大多数泌尿道细菌感染的来源通常被认为是肠道。在此，我们探讨肠道微生物群与细菌尿和尿路感染(UTI)的未来发展之间的关系。我们利用16S rRNA基因对168例肾移植受者的510份粪便标本进行了肠道微生物谱分析，并对粪便和尿液上清液标本进行了亚基因组测序。我们报告说，1%的相对肠道丰度埃希是一个独立的风险因素埃希细菌尿和尿路感染和1%的相对肠道丰度肠球菌是一个独立的风险因素肠球菌细菌尿。应变分析确定了在同一受试者的肠道和尿液中发现的物种之间的紧密应变水平。我们的结果支持肠道微生物群-UTI轴，表明调节肠道微生物群可能是预防UTIS的一种新策略。

尿路感染(UTI)是世界上最常见的细菌感染之一，每年影响超过1.5亿人。1...在美国，它导致超过1000万的救护车访问，每年的经济负担估计超过20亿美元。2...肾移植受者是研究尿路感染发病机制的独特人群，因为他们经常被诊断为细菌尿(无临床症状的尿培养阳性)和尿路感染(尿样培养阳性，有排尿困难、尿频、急迫或发热)。3...40%的肾移植受者在移植后第一年内出现细菌尿。4在移植后的头三年内，有50%的患者发生了尿路感染。5...在189例肾移植受者的研究中，仅无症状的细菌尿就会对患者产生严重的影响，使患肾盂肾炎的风险增加7倍。6...在大多数情况下，细菌尿症和UTIS是有效的抗生素治疗，但在少数情况下，他们可以导致发病率和死亡率。大约1-3%的UTI与细菌血症的发生有关。7,8，在一项对20，000多名肾移植受者的回顾性研究中，移植后6个月以上发生的UTIS与死亡和移植物丢失的风险增加有关。5.

UTI的发病机制复杂。肠道泌尿病原体对尿道周围间隙的污染被认为是第一步，然后是尿道和膀胱的定植。9...阐明定殖步骤的典雅研究阐明了菌毛和鞭毛在泌尿生殖道发育过程中成功繁殖中的作用。9...然而，很少有研究对UTI发育的初期阶段和肠道微生物群的作用进行了研究。在一项对26名肾移植受者进行连续肠道微生物分析的试验研究中，我们报告了肠道之间的联系。肠球菌富足与肠球菌UTIS10...在另一项最近的病例对照研究中，对患有UTIS的儿童和没有UTIS的儿童，肠道相对丰度进行了研究。大肠杆菌非泌尿系感染儿童明显高于未患非泌尿系感染儿童11...这两项研究都评估了肠道微生物群在UTI发生时是否与UTIS有关，但没有评估肠道微生物群是否是细菌尿症和UTI发展的危险因素。

本研究的主要目的是研究肠道微生物群与患细菌尿症或尿路感染的风险之间的关系。在我们的移植中心的一组肾移植受者中，在每一次临床访问中都进行常规的尿液培养，允许在这个队列中详细记录细菌尿症。我们收集了168例肾移植受者在移植后头3个月的连续粪便标本，并对其进行了16S rRNA基因的深度测序，以评价肠道微生物群与细菌尿症和尿路感染的未来发展的关系。在一组细菌尿症患者中，我们通过无细胞dna测序和成对粪便标本的猎枪亚基因组测序来评估尿液上清液标本，以评估菌株的相似性、泌尿致病基因和抗生素耐药基因。我们报告了肠道泌尿病原体的丰富程度与细菌尿症和尿路感染的未来发展有关，并且菌株分析建立了肠道和尿液中细菌尿中的物种之间的密切的应变水平一致。

肾移植队列的特点

168名肾移植受者在移植后的头3个月共提供了510份粪便标本。在移植后第1周、第2周、第4周和第12周、腹泻发作和UTI发作期间收集粪便标本。常规尿液培养在每次常规临床检查中进行(第一个月每周两次，第二个月每周一次，第三个月每2周一次，每月最多6个月)，以便对这些受试者的细菌尿症进行全面评估。对510份粪便标本进行了V4-V5高变区16S rRNA基因深度测序，平均平均±标准差(SD)为18，179±11，033。

在168个肾移植受者中，102例出现细菌尿(≥10，000菌落形成单位)(细菌组)，66例在移植后前6个月未出现细菌尿(无细菌组)。1)。临床和移植特性的差异见补充表。1...女性性别和年龄与细菌尿症组显著相关(P < 0.05). The five most abundant bacteria identified included: 36 subjects with 埃希种(spp.)细菌尿症36例肠球菌SPP.细菌尿症20例克雷伯氏菌SPP.，44名受试者葡萄球菌和19名受试者链球菌SPP.细菌尿症发作和分离的完整清单见补充表。2.

