糖尿病加重动脉粥样硬化的进展，导致胆固醇降低后动脉修复的缺陷，这一过程被称为回归。普萘氟嗪通过抑制肾脏中的葡萄糖转运体2(SGLT-2)来降低血糖水平，并已被证明能显著减少人类心血管事件的发生。为确定降糖对小鼠动脉粥样硬化消退的促进作用，雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射LDLR-和SRB 1反义寡核苷酸，喂养高胆固醇饮食16周，诱发严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。进展...第14周，所有小鼠均被注射链脲佐菌素(STZ)制成糖尿病。在第16周，一个基线组被处死并显示主动脉根部有大量的动脉粥样硬化。在其余小鼠中，通过切换饮食和用低密度脂蛋白受体(LDLR)感觉寡核苷酸治疗导致动脉粥样硬化，从而降低血浆胆固醇。回归...然后，这些老鼠接受空泡灵或药物治疗三周。治疗组小鼠动脉粥样硬化斑块明显缩小，血脂和CD 68显著降低。+巨噬细胞含量，以及更大的胶原含量。空斑、留置巨噬细胞的增殖和白细胞对血管壁的粘附均明显降低。总之，普萘氟嗪降低血糖可促进糖尿病小鼠斑块的消退。

尽管对糖尿病的病理生理学和治疗的认识最近有了进展，但糖尿病仍然是动脉粥样硬化及其并发症(如冠心病、中风和外周动脉疾病)的主要危险因素。在晚期动脉粥样硬化病中，通过降低血浆胆固醇水平，可以减轻动脉粥样硬化斑块的负担。1...血管内超声研究显示，非糖尿病患者斑块体积有所减少，但在1-2年内减少了几个百分点。2,3...然而，糖尿病的存在部分地否定了人类和小鼠动脉粥样硬化的消退。4,5...糖尿病患者回归缺陷的原因尚不清楚，这是由于胰岛素信号传导缺陷、高血糖还是高脂血症加重引起的。近年来，降糖钠-葡萄糖共转运体2(Sgt 2)抑制剂吡咯嗪在糖尿病患者的全因和心血管死亡方面显示出了有益的作用。6...SGLT2在肾脏近曲小管上皮衬里表达。抑制SGLT2可阻止肾小球滤过液中葡萄糖的再摄取，降低血液中的葡萄糖水平，并刺激尿中葡萄糖的排泄。虽然人们对SGL 2抑制的药理学有很好的了解，但目前对其心血管功能的作用机制进行了研究：一是葡萄糖减少对动脉粥样硬化炎症过程的有益作用。

动脉粥样硬化退行性变不涉及与相反顺序进展相同的机制。有不同的细胞和分子过程，动员斑块元素来解决斑块。退变斑块的特点是巨噬细胞总量减少，纤维物质增加，凋亡减少，坏死核变小。总的来说，这些特征的结合暗示着斑块的稳定性增加，不易破裂和随后形成血栓。7...要完全理解这些过程，就需要建立合适的小鼠模型，并选择合适的研究方案。7...我们最近开发了一种新的小鼠动脉粥样硬化进展和倒退的模型，该模型使用了低密度脂蛋白受体(LDLR)的寡核苷酸调节。8...我们现在使用抑制LDLR和清道夫受体B1(SRB 1)来达到更高的血浆胆固醇水平和更高级的动脉粥样硬化病变。高密度脂蛋白受体SRB 1的肝表达在胆固醇逆向转运中起着重要作用，胆固醇通过HDL从外周组织(如动脉瘤样斑块)转运到肝脏进行再循环或胆汁排泄。9.

在目前的研究中，我们利用这个模型来研究SGLT-2抑制剂介导的葡萄糖降低对STZ诱导的糖尿病小鼠模型动脉粥样硬化消退的影响。

体内研究

动脉粥样硬化回归研究

雄性野生型C57BL/6J小鼠来源于Janvier(Janvier实验室，Le Genest-St-Isle，法国)。为诱导动脉粥样硬化的进展，所有小鼠每周接受腹腔内注射(I.P.)注射LDLR和SRB 1反义寡核苷酸(ASO)16周(见图)。1A研究时间表)。此外，所有小鼠均接受含1.25%胆固醇的高胆固醇饮食16周(ssniff GmbH，Soest，德国，EF D 12108)。在第14周，所有小鼠都接受了静脉注射。注射链脲佐菌素(STZ，50 mg/kg体重，连续5天)。仅在最后一次注射STZ 10天后4小时空腹血糖水平>250 mg/dl的小鼠被归类为糖尿病并纳入研究。在第16周的研究后，一个基线组被收集来评估基线进展性动脉粥样硬化。为了降低其余小鼠的血浆胆固醇，我们从HCD转为饮食，并替换了I.P。LDLR/SRB 1反义寡核苷酸注射LDLR感觉寡核苷酸(SO)在回归第1周和第3周。在整个三周的回归期内，小鼠要么接受SGLT2抑制剂，要么接受正常饮水。3周后，所有剩余小鼠均被采集，用于评估动脉粥样硬化消退情况。实验议定书得到了弗赖堡大学动物伦理委员会和德国弗赖堡区域委员会的批准，并按照机构准则执行。

