卵巢切除在低灌注诱导的腹主动脉瘤动物模型中增加腹主动脉瘤的发生率 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

腹主动脉瘤(AAA)是一种以血管壁减弱为特征的血管疾病。男性性别是AAA的危险因素，男性的AAA发病率高峰发生在男性比女性早10年。然而，AAA在女性中的增长速度更快，而且由于AAA破裂而导致的死亡率更高。AAA中与性别相关的差异的机制尚不清楚。在此，我们评估了卵巢切除(OVX)对大鼠AAA的影响。评价OVX和AAA诱导的效果后，OVX组AAA发生率和动脉瘤直径增加。而发育型AAA壁的病理组织学在各组间无明显差异。当观察OVX对无AAA诱导的血管壁的影响时，弹力蛋白和胶原水平明显降低。此外，OVX组基质金属蛋白酶-9水平显著升高.根据我们的研究结果，推测OVX引起的胶原和弹性蛋白纤维水平下降可能与AAA的发病率和直径增加有关。AAA发病前血管壁的弱化可能是女性AAA生长速度加快的原因之一。

导言

腹主动脉瘤(AAA)是一种累及腹主动脉扩张的血管疾病。鉴于AAA破裂导致的死亡率很高，预防它是一个非常重要的问题。然而，目前尚无预防aaa进展和破裂的治疗药物。1...以往的研究表明aaa与炎症所致血管壁的弱化密切相关。2...巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞释放蛋白酶和炎性细胞因子，包括基质金属蛋白酶(MMPs)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，这些细胞降解血管壁中的弹性蛋白和胶原纤维。3...动脉壁退化伴高血压是AAA发生的诱因之一。据报道，血管狭窄引起的血管壁低灌注导致AAA的发生。4,5.

男性性别是aaa不可改变的危险因素。6,7...以前的研究表明，男性发生AAA的频率是女性的4倍。8...在英国，目前的aaa筛查计划被认为对男性是成本有效的，但对女性则不具成本效益。9...然而，应该考虑到女性AAA的性别差异，以了解女性AAA的特点。女性被诊断为aaa的时间往往比男性晚10年。10...aaa破裂的风险女性比男性高3-4倍，而动脉瘤生长速度女性高于男性。11,12...妇女在血管内动脉瘤修补和开放aaa修补术后30天死亡率和主要并发症的风险较高。13...大多数aaa妇女绝经后，aaa值较大的妇女更年期较早。14,15...更年期卵巢的低活性导致雌激素水平的降低，而雌激素水平的降低与血管壁的氧化应激和炎症有关。16...这些报告表明卵巢的低活动与女性特有的AAA事件有关。然而，妇女特有的AAA事件的确切机制仍不清楚。在本研究中，我们评价了卵巢切除(OVX)对AAA的影响，发现OVX增加了腹主动脉瘤的发生率和直径，导致胶原和弹性蛋白纤维水平下降。

结果

OVX增加AAA发病率和主动脉内径

在实验1中(图1)。1A)、低灌流诱导的AAA模型大鼠的初始体重(G)、最终体重(G)和摄食量(千卡/日)在对照组与OVX结扎组(补充表)之间无显着性差异(P>0.05)。沙一)。OVX结扎组输卵管重量(g/100 g体重)和血清17β雌二醇水平明显低于对照组，说明OVX治疗成功。沙一).

对照组和OVX结扎组的AAA发生率如图所示。2A...OVX结扎组AAA发生率高于对照组(图1)。2A)。对照组与OVX结扎组AAA破裂率无显着性差异(图5)。2B)。形成AAA的图像如图所示。2C...我们观察了两组的非扩张直径(颈部)和主动脉直径(囊)的面积(图)。2C)。对照组与OVX结扎组颈部直径无显着性差异(图5)。二维空间)。两组患者的囊均明显大于颈部(图1)。二维空间)。OVX结扎组SAC直径明显大于对照组(见图)。二维空间).