肠道丰富度及相应的菌尿群

我们评估了与细菌尿有关的五个最丰富的属的相对肠道丰度。大肠埃希菌，肠球菌，克雷伯菌，葡萄球菌，和链球菌)及其与移植前3个月内各菌尿组的关系(图1)。1)。这个埃希相对肠道丰度明显较高。埃希细菌尿组高于无菌组埃希细菌尿组1A) (P < 0.001, Wilcoxon rank sum test), and the 肠球菌相对肠道丰度明显较高。肠球菌细菌尿组高于无菌组肠球菌细菌尿组(P < 0.001, Wilcoxon rank sum test) (Fig. 1B)。相对肠道丰度克雷伯菌，葡萄球菌，和链球菌两组间差异无显着性(P>0.05)。P>0.05，Wilcoxon秩和检验)。1C-E).

肠道相对丰度和细菌尿的时间动态。细菌的相对肠道丰度Y-轴心(对数比例尺)和移植后天数的粪便标本被采集在x-轴心。510个标本分别由反映属于各自细菌群的样品的品红色点和反映各自无细菌群的蓝色点表示。由群体状态生成95%置信区间(灰色)的黄土曲线。采用Wilcoxon秩和检验，比较各组肠道相对丰度。a时间动力学埃希肾移植术后肠相对丰度埃希细菌尿群状况。b时间动力学肠球菌肾移植术后肠相对丰度肠球菌细菌尿群状况。c时间动力学克雷伯氏菌肾移植术后肠相对丰度克雷伯氏菌细菌尿群状况。d时间动力学葡萄球菌肾移植术后肠相对丰度葡萄球菌细菌尿群状况。e时间动力学链球菌肾移植术后肠相对丰度链球菌细菌尿群状况。源数据作为源数据文件提供。

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我们进一步评估了埃希和肠球菌在队列中，按性别和年龄分层(年龄≥65岁)。相对肠道丰度埃希男性样本与女性样本之间没有显着性差异(P=0.16，Wilcoxon秩和检验，补充图。2A)或介于老年和较小年龄之间(P=0.86，Wilcoxon秩和检验，附图。2B)。相对肠道丰度肠球菌女性样本明显高于男性样本(P=0.007，Wilcoxon秩和检验，补充图。2C)和相对的肠道丰度肠球菌年龄较大的样本明显高于较年轻的样本(P=0.02，Wilcoxon秩和检验，补充图。二维空间).

肠道丰度与细菌尿和尿路感染的风险

为了说明肠道相对丰度与细菌尿症发生的关系，我们利用时间相关的Cox回归分析，来评估细菌的相对肠道丰度是否是其未来发展的一个危险因素。埃希和肠球菌细菌尿，这两个属在肠道的丰度分析有显着性差异。为了考虑其他与细菌尿症相关的临床因素，我们分析了我们之前分析过的临床特征。7并对终末期肾病的病因及多变量COX回归分析中的群体反应性抗体状况进行了计算。我们利用了1%的相对丰度，因为这是局部加权散射图平滑(黄土)曲线的上限。肠球菌和埃希图中的图。1.

利用单因素Cox回归分析，将相对肠道丰度作为时间相关的协变量，我们发现1%的相对肠道丰度埃希的未来发展埃希细菌尿(危险比率[HR]：2.8，P=0.002)(表1)。在多因素分析中，包括女性性别的显著单因素特征和头孢唑林术前抗生素预防，1%的相对肠道丰度埃希继续与未来的发展埃希细菌尿症(HR：2.8，P=0.002)(表1)。我们还发现1%的相对肠道丰度肠球菌的未来发展肠球菌细菌尿症(HR：2.4，P=0.01)(表)2)。在多因素分析中，包括死亡供体移植的显着性单因素特征和延迟移植功能，1%的相对肠道丰度肠球菌继续与未来的发展肠球菌细菌尿症(HR：2.3，P=0.02)(表)2).