应用反义/正义寡核苷酸和SGLT2抑制剂戊利氟嗪调节血浆胆固醇和葡萄糖水平。(A)动脉粥样硬化时间回归研究。野生型小鼠每周接受ip。动脉粥样硬化时注射LDLR-/SRBI反义和HCD进展第14周连续接受5次STZ注射，第16周为动脉粥样硬化基线组，然后通过LDLR感觉治疗和切换饮食开始动脉粥样硬化消退。所有小鼠均接受SGLT2抑制剂吡咯嗪或车辆。(B)动脉粥样硬化进展和消退过程中血浆总胆固醇水平，右侧入口显示16周和19周血浆胆固醇水平。(C)动脉粥样硬化进展和消退过程中血浆总甘油三酯水平。(D)体重和(E)STZ治疗后4h空腹血糖(n=8~11/组)。NS=无显着性。误差条表示扫描电镜。

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活体显微镜研究

为了确定循环中葡萄糖水平的变化如何影响循环白细胞与内皮细胞的粘附，我们对腹腔静脉进行了活体显微镜观察。6周龄时诱发STZ-糖尿病。最后一次注射STZ 10天后4小时空腹血糖水平>250 mg/dl的小鼠被认为是糖尿病人，并被纳入本研究。第10天后，小鼠接受SGLT2抑制剂吡咯嗪(35 mg/kg体重/天)或正常饮水一周。治疗1周后，行生命内显微镜检查。术前4h腹腔注射肿瘤坏死因子-α0.2g，刺激白细胞与内皮细胞粘附(重组小鼠肿瘤坏死因子-α(AA 80-235)蛋白，CAT)。410-MT-010，研发系统，德国威斯巴登，稀释成200升PBS)。所有小鼠均经静脉注射麻醉。注射氯胺酮(Inresa，Freiburg，德国，#07714091)和盐酸西拉津(罗本2%，拜耳生命有限公司，勒沃库森，德国，#1320422)。所有小鼠均经眶后注射60μg罗丹明(C=1mg/ml，稀释于PBS，罗丹明6G，R 4127，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国)。腹腔消毒后，打开腹膜，暴露肠系膜血管。然后用荧光显微镜进行生命内显微镜检查(Axiotech Vario 100 HD，Carl Zeiss显微镜公司，G ttingen，德国)。在生命内显微镜下，定位终末静脉，拍摄长度为30s的视频(每只小鼠10个视频)。标记长度为200 m，宽度为100 m的面积，计数白细胞滚动和粘附情况。结果被标准化为每只动物手术前的白细胞数。所有的粘附和滚动白细胞的分析都是由盲目的研究者使用Zen2.3 Lite软件进行的。

反义/正义寡核苷酸治疗

腹腔注射LDLR和SRB 1 ASO(分别为10 mg/kg和30 mg/kg体重)，每周1次，共16周。在回归周期的第1周和第3周(20 mg/kg体重)腹腔注射GalNAc-连接感寡核苷酸(SO)来结合和灭活LDLR ASO。所有反义/正义寡核苷酸均在无菌PBS中稀释。针对小鼠LDLR和非GalNAc结合的ASO基因2.0分别由Ionis制药公司(美国加利福尼亚州Carlsbad)开发并提供了GalNAc-共轭GEN 2.5 ASO靶向小鼠LDLR和非GalNAc结合ASO GEN 2.0。

STZ注射

根据糖尿病并发症联合会的方案，连续5天采用小剂量注射5次STZ(50 mg/kg体重)诱导STZ糖尿病。10...从德国西格玛-阿尔德里奇化工有限公司(Sigma-Aldrich ChemieGmbH)获得了STZ(STZ≥75%α-失范基，≥98%粉末S 0130-500 mg)，柠檬酸钠二水化钠(W 302600-1kg-K)和柠檬酸钠一水化钠(71497~250 g)。

