞因子有助于分离患有FB、轻度MPP或重度MPP的儿童。11种细胞因子在轻度MPP患儿和重度MPP患儿中均显著升高。肿瘤坏死因子α、IL6、IL1β、MCP 1、IL4、IFNγ和IL 10在轻、重度MPP中均有明显升高趋势。MPP患儿BALF中Th1相关因子和Th2相关因子均增加，而IFNγ/IL4和IFNγ/IL 13比值明显高于对照组。这些结果支持了急性儿童MPP气道中Th1型显性局部反应。

对BALF中13种细胞因子水平进行判别分析。这些细胞因子水平的线性组合导致了重度MPP、轻度MPP和对照组的明显分离。因此，我们得出结论，儿童气道炎症与轻度MPP和重度MPP有关。严重MPP的发病机制复杂，尚不完全清楚。线性判别分析显示对照组、轻度MPP组和重度MPP组的分组相对离散，表明轻度和重度MPP具有明显的表型特征。

轻度MPP组肿瘤坏死因子α、IL6、IL1β、MCP 1、IL4、IFNγ、IL 10等7种细胞因子均显著高于对照组，重度MPP组较轻度MPP组明显升高。即使经过多次比较校正后，这些细胞因子水平与疾病严重程度之间的线性关系仍然具有统计学意义。以往还没有发现将高维数据还原技术应用于MPP患儿BALF炎症细胞因子的研究。然而，ELISA也是一种可靠的方法，并且已经被用于研究MPP患儿的细胞因子水平。8,9,10,11...我们将公布的ELISA结果与Luminex检测结果进行了比较。一些细胞因子水平的类似变化在以前的出版物中也有报道。例如，MPP患者外周血中肿瘤坏死因子α水平升高。12重度MPP13以及那些有耐火MPP的14...肿瘤坏死因子α水平升高与急性MPP有关11，耐火MPP10MPP患儿喘息15...肿瘤坏死因子α也是预测胸腔积液节段性MPP或肺叶MPP的最佳指标。13...另一个研究小组还报告说，重度MPP患儿BALF中IL6水平显著高于对照组。16...难治性MPP患儿IL6水平高于一般MPP儿童。17...徐氏小组报告，MPP组血清肿瘤坏死因子α、IL6、IFNγ和IL 10水平显著高于对照组。18.

MPP患儿BALF中IL4水平升高19，这与它们的高mp负载有关。20...相反，另一组未发现MPP患儿血清中IL4水平有显著变化。21...一些研究小组报告说，儿童mpp患者血清中干扰素γ水平升高。12和难治性MPP儿童14,17...然而，有一个小组报告说，MPP儿童血清中干扰素γ水平低于对照组。15，另一组报告说，mmpp儿童blf中的γ水平与对照组无明显差异。19...赵等人...结果发现，节段性MPP和肺叶型MPP患儿血清中IL4和IFNγ水平显著高于支气管MPP患儿血清中IL4和IFN-γ水平。13...目前报道的结果在MPP儿童中是否增加IL4和IFNγ一直是有争议的。本研究为轻度MPP儿童和重度MPP患儿IL4和IFNγ显著升高提供了依据。关于IL 10，与我们的结果相似，一些小组报告说MPP儿童血清中IL 10水平显著升高。12,15,21，在难治性MPP儿童中进一步上升。17重度MPP儿童13...郭的团队发现MPP儿童BALF中IL 10增加16，这与我们的发现是一致的。

我们用线性判别分析的监督方法提供了儿童重度MPP分子表型的初步证据。在发病机制方面，以往的研究主要集中在肿瘤坏死因子α和干扰素γ的作用上。TNFα水平升高与慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、结节病、哮喘和间质性肺纤维化(IPF)有关。人们发现肿瘤坏死因子α在疾病病理中起着多种作用，包括刺激炎症介质的产生，诱导炎症细胞的聚集，以及引起气道高反应性。22...促炎细胞因子干扰素(γ)在细胞内感染的天然免疫和适应性免疫中起着重要的作用。干扰素γ可以通过其对免疫相关基因的转录调控来协调多种细胞程序。干扰素γ的细胞效应包括上调抗原呈递、病原体识别、白细胞迁移和免疫调节。23...IL 10具有广泛的抗炎作用，包括抗Th1细胞功能。在弓形虫感染过程中，人们发现产生干扰素γ的tbet(+)Foxp 3(−)Th1细胞以自分泌的方式产生保护宿主的IL 10，这在调节免疫病理过程中起着重要的作用。24.

IL 13在肺组织中的高表达，可能在支气管哮喘的发生和加重中起着关键作用。25...作为哮喘的典型特征，IL5激活嗜酸性粒细胞并引起气道炎症。26...MPP患儿IL 5和IL 13水平升高可能与MPP和哮喘的发生有关。结果表明，与无喘息的MPP儿童相比，MPP患儿血清中IL5和VEGF水平明显升高。27...Flt3L是指导FLT 3+淋巴和髓系祖细胞在不同器官中产生DC的关键。体内28...一个小组报告说，与对照组相比，MPP儿童BALF中IL2水平显著升高。19，这与我们的发现是一致的。我们还发现，MPP患儿IL1β、MCP 1、sCD40L和IFNα水平明显升高，目前尚未见有报道。