我们还分析了1%的相对肠道丰度之间的关系。埃希的未来发展埃希实际行动。在单因素分析中，1%的相对肠道丰度埃希的未来发展埃希UTI(HR：2.9，P在控制性别的多变量分析中，1%的相对肠道丰度埃希继续与未来的发展联系在一起埃希UTI(HR：2.8，P=0.02)(补充表3)。在单因素分析中，我们没有发现1%的相对肠道丰度与肠球菌的未来发展肠球菌UTI(HR：1.8，P=0.28)(补充表4).

肠道和尿液菌株间的相似性

为了评估肠道和尿液中菌株的相关性，我们对17份粪便标本和17份尿液培养阳性的尿液标本进行了评价。大肠杆菌 (n=14)，粪肠球菌 (n=2)，以及屎肠球菌 (n=2)(一次尿液培养均呈阳性大肠杆菌和E.粪便)和其中的相对肠道丰度埃希或肠球菌16S rRNA基因测序结果显示，16 SrRNA基因测序结果高于2%。粪便标本的收集时间与尿液标本的收集有关，见附图。3...我们选择了2%的截止值，这样我们至少可以获得5倍的基因组覆盖率。大肠埃希菌，和E.粪对于应变分析，基于估计4000万个样本的读取和50%与人类序列的一致性。

从这17份尿液标本中提取的上清液进行了单链文库的制备，进行了无细胞dna谱分析。12...猎枪宏组学测序的平均深度为55±800万次。1375%±12%(平均±SD)的序列与人类染色体相一致并被去除。对17例粪便标本进行了鸟枪亚基因组测序，平均48±6百万读深度，0.4%±0.9%(平均±SD)序列与人类染色体相一致并去除。有关尿液dna恢复量的进一步详情及估计的覆盖范围大肠埃希菌，和E.粪基因组见“补充说明”1.

我们利用了StraPhlAn14评估尿液和粪便中菌株的相关性。简单地说，Stra PhlAn将样本中的序列映射到MetaPhlan 2标记数据库中。15为样本中的物种产生一致的标记序列。然后利用肌肉16调整来自样本的一致序列以产生多序列对齐，并利用RAxMl17建立系统发育树。重要的是，每个步骤都使用后处理操作，以确保高质量的一致性序列.为了在碱基对水平上计算差异，我们利用了与欧洲分子生物学开放软件套件的距离18它测量每100个碱基对中单核苷酸变异(SNV)的数量。

利用StriphlAn，我们获得了20个一致的菌株。大肠杆菌在34份尿液和粪便标本中，有6对大肠杆菌尿液和粪便来自同一对象。图形2A显示了与之相关的系统发育大肠杆菌共识株；6株中的5株大肠杆菌尿毒株与大肠杆菌来自同一研究对象的粪便样本中的菌株。用每100个碱基对的SNVS测定，被试54尿2、36尿、41尿、106尿和165尿最接近的菌株是受试者自身粪便样本中的菌株。第七组尿液最接近的菌株是来自第四十一名受试者的尿液，但与第七组粪便的毒株非常相似(补充表)。5).

成对尿粪标本的菌株分析、泌尿致病基因和抗菌药物耐药基因。a在34份尿液和粪便标本中，有20株是一致的。大肠杆菌可以用Stra PhlAn构建。在此基础上构建了系统发育树。大肠杆菌菌株对齐(24个标记)和不同菌株之间的序列比例在x-轴心。每一点代表一个大肠杆菌来自不同颜色的尿液或粪便样本。b在34个尿液和粪便标本中，10株为E.粪便可以用Stra PhlAn构建。在此基础上构建了系统发育树。E.粪便对齐(200个标记)和不同菌株之间的序列比例记录在x-轴心。每一点代表一个E.粪便来自不同颜色的尿液或粪便样本。c在34份尿液和粪便标本中，有5株是一致的。E.粪可以用Stra PhlAn构建。在此基础上构建了系统发育树。E.粪对齐(200个标记)和不同菌株之间的序列比例记录在x-轴心。每一点代表一个E.粪来自不同颜色的尿液或粪便样本。d用HUMAnN 2检测细菌基因19并估算了以下每一种泌尿病原体的相对丰度。大肠杆菌相关基因：FimH, 帕普, CsgBAC, 巴拉，和UvrY...用泌尿系统致病基因构建了一个热图。X-轴线和大肠杆菌相关尿液样本及配对粪便样本Y-轴心。这种丰度是用蓝色的强度来表示的，原木是有比例的。e用Bowtie 2检测耐药基因21MEGARES抗生素耐药性数据库研究22RPKM用于检测对β-内酰胺、磷霉素、糖肽、磺胺类和甲氧苄啶产生抗药性的基因。构建了一个含有抗生素耐药基因类的热图。X-轴线和大肠杆菌相关尿液样本及配对粪便样本Y-轴心。这种丰度是用蓝色的强度来表示的，原木是有比例的。源数据作为源数据文件提供。