吡咯嗪治疗

吡咯烷酮在饮用水中稀释(0，073毫克/毫升)，每日剂量为35毫克/千克体重，其他人报告的剂量范围相似。11,12...在饮用水中给予戊利福津，以复制人体的摄入途径，并避免与肠外给药有关的压力。为确定合适的剂量，在先前的实验中，测定了STZ-糖尿病小鼠的每日饮水消耗量.普格利弗林是博赫林格-英格尔海姆(Ingelheim，德国)的一份礼物。

采血

禁食4h后，用肝素化微毛细管从麻醉小鼠的复发性眶丛采集血。取血500 g离心5 min，去除细胞。然后用血浆测量脂质和(或)在−80°C冷冻。

胆固醇测定

根据制造商的指示，用光度法测定血浆总胆固醇水平，包括试剂(胆固醇FS，参考文献113009910026)和标准对照(胆固醇标准FS，参考113009910030，双诊断系统公司，德国霍尔兹海姆)。

甘油三酯试验

根据制造商的指示，采用由试剂(甘油三酯FS，参考157609910021)和标准对照(甘油三酯标准FS，参考157003010030，双诊断系统有限公司，德国霍尔兹海姆)组成的光度法分析甘油三酯血浆水平。

血糖测量

禁食4h后经尾静脉穿刺取血。第一滴血被丢弃了。用血糖仪(NC型，参考文献06870333001)和试纸(产品编号：6114963，德国曼海姆罗氏糖尿病护理有限公司)测定血糖水平。

白细胞定量

在弗赖堡大学医院的临床实验室中，用正向/侧向散射法对白细胞总数进行量化。

流式细胞术

用100μl全血作流式细胞术检测白细胞亚群.首先，用红细胞溶解缓冲液(Cat：420301，BioLegendBiozol，Eching，德国)在室温下(RT)将红细胞溶化4分钟。加入PBS(Cat.No.P04-36500，泛生物技术有限公司，希尔登，德国)，一个细胞颗粒在350克下旋转5分钟，上清液被丢弃。松解2~3次。再用1ml FACS缓冲液(PBS，0.5%牛血清白蛋白(白蛋白分数V，A 1391，0050，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那)，1%胎牛血清)再悬浮。细胞外表面蛋白经FACS-缓冲液与荧光抗体孵育30 min后，在4°C的黑暗中进行染色。

所用抗体为CD45.2-Pacific Blue(参考文献48-0454，eBioscience，Affymetrix Inc.，San Diego，USA)，CD11b-APCCy7(猫)。557657，BD生物科学，圣何塞，美国)，CD 115-PE(参考12-1152，电子生物科学，外氮，热费舍尔科学，阿弗莱米特里公司，圣地亚哥，美国)，Ly6C-PerCP(猫。128012，生物传奇，伦敦，GB)，CD3E-FITC(参考文献11-0031，eBioscience，圣地亚哥，美国)，CD3-V500/Amcyan(猫。560771 BD生物科学，圣何塞，美国)，CD4-FITC(猫.100510生物传奇，伦敦，GB)，CD8-PerCP(猫。100739生物传奇，伦敦，GB)，CD 25-PE(猫.12-0251-82，电子生物科学，圣地亚哥，美国)，Ly6G-APC(猫。127614生物传奇，伦敦，GB)，CD 19-APCCy7(猫。557655 BD生物科学，圣何塞，美国)，CD 19-PECy7(参考25-0193 eBioscience，外氮，Thermo Fisher Science，Affymetrix Inc.，San Diego，USA)(全抗鼠)。

用FoxP 3染色试剂盒对细胞内蛋白FoxP 3进行染色。eBioscienceTM Foxp 3/转录因子染色缓冲液集，Invitrogen，Thermo Fisher Science，Life Technologies Corp.，Carlsbad，美国)根据制造商的指示，用荧光细胞分选机(FACS，BD FACSCanto)对样品进行了分析。TM第二，BD生物科学，海德堡，德国)。在补偿和分析方面，使用了FLOJO软件。