OVX不改变发育AAA壁外膜异位脂肪细胞和纤维的降解

自从先前的一项研究报道脂肪细胞的异常表现在人和动物模型中参与了aaa的发生以来。17,18,19,20，我们评估了脂肪细胞在外膜。在AAA诱导后，分别在对照组和OVX结扎组进行观察(补充图)。S1a-D)。这些区域被油红O染色阳性(补充图)。S1E-H)。数目和大小(μm)2血管壁脂肪细胞在对照组与OVX结扎组之间无显着性差异(补充图)。S1I和1J).

图中显示了具有代表性的弹性纤维图片。3A-D)。对照组和OVX结扎组AAA囊弹力蛋白降解评分均显著高于AAA颈，而对照组与OVX结扎组无显着性差异(图5)。3E)。有代表性的胶原纤维图片显示(图)。3F-K)。对照组和OVX结扎组AAA囊胶原阳性面积均明显小于AAA颈部。AAA囊内脂肪细胞周围胶原阳性面积较无脂肪细胞区明显减少。对照组与OVX结扎组胶原阳性面积无显着性差异(图二)。3L).

OVX不改变AAA血管壁MMP和单核/巨噬细胞的表达

MMP-2、MMP-9和单核/巨噬细胞的表达如图所示。4A-R...负性对照显示在补充图中。S2...AAA囊中MMP-2、MMP-9和单核/巨噬细胞的阳性区域明显多于AAA颈部的阳性区域(图1)。4S-U)。然而，对照组的这些阳性区域与OVX结扎组无显着性差异(图1)。4S-U)。补充图显示MMP-12和MCP-1的免疫组织化学染色。S3A-L...对照组与OVX结扎组MMP-12和MCP-1阳性面积无显着性差异(P>0.05)。S3M和2N).

OVX降解血管壁中的弹性蛋白和胶原纤维

由于对照结扎组与OVX结扎组之间缺乏显著差异，我们在实验2中评估了OVX对无AAA诱导的血管壁的影响(图2)。1B)。在OVX后3周，对照组和OVX组的初始体重(G)、最终体重(G)和食物摄入量(千卡/日)没有显著差异(补充表)。S2)。此外，OVX组输卵管重量(g/100 g体重)显著低于对照组(补充表)。S2)。在OVX后7周，OVX组的最终体重(G)和食物摄入量(千卡/日)显著高于对照组(补充表)。S2)。此外，OVX组输卵管重量(g/100 g体重)和血清17β-雌二醇水平明显低于对照组(补充表)。S2).

OVX组与对照组在OVX术后3周弹性蛋白降解评分无显着性差异(图5)。5A-COVX组在OVX后7周明显高于对照组(图1)。5D-F)。虽然在OVX术后3周，对照组和OVX组之间胶原阳性面积没有明显差异(见图)。5G-IOVX组7周时下降幅度明显大于对照组(图4)。5J-L)。OVX后3周各组间变性胶原阳性面积无显着性差异(图二)。5M-O然而，在7周时，OVX组明显高于对照组(图1)。5p-R).

OVX增加MMP-9的表达，但不增加MMP-2的表达。

免疫组化染色显示各组细胞中MMP-2、MMP-9和单核/巨噬细胞的表达。6A-D，G-J，M-P)。在OVX后3周或7周，对照组与OVX组MMP-2阳性面积无显着性差异(图二)。6E、F)。在OVX后3周和7周，OVX组MMP-9阳性面积明显高于对照组(见图)。6k，L)。在OVX后3周，OVX组单核/巨噬细胞阳性面积明显高于对照组(见图)。6QOVX后7周组间无显着性差异(图5)。6R).

OVX不改变AAA诱导引起的急性炎症

在实验3中，我们测定了AAA诱导后24小时血管壁的MMPs和单核/巨噬细胞(单核/巨噬细胞)，以评价OVX对AAA诱导所致急性炎症的影响。1C)。图中显示了MMP-2、MMP-9和单核/巨噬细胞的代表性图片。7A-F...对照组MMP-2、MMP-9和单核/巨噬细胞阳性面积与OVX结扎组比较无显着性差异(图5)。7g-i).