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我们获得了10个共识菌株E.粪便34份尿液和粪便标本中，有2对E.粪便尿液和粪便来自同一对象。图形2B显示了与之相关的系统发育E.粪便两种观点都是一致的E.粪便尿毒株与E.粪便来自同一研究对象的粪便样本中的菌株。用每100个碱基对进行SNVS测量，受试者4尿和54尿2最接近的菌株是受试者自己粪便样本中的菌株(补充表)。6).

我们获得了五个共识菌株E.粪34份尿液和粪便标本中，有1份E.粪尿液和粪便来自同一对象。图形2C显示了与之相关的系统发育E.粪大家一致认为E.粪尿毒症与E.粪来自同一对象的粪便样本的菌株。使用每100个碱基对的SNVS测量，受试者54尿1最接近的菌株是来自受试者自己粪便样本的菌株(补充表)7).

泌尿系统致病基因和耐药基因

我们进一步分析了14个配对的尿液和粪便样本。大肠杆菌细菌尿症导致细菌基因。用HUMAnN 2检测细菌基因序列19用总和标度归一化为相对丰度。我们评估了与尿路感染相关的下列泌尿系致病基因：20 FimH, 帕普, CsgBAC, 巴拉，和UvrY. FimH是一个基因，它是FIM编码1型毛的操纵子，允许附着在膀胱上皮上；帕普是一个基因，它是巴普操纵子编码P型毛，允许附着在膀胱上皮上；CsgBAC是配合Curli形成的操作子的一部分，可以促进生物膜的形成；巴拉和UvrY是两种信号系统的一部分，这些信号系统调节代谢途径，并允许尿路的适应。20...我们在配对尿液和粪便标本中都发现了这些基因。二维空间)。特别是，FimH, CsgBAC, 巴拉，和UvrY在14个配对的尿液和粪便样本中，大多数同时在尿液和粪便样本中发现，证明了尿液和肠道的相似性。大肠杆菌来自同一主题的菌株。在14份尿液样本中，有5份与症状有关，症状患者之间这些基因的丰度没有显着性差异。大肠杆菌UTI与无症状大肠杆菌细菌尿(P>0.05，Wilcoxon秩和检验)，但有更高丰度的趋势。CsgBAC和巴拉在症状中大肠杆菌UTI比无症状大肠杆菌细菌尿(P分别为0.08，P=0.08，Wilcoxon秩和检验)(附图)。4A-E).

我们还分析了配对尿液和粪便标本的抗生素耐药基因。用Bowtie 2检测耐药基因21MEGARES抗生素耐药基因数据库的研究22并被标准化为每百万千字节读取(RPKM)。我们评估了对以下几类抗生素产生抗药性的基因：β-内酰胺、磷霉素、糖肽、磺胺类和甲氧苄啶.利用MEGARES抗生素耐药基因数据库进行评价22包括115个基因/操纵子在β-内酰胺类；7个基因/操纵子在磷霉素类；72个基因/操纵子在糖肽类；4个基因/操纵子在磺胺类；11个基因/操纵子在甲氧苄啶类(完整的基因/操纵子列表载于补充数据中)。1)在14份配对的粪便和尿液标本中，来自同一研究对象的尿液和粪便中均含有β-内酰胺类、磺胺类和甲氧苄啶耐药基因，支持尿液和肠道的相似性。大肠杆菌来自同一研究对象的菌株(图1。2E)。在14份尿样中，我们评估了常见的和临床上有意义的β-内酰胺酶基因：CTX-M、TEM、SHV、CMY、DHA和OXA，并将这些结果与培养中分离的泌尿系病原体的药敏试验结果进行了比较(附图)。5)。在13份产生氨苄西林耐药性的尿样中，我们检测到了产生氨苄西林耐药性的TEM基因。E...大肠杆菌在培养中。此外，我们还检测了ctx-M基因，这些基因在三种尿液标本中均产生氨苄西林和头孢曲松耐药，使氨苄西林和头孢曲松耐药。大肠杆菌在文化上。