主动脉根的组织学和形态计量学分析

主动脉根部收获

小鼠腹腔注射盐酸西拉嗪(0.02mg/g体重，Rompun 2%，Bayer生命有限公司，勒沃库森，德国，#1320422)和氯胺酮(0.3mg/g体重，Inresa，德国弗赖堡，#07714091)麻醉。腹胸开胸后，用PFA 4%冲洗主动脉(ROTI-组织固定4%，No.P087.3，Carl Roth GmbH&Co.KG Karlsruhe，德国)通过左心室。心脏切除主动脉根部，RT保存于PFA 4%中60 min。将主动脉根部用PBS冲洗10 min，在4°C(蔗糖，CAS 57-50-1，Merck，Darmstadt，德国)下连续孵育10%、20%和30%蔗糖。蔗糖孵育后，根被植入O.C.T。(组织-Tek O.C.T化合物，Sakura Finetek Europe B.V.，Alphen aan den Rijn，荷兰)。为定量斑块大小和斑块组成，在μ20°C处，将主动脉根部切成6节−20°C的低温器(CM 1510 S Leica Microsystems Nusslch GmbH，Nusslch GmbH)，并对其进行染色。13,14...对主动脉根部的总壁面积(=内膜+中膜)、内膜损伤区(内膜)和内侧区(中膜)进行了分析。对0 m、32 m、72 m和112 m每只动物的总斑块大小进行量化分析。用计算机辅助图像分析软件(ImagePro，MediaContronetics，Rockville，MD，US)对斑块组成、脂质(油红O)、巨噬细胞(抗小鼠CD 68)和胶原蛋白(Pmicrosirius Red)的阳性染色面积百分比进行定量计算。所有与动物有关的程序都得到了弗赖堡大学动物保护委员会的批准，所有的老鼠都被安置在特定的无病原体条件下。

油红O(Oro)染色

脂类染色是按照我们小组先前的描述进行的。13：在染色前1天制备油红O溶液(0.5%)。2.5g纯油红色O(Sigma-Aldrich，St.Luis，MO，USA，O 0625)在95°C溶解于500 ml丙二醇(1，2-丙二醇，Fisher Science，Waltham，MA，USA，#S 25769)中。染色前，用0.2μm过滤器重复过滤(Nalgene真空过滤系统，Sigma-Aldrich，St.Luis，MO，美国，#568-0020)。10%福尔马林固定主动脉弓和主动脉弓10 min。用水冲洗后，用100%丙二醇脱水。切片在60°C下用0.5%油红O染色25 min，用25%苏木精(Sigma-Aldrich，St.Luis，MO，USA，#H3136-100G)漂洗10 min后，用0.25%铵(氨水0.25%，电子显微镜，Hatfield，PA，美国，26123~10)进行染色。所有切片均嵌入甘油明胶(Sigma-Aldrich，St.Luis，MO，USA，#GG1)，并覆盖一张盖子。

苦杏仁红染色

如前所述13,15.class=‘class 2’>09400%的天狼星红溶液(PolyScienceInc.，Warrington，PA，USA，#09400)在饱和水苦味酸(Ricca化学公司，阿灵顿，美国，TX，#5860-32)中制备并过滤.干燥后，用10%福尔马林缓冲液固定10 min。用自来水冲洗后，用苦sirius红溶液孵育3~4小时。在0.01NHCl中冲洗两次，分别在70%乙醇(70%乙醇30~45s，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min)和二甲苯(5 Min)中脱水。

抗CD 68染色

CD 68免疫组织化学染色13,15...主动脉根段与RT平衡，丙酮固定9 min。为避免染色根渗漏，用聚硅氧烷(15%二甲基聚硅氧烷，Sigma-Aldrich，St.Luis，MO，美国，#dmps-12m)，84%丙醇(异丙醇，VWR国际公司，德国Darmstadt，德国，#vw 3250-4)1%H组成。2所以4(Fisher Science，Schwerte，德国，#A300-500)65°C切片在0.3%H中孵化2O2(EMD化学品，默克KGaA，Darmstadt，德国，#HX 0635-1)在RT上停留30分钟。用PBS重复冲洗5 min后，用50μ10%兔血清(载体实验室、美国伯林加梅、美国#S-5000)孵育30 min，避免非特异性结合。根据厂家的操作规程，取血清，用1：500，抗CD 68(大鼠抗鼠)，BioRad，Puchheim#MCA1957GA进行1小时的RT染色。RT 3次用PBS冲洗5 min后，用生物素化兔抗鼠(1：200，载体实验室，美国伯林加梅，美国#BA-4001)孵育30 min。此步骤后，再用PBS冲洗3次，在RT下冲洗5 min。切片随后与50μl的精英PK-6100威他赛因ABC试剂盒(载体实验室，伯林加梅，CA，美国，#pK-6100)在RT 30分钟。用PBS洗涤5 min后，用IMMPACT AMEC红基质(载体实验室、美国伯林加梅、美国#SK-4285)染色1~3 min。染色切片用清水冲洗20 min，细胞核用苏木精染色。