讨论

在本研究中，我们评价了OVX对AAA的影响，观察到OVX结扎组AAA的发生率和直径明显高于对照组。到目前为止，大多数临床研究中患有aaa的女性都是绝经后女性，这表明卵巢活动不足可能是女性AAA的易感因素。15...本研究用组织学方法分析了OVX结扎组AAA发生率升高的机制，对照组与OVX结扎组的病理结果无显着性差异(P>0.05)。然后，我们评价了OVX对无AAA诱导的血管壁的影响。OVX组血管纤维(如弹性蛋白和胶原)在OVX后7周明显降解，与Johnston的发现一致。等人...OVX小鼠平滑肌细胞标志物和弹性蛋白染色减弱21...这些结果提示，OVX本身并不导致AAA的形成，而是导致血管壁的弱化，这与血管壁低灌注诱导后AAA发病率的增加和较大的AAA的发生有关。

在OVX后3周和7周，OVX组MMP-9阳性面积明显高于对照组。相反，MMP-2阳性面积在对照组与OVX组之间无明显差异。OVX后3周，OVX组巨噬细胞/单核细胞表达阳性面积明显高于对照组。这些结果提示OVX参与了MMP-9水平的升高，而不是MMP-2的增加。然而，MMP-9水平的增加只能部分归因于巨噬细胞/单核细胞浸润的增加，尚需进一步研究。在AAA诱导后24h，正常结扎组与OVX结扎组MMPs、巨噬细胞/单核细胞阳性区域无明显差异，因此推测OVX不会导致血管壁血管炎症的加重。由于人类AAA与多种复杂因素有关，因此需要进一步研究OVX对AAA的影响。

利用弹性蛋白酶主动脉灌注模型进行的一项研究表明，雌性小鼠的AAA小于雄性小鼠。21,22...然而，在OVX雌性小鼠中所形成的AAA的大小与雄性小鼠相同。21...此外，雌激素合成酶芳香化酶基因缺失的雌性小鼠aaa大小达到雄性小鼠的水平。21...先前的一项研究表明，17β雌二醇可减弱aaa进展诱导的雌性小鼠血管紧张素Ⅱ。15...综上所述，这些结果表明，在OVX背景下的AAA发展可能是通过降低女性性激素水平来促进的。在本研究中，我们观察到OVX组17β雌二醇水平下降.17β-雌二醇的降低可能与MMP-9水平的升高有关.17β-雌二醇通过雌激素受体-β抑制大鼠主动脉平滑肌细胞NF-κB依赖性炎症23...兴等人...报道了17β-雌二醇通过两种不同的机制调节NF-κB信号，即促进NF-κB-α合成，这与NF-κB信号的负反馈有关，以及直接抑制NF-κB与炎症基因启动子的结合。MMP-9启动子中存在一个功能性NFκB位点。24,25NFκB对MMP-9的上调是必需的，而不是MMP-2。26.

一般来说，雌激素在绝经前妇女的血管壁保护中起着重要作用。据报道，aaa大的女性在较早的年龄进入更年期，而雌激素被认为对女性aaa的发育有保护作用。14...此前的一份报告显示激素替代疗法(HRT)降低了AAA的发病率，27而另一份报告显示HRT增加了AAA的发病率，28揭示了在HRT对AAA的影响方面缺乏共识。根据时间假说，激素治疗心血管疾病的效果取决于激素治疗更年期的时机。29,30...我们的结果表明，OVX引起17β雌二醇的减少和血管壁纤维的逐渐降解，因此，我们的结果与关于女性AAA的时间假设并不矛盾。然而，激素治疗AAA是否对绝经后妇女有益仍未定论。

据报道，在人AAA和动物AAA模型中，AAA壁脂肪细胞的异常表现与AAA的发育或破裂有关。在AAA模型动物中，血管周围脂肪组织间充质干细胞在血管壁低灌注条件下异常分化为脂肪细胞。31...脂肪细胞可加重AAA壁胶原纤维的降解。17,18,32...在人AAA中还观察到脂肪细胞的异常表现，17,19,33,34但在动脉瘤中却不是这样，因为动脉瘤的破裂几率极低。19...生物力学分析表明，AAA壁的脂肪细胞与人AAA壁的软弱有关。20...在本研究中，对照组与OVX结扎组的脂肪细胞数目和面积无明显差异，提示OVX诱导的AAA发病率和直径的增加与AAA壁脂肪细胞无直接关系。这可能是因为AAA病理的不同阶段。我们的结果表明，在AAA诱导前，OVX降解纤维，而在先前的研究中，据报道脂肪细胞在诱导后两周出现。31.