抗生素和肠道埃希和肠球菌富足

我们评估了队列中使用的最常见的抗生素是否是1%的相对肠道丰度的危险因素。埃希或1%的相对肠道丰度肠球菌在Cox回归分析中，以抗生素类作为时间依赖协变量。队列中使用的抗生素清单见补充表。8...β-内酰胺的相对危险度增加了1%。肠球菌肠道丰度(HR：4.6，P < 0.001) and cefazolin preoperative prophylaxis had a decreased hazard ratio for development of 1% relative 埃希肠道丰度(HR：0.4，P =0.03)(补充表9).

目前的研究支持泌尿致病菌起源于肠道的观点，并进一步强调肠道微生物群与肾移植受者细菌尿和尿路感染的未来发展之间的新关系。先前的研究通过评估泌尿生殖道病原体的存活和传播机制来探讨尿路感染的发病机制。9...然而，很少有研究对细菌尿/尿路感染(尿路播散)发生前的步骤进行研究。在一项试验研究中，我们评估了26例肾移植受者的连续微生物群特征，并报告了肠道。肠球菌丰度与肠球菌UTIS10，但我们无法评估肠球菌富足度是未来发展的一个危险因素。肠球菌细菌尿或尿路感染。

在这项研究中，我们发现埃希和肠球菌的未来发展埃希和肠球菌细菌尿症，分别独立于性别等临床因素。我们进一步发现埃希与症状有关埃希UTI开发。我们没有发现类似的关系。肠球菌和肠球菌但是我们可能没有足够的数量，因为36人中只有14人肠球菌细菌尿症被归类为症状。肠球菌实际行动。

为了进一步支持肠道微生物群-UTI连接，我们证明了大肠杆菌和E.粪便在尿液标本中最相似的是大肠杆菌和E.粪便在同一对象的粪便标本中。通常认为，肠道内的泌尿病原体是尿道周围污染的泌尿系感染的来源。9...然而，支持这一假设的先前证据是有限的。事实上，最近的一项研究发现大肠杆菌UTIS有不同大肠杆菌用脉冲场凝胶电泳法检测尿液和粪便中的菌株23...研究泌尿系统致病基因如FimH增加肠道的倾向大肠杆菌引起尿路感染的菌株也相对有限。24...最近的研究发现埃希或肠球菌非泌尿系感染患者与非泌尿系感染患者比较10,11，但他们没有评估肠道微生物的时间动态。我们的研究扩展了这一观点，证明了大便数量的增加埃希和肠球菌是与增加风险发展未来细菌尿与各自的有机体。我们还评估了泌尿系统致病基因的存在，如FimH以及成对的抗生素耐药基因大肠杆菌尿液和粪便样本。我们在大多数样本的尿液和粪便标本中发现了这些基因的存在，进一步支持了菌株比对分析。大肠杆菌在肠道中类似于大肠杆菌在同一对象的尿液中。有趣的是，我们确实检测了无症状的泌尿系致病基因。大肠杆菌细菌尿症。在这些病例中，可能存在泌尿致病基因，但没有积极转录，这些基因产物的存在不一定导致症状性尿路感染，或者病例实际上是症状性的，但由于没有前瞻性地评估泌尿症状的存在，所以没有对其进行评估。

我们的研究还调查了与粪便增加有关的抗生素使用情况。埃希和肠球菌丰富。我们发现β-内酰胺增加了超过1%的相对肠道丰度的风险。肠球菌. 肠球菌，特别是屎肠球菌，对这类抗生素有内在的抗药性，从而使肠球菌在其他肠道细菌被这些抗生素耗尽的情况下。我们目前的数据支持这样的观点，即抗生素可以改变肠道微生物群，增加肠道内致病菌的数量。最近的研究报告说，这些带有致病菌的非生物状态会导致除细菌外的感染并发症。艰难梭菌感染。托尔等人研究了94例骨髓移植受者的肠道微生物群特征，并报道了肠道升高的情况。肠球菌丰度与未来的发展肠球菌细菌血症和肠道蛋白质丰度的升高与细菌血症的未来发展有关。25...对28例非霍奇金淋巴瘤患者的研究，Montassier等人。报道了肠道微生物多样性是血流感染未来发展的一个预测因素。26.