Ki 67/CD 68/DAPI免疫荧光染色

用Tween 20 0.25%(编号：142312.1611，PanReac Applichem，西班牙巴塞罗那，西班牙巴塞罗那)在山羊血清中孵育10%(正常山羊血清封闭液，Cat：s-1000，载体：Peterborough，GB)，固定10%(A 4975，0100，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那，142312.1611)，固定10 min(PFA 4%)和渗透(Triton X-100%(编号：A 4975，0100，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那)。对Ki-67免疫荧光染色，用抗-Ki 67兔原抗体(ab 16667，AbCAM，剑桥，GB)在4°C下孵育45 min，然后用二级抗兔山羊生物素结合抗体(CAT：BA-1000，载体实验室，Peterborough，GB)孵育45 min。然后添加荧光素亲和素DCS(CAT：A-2011，载体实验室，彼得堡，GB)。玻片与兔血清10%(正常兔血清封闭液，Cat：S-5000，载体实验室，彼得堡，GB)孵育1h。CD 68免疫荧光染色以抗CD 68大鼠抗体(鼠抗CD 68，MCA1957GA，BioRad，Puchheim，德国)孵育1h为第一抗体，然后与抗大鼠生物素结合抗体(Cat：BA-4001，载体实验室，Peterborough，GB)孵育45 min作为第二抗体。然后，德州红亲和素DCS(猫：A-2016，矢量实验室，彼得堡，GB)被添加。然后用DAPI安装介质(含DAPI的氟屏蔽安装介质，ab104139，ABCAM，剑桥，GB)覆盖各部分。在荧光显微镜下拍摄照片，计数三重阳性细胞(Ki 67/CD 68/DAPI)和双阳性细胞(CD 68/DAPI)的比值。16.

统计分析

采用学生t检验对两组进行比较。采用单因素方差分析(ANOVA)和Newmann-Keuls后特设试验对3组进行比较。结果α<0.0 5者有统计学意义。使用GraphPad棱镜创建了统计数据和图表。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。

反义/正义寡核苷酸和SGLT2抑制剂表位利嗪对小鼠血浆胆固醇和血糖的调节作用

为了诱导动脉粥样硬化，我们对野生型C57BL/6J小鼠进行了每周一次的抗动脉粥样硬化注射。LDLR和srb 1mRNA(图1.1A)。麻黄治疗可使肝脏Ldlr和Srb 1的表达分别减少12倍和10倍(补充图)。1)。我们使用两种Asos和一种HCD联合诱导严重的高胆固醇血症(>600 mg/dl)，类似于常用的敲除小鼠动脉粥样硬化模型。添加STZ-糖尿病后，16周时血浆胆固醇和血糖分别升高至862±37 mg/dl和356±22 mg/dl(P<0.01)。1B)。牺牲基线(动脉粥样硬化进展)组后，通过切换饮食和使用LDLR感觉寡核苷酸来降低血浆胆固醇。用SGLT2抑制剂戊氟嗪治疗糖尿病小鼠，使血糖水平降至140±14 mg/dl，而车辆处理的小鼠仍处于高血糖状态(图1)。1E)。值得注意的是，与车辆治疗组相比，普萘氟嗪组血浆胆固醇水平并无差异，排除了不同胆固醇水平对回归的可能偏见(图19，图1)。1B，插入)。血浆甘油三酯在STZ糖尿病诱导后显著升高，在LDLR感官治疗和饮食切换到野生型小鼠中常见水平后下降(图一)。1C)。与血浆胆固醇相似的是，与车辆相比，普萘氟嗪对甘油三酯没有影响。如前所述17诱导STZ-糖尿病引起小鼠体重下降。(无花果)1D).

与药物治疗的高血糖小鼠相比，吡咯烷酮治疗导致动脉粥样硬化斑块缩小。

在基础阶段(动脉粥样硬化进展的16周)或补充3周的胆固醇降低后，用或不加普帕格利松治疗来评估动脉粥样硬化的进展和消退。高胆固醇血症16周后，基线组小鼠主动脉根部出现大量动脉粥样硬化斑块。在接下来的三周内，高血糖小鼠的斑块大小进一步增加。2)。3周-2.7×10周后，SGLT_2抑制剂治疗的正常小鼠动脉粥样硬化病变面积明显减小。5±1.4×104引力场m2(控制)对2.2×105±1.3×104引力场m2(泛氟虫)。因此，葡萄糖的减少减缓了进展的速度。

SGLT 2抑制剂处理的小鼠动脉粥样硬化斑块大小减少。主动脉根部病变面积平均7~9例/组。*p<0.05，*p<0.001。误差条表示扫描电镜。

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SGLT 2抑制剂治疗加速动脉粥样硬化消退过程中斑块稳定性的特征

退变可导致病变大小减小，但更显着地改变斑块组成，使其形态更加稳定。动脉粥样硬化消退组脂质沉积和CD 68显著降低。+巨噬细胞与基线组比较(图1)。3A-E)。然而，脂质和CD 68+与高血糖小鼠相比，正常血糖组小鼠巨噬细胞含量下降约25%.同时，治疗组小鼠斑块稳定胶原含量增加约60%(图1)。3F，G).