结论：OVX可增加AAA的发生率和直径，其原因可能与胶原和弹性蛋白纤维水平的降低和MMP-9水平的升高有关。在AAA发病前这些纤维水平较低可能有助于加快妇女AAA的增长速度。本研究的局限性是由于与本研究相似的血管壁比较困难，缺乏人体病理资料。此外，我们没有显示外源性性激素给药对OVX治疗组的影响。本研究所使用的AAA模型的局限性在于AAA壁缺乏动脉粥样硬化病变。需要进一步的研究来补充这项研究。

方法

动物

所有动物实验均经金代大学动物保护和使用委员会批准，并按照金代大学动物实验条例(批准号：Kaag-25-001)进行。3周龄雌性Sprague-Dawley大鼠取自清水实验室用品有限公司。(日本京都)他们被提供食物和自来水和Libitum在一个湿度控制的房间，12小时的光/暗循环。饮食组成见补充表S3...室温维持在25±1°C。1A-C).

实验1(图1)。1A)：将大鼠分为对照组(假手术组，无卵巢切除手术+AAA诱导)和OVX结扎组(卵巢切除+AAA诱导)。在1周的习惯性期后，对照组和OVX结扎组要么接受假手术，要么接受OVX手术。假手术或OVX术后3周，所有大鼠经导管结扎腹主动脉，诱导AAA。在AAA诱导后4周，测量主动脉直径，处死大鼠。

实验2(图2)。1B)：大鼠分为对照组(假手术组)和卵巢切除手术组(OVX组)。经过1周的习惯性期后，对照组和OVX组要么接受假手术，要么接受OVX手术。于假手术或OVX术后3、7周测量主动脉直径，处死大鼠。

实验3(图3)。1C)：将大鼠分为正常结扎组和OVX结扎组，如实验1所示。实验1周后，对照组和OVX结扎组均行假手术或OVX结扎。假手术或OVX术后3周，所有大鼠经导管结扎腹主动脉，诱导血管低灌注。在AAA诱导后24h，测量主动脉直径，处死动物。

当一只大鼠死于AAA破裂时，测量主动脉直径，并立即分离腹主动脉。当观察到以下特征时发现AAA：腹主动脉扩张，腹主动脉周围有血栓或出血(破裂病例)，以及血管壁胶原和弹性纤维的破坏。在实验1中，5只OVX结扎组大鼠因除破裂外死于其他原因而被排除在血管壁分析之外。所有手术均在麻醉下使用美托米定、咪唑安定和布托啡诺。所有努力都是为了尽量减少痛苦。

腹主动脉壁低灌注的诱导

如前所述，腹主动脉壁灌注不足。5,17...首先，肾下主动脉从血管周围脱落.从腹主动脉分支的血管与一根5-0丝线(日本东京的秋山-地震号)连接，以阻断血液供应。一根塑料导管(日本东京，MEDIKit)通过靠近肾动脉分支的小切口插入长度为9毫米的塑料导管，并用6-0单丝线(日本大阪阿弗里亚制药公司)修复切口。腹主动脉用5-0丝线和塑料导管结扎。用数字卡尺测量腹主动脉的直径(A&D，日本东京)。分离的组织用4%多聚甲醛(日本京都纳卡莱)固定，用蔗糖浸泡(10%、15%和20%)，植入O.C.T.复合物(日本东京樱花Finetek日本有限公司)，保存在−80°C。

组织学分析

分离主动脉横断面(10米厚)是用一个冷冻器(CM 1850；Leica Microsystems，德国韦茨拉)制成的，并安装在玻璃幻灯片上.变性胶原采用胶原杂交肽(3 Helix，犹他州，美国)定量分析，组织学染色采用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，美国贝塞斯达，MD)。脂肪细胞100μm以内的区域被定义为“脂肪细胞区”。弹性纤维分为4级：1级，完整弹性纤维；2级，无波形；3级，弹性纤维变薄和/或部分消失；4级，弹性纤维完全消失。17,35...免疫组织化学染色如前文所述。