肠道微生物群与细菌尿症的关系突出了一种新的肠道微生物集中疗法的潜力。有一些案例报告支持FMT可能是复发性UTI的一种潜在治疗方法的观点。在一个案例中，一个心脏和肾移植受者谁发展成多个事件肠球菌细菌血症和泌尿系感染以及复发艰难梭菌感染，FMT降低粪便丰度肠球菌在肠子里，并导致了.肠球菌感染患者长达14个月27...用于复发的FMT系列艰难梭菌在非移植人群中，fmt后一年的非移植感染数量显著低于fmt前一年的非移植感染数量。28...然而，在这个案例系列中，粪便微生物群在FMT之前和之后都没有被描述。

这项研究的一个重要考虑因素是尿液和粪便标本交叉污染的可能性。然而，我们采取了几个步骤，以尽量减少其影响。关于粪便样本的尿液污染问题，我们使用人类微生物组项目中使用的渔标样本收集试剂盒收集粪便样本。29根据设计，尽量减少粪便样本中尿液的交叉污染。30...我们还强调了粪便和尿液中细菌生物量的显著差异。31使粪便样本的尿液污染不可能影响我们的分析。关于尿液标本的粪便污染，要求受试者提供清洁捕获的中流尿液标本，作为常规临床护理的一部分。我们进一步强调，我们的分析也侧重于评估肠道微生物群与UTI之间的关系。尿路感染不太可能是污染事件，因为受试者在尿液培养阳性的同时出现了症状，因此这种分析不太可能受到这种污染的影响。我们的研究也被设计为一种前瞻性的粪便标本收集，粪便标本是在细菌尿症或尿路感染发生之前收集的，使收集过程相互独立。尽管采取了这些措施以尽量减少交叉污染，但必须谨慎地解释这项研究的结果，因为尿液和粪便样本的交叉污染是一种潜在的混淆。

此外，在菌株分析方面，我们无法接触到临床微生物实验室为常规临床护理而分离的泌尿系菌株。与血液分离物不同的是，尿分离物不会保存很长一段时间。然而，我们能够利用一种计算算法(StraPhlAn)来重建一致菌株，以评估菌株之间的相关性。虽然这一方法对同一对象的尿液和粪便菌株的遗传相关性进行了评估，但由于从短碱基对读取的一致菌株的重建而受到限制，而且可能无法反映如果细菌分离物可供分析的菌株的全部序列。我们也没有从捐献者的尿液，以评估是否存在供体来源的感染。然而，在14个案件中大肠杆菌对细菌尿进行细菌分析，其中8例尿样培养在诊断菌尿前均为阴性，提示受检者发生了新的感染。在多变量分析中，我们包含了许多与肾移植受者UTI相关的变量，但由于事件的发生和输尿管支架的存在，我们无法包括急性排斥反应或长期使用Foley导管，因为所有受试者都放置了输尿管支架。我们对症状进行了回顾性图表审查，以区分有症状的UTI和无症状的细菌尿症；因为这不是一个前瞻性的症状集合，所以我们可能没有捕捉到所有有症状的UTIS病例。最后，我们无法评估移植前和移植后肠道微生物的变化，因为我们只有五个在移植前提供标本的受试者。

尽管有这些限制，我们的数据支持泌尿生殖道丰富度是细菌尿症和尿路感染的危险因素。我们的结果进一步支持了关于调节肠道微生物区系作为预防UTIS的潜在新策略的未来研究，特别是在反复出现UTIS的情况下。

肾移植队列

2015年8月至2016年11月，280名肾移植受者同意连续收集粪便和尿液标本，168名肾移植受者至少提供了1份粪便标本。威尔康奈尔机构审查委员会批准了这项研究，每个研究对象都给予书面知情同意。没有从囚犯那里获得器官，所有的肾移植受者都是在纽约长老会医院-威尔康奈尔医疗中心进行的。尿液标本在纽约长老会医院-威尔康奈尔医学中心的临床微生物实验室进行分析。将尿标本接种到羊血(Becton，Dickinson and Company[BD]，Franklin Lake，NJ)和MacConkey琼脂(BD)上，每只尿液用1微升接种循环接种，并在35°C环境空气中培养，定义为移植后前6个月(移植后210天)尿培养阳性(每毫升尿中有一个潜在泌尿病原体的≥10，000个集落形成单位)。临床尿路感染与细菌尿症的区别在于有细菌尿症，症状包括：排尿困难、频率、急迫或发烧。3在移植后的前6个月，由一个人通过图表检查确定症状。用标准鉴定法和肉汤微量稀释法药敏试验平台鉴定分离的细菌，并对其药敏谱进行测定。根据培养年份：m100-s25，使用临床和实验室标准研究所M 100文件解释抗菌药物敏感性数据。32(2015年)或M100-S2633(2016年)。由于初步数据有限，没有对肠道微生物丰度与细菌尿症之间的关系进行先验样本大小测定。