目前研究的局限性值得讨论。首先，由于FB对照组儿童的年龄明显低于MPP组，所以他们并不是完美的对照组。虽然我们没有看到组间细胞组成的差异29，免疫反应类型可能会随着儿童的成长而改变。由于伦理原因，缺乏健康的儿童对照组，这就提出了年龄是否影响实验结果的问题。第二，虽然IFNγ/IL4、IFNγ/IL 13和T-bet/GATA 3的比值可能反映Th1/Th2细胞的激活率，但IFNγ水平的升高也可能反映其他细胞的活化，包括ILCs、NKT细胞和NK细胞。这些细胞在MPP儿童BALF中的存在和功能有待进一步研究。最后是横截面设计。未来的纵向研究是必要的，以解决MPP儿童是否保持在他们的细胞因子标志随着时间的推移。

总之，目前的研究确定了许多因素增加了儿童MPP，并讨论了多种因素在MPP中的作用。我们证明了轻度MPP和重度MPP的独特分子表型，其特征是BALF炎症增加，这可能为使用多种鉴别器来鉴别儿童重度MPP和轻度MPP提供了支持。我们希望这些发现将有助于更好地理解严重的MPP表型。今后的研究将需要进一步阐明其临床意义。

临床信息

本研究于2016年1月至2017年12月在吉林大学第一医院收治了88例MPP患儿(轻度MPP 45例，重度MPP 43例)和26例异物吸入(FB)患儿。MP感染的诊断依据是血清学检查，并经聚合酶链反应(PCR)证实。轻度社区获得性肺炎和严重社区获得性肺炎是根据上述标准界定的。30,31,32...轻度指年龄<3岁时呼吸频率<70次/分，或≥3岁时呼吸频率<50次/分，进食正常，无脱水。33...重度指年龄<3岁时呼吸频率≥70次/min，或≥3岁时呼吸频率>50次/min，≥3岁，发紫，鼻孔扩张，明显缩窄，厌食和脱水；或呼吸衰竭合并胸腔积液、肺坏死/肺脓肿等肺部并发症；或合并其他系统功能障碍。34...通过CT扫描测量内脏和壁胸膜间的最大积液厚度，将胸腔积液定义为液体厚度>5mm。35...其他呼吸道感染及结核病的儿童在以下测试中被排除在外：纯蛋白衍生物(Ppd)、血液培养、胸腔积液培养、鼻咽抽吸/拭子培养、鼻咽抽吸/拭子病毒抗原检测及血清学检测。衣原体肺炎和军团菌肺炎...患有哮喘、反复呼吸道感染、慢性心脏病、风湿病或免疫缺陷的儿童也被排除在外。治疗前仅从急性MPP患儿中采集Balf样本。只有在有节段性或小叶性肺炎时，才选择轻度MPP患儿。对照组为FB儿童，前6周无呼吸道疾病。在采样点，FB患儿无临床症状，无肺部炎症或感染征象。

伦理认可

根据“赫尔辛基宣言”，这项研究得到吉林大学第一医院机构医学伦理审查委员会的批准(参考号：2016-394)。

知情同意

所有儿童的父母或法定监护人提供书面知情同意。

支气管镜与支气管肺泡灌洗

遵循前面描述的准则30,33,36为诊断和治疗肺叶性肺炎或节段性肺炎，在入院后3天内行纤支镜下支气管肺泡灌洗术。收集后1小时内，在4°C条件下，以1500 rpm缓慢吸气、收集和离心5 min。上清液分为300份，保存在−40°C冷冻箱中。

细胞因子测定

用人细胞因子/化学因子磁性珠板试剂盒(HCYTOMAG-60K，Milli孔隙，Billerica，MA)按照制造商的程序测定细胞因子水平。37...将Balf样品和系列稀释标准加入96口井中，在4°C中过夜孵育。然后，用xPONENT3.1软件在Luminex 200™机上运行平板。利用MILLIPLEX分析5.1软件计算最低检测浓度、最小检测浓度、PG/mL浓度，并对Luminex分析结果进行分析。每种细胞因子的敏感性列在补充表中。S2...该试剂盒的准确性和精密度在补充表中得到了显示。S3...在软件中采用5点Logistic曲线拟合算法测定样品浓度.变异系数(CV)<10%者为最终结果。每个儿童组的简历见补充表。S4.

实时定量PCR

如前面所述，我们执行了qPCR。33,38...简单地说，我们提取总RNA和反向转录RNA使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara).用快速启动通用SYBR Green Master(德国罗氏诊断有限公司)扩增cDNA，并在应用生物系统第一步加仪器(步骤一软件2.2)上用Sangon生物技术公司合成的特异引物进行分析。我们选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参考基因，并使用2。−ΔΔCT方法分析数据，数据表示为相对于gapdh平均值的折叠变化。39,40.

数据分析

线性判别分析是一种多元统计分析方法，它利用研究中的各种特征值来预测群体的隶属度。41,42...为了提供群体间的最佳判别，该过程产生了一组基于变量线性组合的判别函数。我们绘制了这些函数，以显示该主题与同一组中其他成员的接近程度。通过随机数发生器随机选择被试并重复分析，对模型进行交叉验证。采用Fisher方法进行线性判别分析。37,43.

用Graphpad 5.0或SPSS软件(22.0版)进行统计学分析。采用Man-WhitneyU检验进行比较。分类数据用卡方检验进行比较。P<0.05。对于重新分析的数据集，p值采用bjamini-hochberg(BH)程序进行调整。44使用R语言3.1.1。调整后的p值表示为p。[医]，统计意义定义为p。[医] < 0.05.

为了比较不同的矩阵，我们用Heml 1.0.3.3-heatmap插图对每个个体浓度的最大值(红色)和最小值(蓝色)之间的所有数据进行归一化，生成了无监督的热图。利用String数据库(http://string-db.org/第10.5版)33,45信心分数>0.7。