SGLT 2抑制剂治疗加速动脉粥样硬化消退过程中斑块稳定性的特征。(a)奥罗染色法测定主动脉根部斑块脂质含量，4节/鼠，n=7-9。(B)脂肪含量在0 m，32 m，72 m，112 m。(C)奥罗染色主动脉根部的代表性图片。(D)CD 68的量化+主动脉根部的巨噬细胞。1节/鼠，n=7-9/组。(E)有代表性的主动脉根部切片和放大图片，n=7-9/组。*p<0.05，*p<0.001。误差条表示扫描电镜。(F)对主动脉根部斑块中胶原含量的定量研究：2切片/鼠，n=7~9。(G)红染主动脉根部的代表性图片。*p<0.01。NS=无显着性。误差条表示扫描电镜。

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在动脉粥样硬化消退过程中，血小板不影响白细胞和白细胞亚群。

为了研究降糖加速动脉粥样硬化斑块消退的可能机制，我们首先分析了循环白细胞。在我们的研究小组中，我们没有检测到白细胞总数、B/T淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的显着性差异(图一)。4A，B)。炎症，Ly6C高两个回归组的单核细胞减少(图1)。4C，D)。然而，Ly6C没有显着性差异。高和Ly6C低层SGLT 2抑制剂与对照组之间的单核细胞。这些数据不同于以前使用不同协议的研究报告的数据。18...与基线相比，两个回归组的调节性T细胞均减少(图1)。4E)，与最近一份显示高胆固醇依赖的调节性T细胞发育的报告一致。19...但两组间调节性T细胞无明显差异。总之，这些数据表明，血糖降低后斑块大小和组成的差异并不是由于循环细胞数量的变化。

在动脉粥样硬化消退过程中，SGLT2抑制剂对白细胞和白细胞亚群没有影响。(A)用流式细胞仪定量测定全循环白细胞，(B)白细胞亚群，(C)巡逻，“非经典”Ly6C罗氏和(D)促炎性Ly6C嗨单核细胞。(E)监管FoxP 3+T淋巴细胞。n=7-9/组。*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001。误差条表示扫描电镜。

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吡咯烷酮降糖减轻斑块内巨噬细胞增殖的实验研究

巨噬细胞在动脉粥样硬化进展和消退中起重要作用20,21...巨噬细胞含量可以通过三种方式减少：减少空斑的招募，从斑块中移出，以及减少斑块内的增殖。22...最近的研究表明，局部巨噬细胞的增殖可以维持巨噬细胞在发炎时的蓄积。23和正常组织24,25...在晚期动脉粥样硬化病变中，局部巨噬细胞的增殖对巨噬细胞的聚集有显著的促进作用。26...在我们的研究中，增殖的Ki 67+与基线相比，巨噬细胞减少37%，胆固醇降低。在血糖正常的回归小鼠中，增殖甚至进一步减弱(与基线相比，约为68%)，如图所示。5A，B)。此外，动脉粥样硬化病变中增殖的巨噬细胞数量与所有回归小鼠的血糖水平相关(见图)。5C)。相反，在回归组中，增殖的巨噬细胞与血浆胆固醇水平没有相关性(数据未显示)。

SGLT 2抑制剂降血糖可减轻空斑巨噬细胞的增殖。(a)增殖性Ki 67的定量研究+动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞。N=7-9/组(B)基线、对照组和SGLT2i小鼠主动脉根部的典型免疫荧光染色。用抗CD 68(红色)、抗Ki 67(绿色)和4‘，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI；蓝色)单克隆抗体对增殖的巨噬细胞进行染色。白色虚线代表动脉粥样硬化斑块与血管腔的边界。红色标度=20m(C)两组患者血糖与增殖、斑块型巨噬细胞的相关性。*p<0.05，**p<0.01。NS=无显着性。误差条表示扫描电镜。

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SGLT 2抑制白细胞粘附体内

长期以来，人们一直认为局部巨噬细胞蓄积主要与血Ly-6C的生成有关。高单核细胞至炎症血管壁27,28...我们评估了STZ糖尿病小鼠经SGLT2抑制剂治疗后血管壁中白细胞的再吸收情况，并与高血糖模型小鼠进行了比较(图1)。6A，B)。正常血糖小鼠白细胞粘附血管壁明显减少，白细胞滚动无统计学意义。再一次，循环白细胞数在两组之间没有差别，因此排除了白细胞数量增加或减少所造成的混淆因素(图1)。6C-F).