粪便标本收集

受试者被给予一个渔牌厕所标本收集工具包(费舍尔科学，新罕布顿，美国)，并被要求提供一个粪便标本。作为住院病人，粪便标本保存在4°C，作为门诊病人，受试者用冰袋保存标本。粪便标本被收集并引用到大约200毫克的阿利古特中，保存在−80°C。在移植后的第1周、第2周、第4周、第12周和腹泻发作期间以及在UTI发作期间收集粪便标本。仅限于移植后前3个月(移植后120天)的510份粪便标本，但来自肾移植受者有反复细菌尿的另外两份粪便标本除外(这些样本用于菌株分析)。同时采集大便和常规尿样时，临床访视时只同时采集28份(5%)。在大多数情况下，粪便样本是从家里(n=269，53%)或在医院收集(n=213，42%)。

DNA提取、16S rRNA基因扩增和测序

进行DNA提取、16S rRNA基因扩增和深度测序。34...进行DNA提取、16S rRNA基因扩增和深度测序的研究小组不了解标本的细菌群状况。简单地说，用含500μL萃取缓冲液(pH8.0/200 mm NaCl/20 mm EDTA)、500μL苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、200μL 20%SDS和500μL 0.1 mm直径氧化锆/二氧化硅的溶液从冷冻粪便中提取DNA。用打浆机机械破碎粪便标本2 min，再加两轮苯酚：氯仿：异戊醇萃取。用乙醇沉淀法分离DNA，再悬浮于50μL的1xTE缓冲液中，酶浓度为100μg/mL。DNA的进一步纯化使用QIAamp微型自旋柱(齐根，希尔登，德国)。对每个样品进行重复的50μL PCR反应，每个反应含有50 ng纯化的dNTPs，0.2mmdNTPs，1.5mmMgCl。2、2.5U白金Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液2.5μL和设计用于扩增16S rRNA基因V4-V5区的0.5μM：563 F(5‘-nnnnnnn-NNNNNNN-AYTGGGGGGGGDTAANG-3’)和926 R一个独特的12基基Golay条形码(NS)先于引物识别样本。35，在条形码之前增加1到8个核苷酸，以抵消引物的测序。循环条件为94℃3 min，其次为94°C 50 s，51°C 30 s，72°C 1 min。最后伸长率为72℃，时间为5 min。将复制的PCRS聚合在一起，用ChiaQuickPCR纯化试剂盒对PCR产物进行进一步纯化(Chiagen，Hilden，德国)。将PCR扩增产物按等摩尔数进行定量和聚合，并使用Illumina TruSeq样品制备协议(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)与Illumina条形码和适配器连接。在IlluminaMiSeq平台上，用250 bp×250 bp试剂盒对已完成的文库进行测序。

16 SrRNA测序生物信息学

将16 SrRNA基因配对末端读码与uparse合并、解复用并运行。36管道到：(A)使用最大期望错误执行错误筛选37(B)将序列划分为操作分类单元(OTUS)(97%基于距离的相似性)，以及(C)使用新的和基于参考的方法识别和删除潜在的嵌合序列。分类分配是通过使用包含核苷酸BLAST的自定义Python脚本来执行的。38，与NCBI RefSeq合作39作为参考训练集。我们使用NCBI RefSeq作为培训集，就像我们以前所做的那样。34,40,41因为它可以捕获物种级的分辨率，通过管理和手工检查的结果和提交来源。最小值E-1×10的阈值−10使用了任务分配。

统计分析

用双尾Wilcoxon秩和检验比较连续变量的分布；用双尾Fisher精确检验比较范畴变量的分布。采用Cox回归危险模型估计某一特定生物的相对粪便丰度是否与同一生物的细菌尿症相关，并将其作为一个时间依赖的协变量，假设该丰度值直到第一次微生物丰度值超过临界值时才进行交叉。采用多变量Cox回归风险模型对我们先前分析过的临床变量进行了评价。7以及终末期肾脏疾病的病因及计算面板反应性抗体的状况。使用一个类似的Cox回归风险模型来估计抗生素类是否与相对粪便丰度的形成有关。肠球菌或埃希作为一个随时间变化的协变量。所有分析均在R3.3.3中进行，其中Yingtools 2 0.0.0.89、phyloseq 1.19.1、dplyr 0.7.7、Tible 2.1.1、Repe2 1.4.3、data.table 1.10.4-3、标度0.5.0、Hmisc 4.1-1、string 1.4.0、string 1.4.3、生物格式1.2.0、两年期0.7.7、coxphf 1.12和ggtree 1.11.6。

配对尿液和粪便标本的菌株分析

尿液标本也是作为我们中心生物库的一部分在肾移植受者中连续采集的。17份尿液样本的尿液培养呈阳性。大肠杆菌 (n=14)，E.粪便 (n=2)，以及E.屎(N)=2)(一份样本对两者均为阳性大肠杆菌和(E.粪便)...最接近尿液样本的粪便样本，其相对肠道丰度也大于其中之一的2%。埃希或肠球菌作为配对标本。我们选择了2%的截止值，这样我们至少可以获得5倍的基因组覆盖率。大肠埃希菌，和E.粪用于应变分析。

尿液标本在2000×离心时离心。g收集同一天，取尿30 min，取尿上清液在−80°C保存1mL。用鸡胶原循环核酸试剂盒从尿液中提取无细胞DNA。用HS dsDNA试剂盒用Qubit荧光计定量提取的无细胞DNA量(英国伦敦，Qubit)。采用单链库的制备方法。13...简单地说，去细胞DNA被变性并连接到生物素化的寡核苷酸上.对链霉亲和素功能化磁珠进行引物延伸。将另一组适配器连接在一起，用PCR扩增产物(4~12个周期)。利用AATI片段分析仪对文库进行了表征，并在Illumina Next Seq仪上对样品进行了汇总和测序(成对端，75 bp×75 bp)。13...考虑到潜在的低生物量，我们在每批样品中加入了模板DNA(IDT-DNA合成寡核苷酸混合长度为25，40，55，70 bp，在TE缓冲液中洗脱0.20μM)的对照。

17份粪便样本进行了上述DNA提取，并使用Qubit荧光计(Qubit)进行了量化。测序库是使用Illumina Tru Seq Kit(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)编写的。采集样品，用Illumina Hi Seq 4000仪器进行测序(成对端，100 bp×100 bp)。

我们使用contaddata v.0.5.2使用Bowtie 2 v0.121修剪成对的FASTQ文件并删除人类序列。微生物序列覆盖率由修剪后和人类序列去污染后的读数计算，乘以MetaPhlan 2 2.6.0估算的生物比例。15，乘以每次读取的碱基对数，除以生物体的基因组长度。然后，我们使用了Stra PhlAn 2.6.0。14为了获得一致的菌株大肠埃希菌，和E.粪...MetaPhlAN 2 2.6.015对揉数据后的级联FASTQ文件进行分析，使用sample2标记脚本获取每个样本的标记信息，并利用Stra PhlAn脚本对齐生成树。标记信息大肠埃希菌，和E.粪从MetaPhlan 2数据库中提取。使用默认的松弛的2个StremePhlAn参数(标记_in_clade 0.2、Sample_in_mark 0.2、N_in_mark 0.8、GAP_in_Sample 0.8)。使用修改后的StraPhlAn ggtree R脚本对该树进行了进一步分析。

泌尿系病原菌/抗生素耐药基因分类

用HUMAnN 2对揉数据后连接的FASTQ文件进行分析。19...用总和标度将所有细菌基因归一化为相对丰度。生成了配对的热图。大肠杆菌尿液和粪便样本。

使用Bowtie 2对齐揉数据后的级联FASTQ文件21MEGARES耐药基因数据库的敏感模式22...将抗生素耐药基因归一化为每百万千字节读取量(RPKM)，并将其归为抗生素类。生成了配对的热图。大肠杆菌尿液和粪便样本。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

所有的测序数据以及支持本研究结果的未识别的临床数据都已上载到基因型和表型数据库(Dbgap)，并有登录号。phs001879.v1.p1...需要地方机构审查委员会的批准才能获得测序数据以及不确定的临床数据。图中的源数据。1, 2、表1, 1、补充图。1–5，和补充表1–9作为源数据文件提供。