SGL 2抑制导致白细胞粘附减少体内. (a)生命内显微镜(IVM)研究的时间线。雄性BL/6J WT-小鼠在6周龄时连续注射5次STZ制成糖尿病模型。10天后测定4小时空腹血糖。血糖水平>250 mg/dl的小鼠被纳入研究。然后，小鼠接受SGLT2iempagliflzin或对照。一周后进行IVM。(B)STZ注射后4小时(SGLT2i TX前)和SGLTi治疗后7天空腹血糖水平。(C)活体显微镜观察小肠小静脉白细胞粘附的定量研究。(D)在活体显微镜下定量测定小肠静脉中的滚动白细胞(n=8~10/组)。(E)由生命内显微镜(40倍)获得的具有代表性的视频图像。(F注药前后血白细胞定量。静脉注射肿瘤坏死因子(α)治疗IVM(n=11~13/组)。*p<0.05，*p<0.001。NS=无显着性。误差条表示扫描电镜。

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动脉粥样硬化的消退或逆转已成为重要的临床目标。他汀类药物和最近PCSK 9抑制剂的使用导致动脉粥样硬化的消退和血管事件的减少。然而，并不是所有的病人都能从降低胆固醇中得到同样的好处。这在糖尿病患者中尤为明显，他们显示斑块消退受损。4...本研究的目的是建立一个可行的模型来研究高血糖在糖尿病回归中的作用。我们发现，STZ-糖尿病小鼠的血糖正常化加速了斑块消退的特征，可能是通过阻止白细胞侵入血管壁和巨噬细胞增殖来实现的。

在过去的20年中，研究动脉粥样硬化消退的不同策略在主动脉移植和“反转”小鼠等动物模型中已经被描述过。29,30...然而，这些模型的有效性受到手术或遗传复杂性的限制。我们最近报道了一种新的动脉粥样硬化进展和倒退的可逆模型，该模型使用了LDLR的寡核苷酸调节。8...该模型避开了与其他鼠标回归模型相关的许多挑战。为了达到更高的血浆胆固醇水平，从而更大的动脉粥样硬化病变，可与目前基因敲除小鼠的动脉粥样硬化模型(例如LDLR-和ApoE缺乏的小鼠)相媲美，我们现在使用LDLR和SRB 1 Asos的组合。另有报道称，饮食加速的主动脉窦动脉粥样硬化、心肌梗死以及SRB 1和LDLR或ApoE双敲除小鼠的早期死亡。31,32...在本研究中，血浆总胆固醇水平在HCD治疗12周后升高至650 mg/dl，小鼠主动脉根部出现明显的动脉粥样硬化病变，但我们没有观察到在动脉粥样硬化进展过程中死亡率的增加；未评估心肌梗死或闭塞性冠状动脉粥样硬化。正如预期的那样，血浆胆固醇和甘油三酯在STZ注射诱导胰岛素缺乏性糖尿病后显著增加。15在人体内复制糖尿病血脂异常。在诱发STZ-糖尿病后，我们可以降低血浆胆固醇和甘油三酯水平，使其降至阈值以下，从而导致小鼠动脉粥样硬化的消退。33.

以往的糖尿病小鼠动脉粥样硬化研究显示，与对照组相比，糖尿病小鼠的动脉粥样硬化程度明显降低，尽管血浆脂质水平也15,34...为了研究葡萄糖在动脉粥样硬化消退中的作用，我们选择性地降低了糖尿病动脉粥样硬化模型中的血糖水平。在一项随机的安慰剂对照研究中，普帕格利芬显著降低了心衰导致的心血管死亡和住院率。35...与许多其他降糖疗法不同，sgt 2抑制剂的作用与胰岛素分泌或作用无关。36...因此，它们非常适合于选择性研究葡萄糖对小鼠动脉粥样硬化消退的影响。

有几组研究了SGLT 2抑制剂在糖尿病小鼠动脉粥样硬化进展中的抗动脉粥样硬化作用。18,37,38...相反，据我们所知，只有一份报告研究了sgtt 2抑制剂dapagliflzin对糖尿病小鼠动脉粥样硬化消退的影响。5...纳加雷迪等人...提示治疗高血糖可减少单核细胞增多，减少单核细胞进入动脉粥样硬化病变，促进动脉粥样硬化消退。相反，我们没有检测到小鼠白细胞或白细胞亚群(如单核细胞、中性粒细胞)的差异。有几个因素可以解释这一差异：首先，我们所有的小鼠(包括基线组和回归组)都是糖尿病患者，因此我们没有与非糖尿病小鼠进行比较。其次，白细胞增多很可能受到STZ-糖尿病持续时间的影响，在我们的研究中，这一时间缩短了3周。的确，我们检测到长期STZ-糖尿病和SGLT2抑制剂治疗后的明显白细胞增多和单核细胞增多(数据未显示)。第三，所使用的回归模型有很大的不同，例如反义/正义寡核苷酸方法明显降低了血浆胆固醇水平，而只使用了饮食切换或主动脉移植小鼠模型。最后，不同的SGLT2抑制剂的作用可能不同。

在我们的研究中，正常血糖回归小鼠在胆固醇降低后，与高血糖对照组小鼠相比，斑块生长明显改善。此外，与高血糖对照组小鼠相比，正常血糖消退小鼠在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞和脂质积累更少，胶原含量更高，提示降糖能加速斑块稳定的特征。离体研究表明高糖能促进培养巨噬细胞中泡沫细胞的形成。39,40...脂蛋白的糖基化增强了它们与内皮细胞外基质蛋白多糖的结合亲和力，从而促进了脂质的积累。41. 体内，对非糖尿病小鼠和糖尿病小鼠动脉粥样硬化进展的研究也显示，sgtt 2抑制作用减少了葡萄糖减少后的巨噬细胞斑块。18,37...然而，SGLT 2抑制剂对这些高脂血症小鼠的治疗也改善了血脂水平，因此很可能掩盖了任何葡萄糖特异性的作用。相反，在回归过程中，高血糖小鼠和正常血糖小鼠的血浆胆固醇和甘油三酯没有差别。有关sgt 2药物对循环脂蛋白的影响的数据也参差不齐，一些研究表明这些药物降低了甘油三酯，增加了hdl和ldl，而另一些研究显示没有作用。42,43.

吡咯烷酮的主要作用是降低血糖。我们不能完全排除去脂灵对动脉粥样硬化消退的非靶标效应，但我们认为这是不可能的，原因如下：首先，在先前的一项研究中，无论是sgt 2抑制(本例中是dapagliflzin)还是sgtt 2反义寡核苷酸对小鼠动脉粥样硬化和白细胞的降血糖作用，都是不可能的。5...第二，sgt 2的表达主要局限于肾脏近端小管的内皮细胞，单核/巨噬细胞和其他组织中只有微量表达。44(补充图。2).

减少动脉粥样硬化斑块的细胞吸收45，巨噬细胞出口增加46和减少巨噬细胞增殖26,47可能参与动脉粥样硬化病变的消退或消退。7...与后者相一致，我们检测到SGLT 2抑制剂治疗后小鼠的巨噬细胞增殖减少，血糖水平与斑块内巨噬细胞增殖呈正相关。在动脉粥样硬化进展的小鼠模型中，Lamharzi等人...已经证明高血糖和高脂血症的结合刺激巨噬细胞增殖，很可能是由葡萄糖氧化低密度脂蛋白引起的。48...据我们所知，在动脉粥样硬化回归模型中，我们首先报告了葡萄糖减少导致的斑块内巨噬细胞增殖减少。考虑到在我们和其他非糖尿病小鼠的研究中，斑块内巨噬细胞的数量相对较少。47,49进一步的详细分析(如BrdU标记，激光捕获巨噬细胞的基因表达分析)对于评估葡萄糖依赖的斑块内巨噬细胞增殖的贡献是必要的。

除减少巨噬细胞增殖外，STZ-糖尿病小鼠的葡萄糖减少也会影响白细胞向血管壁的吸收，如生命内显微镜所示。对分离的血管细胞的研究表明，葡萄糖浓度升高会产生大量的致动脉粥样硬化反应，产生晚期糖基化终产物(Ags)或活性氧，最终通过激活核因子κ-B导致炎症的加重。50...高糖暴露可诱导单核细胞活化、单核细胞内皮细胞粘附和转归，增加粘附分子(如vcm-1)和细胞因子(如mcp-1、白细胞介素-1β)。51,52,53. 体内在STZ或四氧嘧啶诱导的糖尿病和高血糖模型中，高血糖可增加内皮细胞粘附分子的表达，增加白细胞在内皮上的积聚。54,55,56...我们的观察结果与Nagareddy一致。等人...世卫组织将斑块内巨噬细胞减少归因于单核细胞进入血管壁的减少。5.

总之，我们的研究提出了一种新的反义/正义寡核苷酸驱动的方法来研究糖尿病小鼠动脉粥样硬化的消退。它避免了技术上要求严格的移植使用或回归所需的育种的需要。葡萄糖减少加速动脉粥样硬化的消退，可能是通过减少斑块内巨噬细胞增殖和减少白细胞向血管壁的吸收。需要进一步的研究来研究葡萄糖是如何介导这些效应的。