致病性CARD11突变通过非规范途径影响B细胞发育和分化

致病性CARD11突变通过非规范途径影响B细胞发育和分化

CARD11通过在T细胞或B细胞检测到抗原后在细胞内NF-κB信号传导中的作用而成为适应性免疫的关键参与者。 CARD11突变与不同的免疫缺陷有关，这些缺陷与异常的NF-κB激活有关，现在Wei等。 已经表征了影响AKT-FOXO1信号轴的其他CARD11突变。 他们使用三种不同的小鼠模型模拟了与CARD11相关的不同病理学，他们发现CARD11可以充当B细胞中AKT-FOXO1信号轴的负调控因子，而与NF-κB无关。 这项研究揭示了CARD11的非规范作用，它影响B细胞的发育和分化，并提供对诸如BENTA疾病等免疫缺陷的见解。

摘要

致病的CARD11突变会导致异常的核因子κB（NF-κB）激活，这可能与多种免疫疾病有关。但是，是否存在不依赖于NF-κB的调控机制导致与发病机理相关的CARD11突变仍未确定。使用三种不同的遗传小鼠模型，模仿原发性免疫缺陷的Card11基因敲除（KO）小鼠模型，代表BENTA（患有NF-κB和T细胞无反应性的B细胞扩增）疾病的CARD11 E134G点突变小鼠模型以及带有致癌性K215M的小鼠模型突变，我们显示CARD11具有非规范的功能作为AKT-FOXO1信号轴的负调节剂，独立于NF-κB激活。尽管与BENTA疾病相关的E134G突变体提高了NF-κB的激活，但我们发现E134G突变体小鼠在表型上复制了Card11 KO小鼠，其中NF-κB的激活被破坏。从机理上讲，与Card11 KO细胞类似，E134G突变体会导致B细胞中的AKT活化加剧并降低FOXO1蛋白。此外，致癌的CARD11突变体K215M增强了CARD11非规范功能的重要性。与E134G突变体相反，K215M对AKT活化具有更强的抑制作用，并且FOXO1更稳定。同样，E134G和K215M突变体对B细胞的发育和分化产生相反的影响。我们的结果表明，除NF-κB外，CARD11还控制B细胞中的AKT / FOXO1信号通路。致病性CARD11突变体对AKT-FOXO1信号轴上这种非规范调节功能的影响进一步揭示了CARD11的关键作用。

介绍

CARD11在适应性免疫中起重要作用，因为它通过与B细胞淋巴瘤/白血病10（BCL-10）和粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤易位形成蛋白复合体来控制抗原受体诱导的核因子κB（NF-κB）活化。蛋白1（MALT1）（1-3）。它对于淋巴细胞的活化和增殖以及特定类型的B细胞发育至关重要（4-8）。 B细胞的发育开始于骨髓（BM），并产生不成熟的B细胞。然后，未成熟的B细胞进入脾脏，并通过T1，T2和T3阶段进一步分化为过渡性B细胞。过渡性B细胞最后分别成熟为边缘区（MZ）B细胞和滤泡（FO）B细胞（9）。抗原攻击后，活化的成熟B细胞在生发中心（GC）中进行阳性选择，其中FO辅助T细胞促进体细胞超突变，抗体亲和力成熟和类别转换重组（10）。小鼠模型中Card11缺乏会阻碍MZ B细胞发育，并损害抗原刺激后成熟B细胞的活化和增殖（4-7）。

在人类中，CARD11中的致病性突变会导致各种免疫疾病。功能丧失（LOF）CARD11突变或缺失未能激活淋巴样细胞中抗原受体诱导的NF-κB信号通路，从而损害了适应性免疫，从而导致患者出现严重的合并原发性免疫缺陷（PID）（11-14 ）。相反，具有过度活化的NF-κB的功能获得（GOF）CARD11突变可引起恶性B细胞增殖，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 DLBCL是一种侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，在10％的DLBCL病例中发现了CARD11突变（15、16）。在BENTA（具有NF-κB和T细胞无反应性的B细胞扩增）疾病中也报道了生殖细胞GOF CARD11突变，该疾病具有升高的NF-κB活性和过度增殖的B细胞（17）。据信，异常的NF-κB信号传导在这些免疫疾病的发病机理中起主要作用。 BENTA疾病相关的CARD11 GOF突变体也与患者的免疫缺陷有关，尽管与LOF CARD11突变体引起的PID相比，症状不那么严重（17、18）。详细的机制仍然难以捉摸。

我们已经生成了带有GOF BENTA疾病相关CARD11突变体的点突变小鼠模型，其中甘氨酸替代了保守的谷氨酰胺残基E134G。由于存在起始密码子，因此CARD11 E134G突变体的命名法对应于先前报道中的E127G（17）。我们使用这种小鼠模型来更好地了解体内免疫缺陷疾病中CARD11突变体的未表征特征。

结果

Card11 E134G突变体损害了与Card11 KO小鼠无关的T细胞体液免疫的发育

E134G突变小鼠（图S1A）的B细胞中的Card11 mRNA水平与野生型（WT）对照中的Card11 mRNA水平相同。然而，由于如先前报道（19），由于NF-κB活化引起的CARD11蛋白降解，E134G突变体的CARD11水平降低（图S1B）。该表型也与先前报道的在转染的人类淋巴细胞中CARD11 E134G突变蛋白表达水平降低有关（17）。体液免疫主要由B细胞介导，B细胞起源于胎儿肝脏或成年BM（20）。最初，我们评估了CARD11 E134G突变体对BM中B细胞早期发育的影响。与同窝幼仔WT对照相比，E134G突变小鼠中的前体B细胞（pre-B细胞）群体略有减少，而未成熟和过渡性B细胞则没有变化（图S1C）。 E134G突变小鼠的脾脏未如BENTA病患者报道的那样肿大（图S1D）。同时，在E134G突变小鼠的外周血中，过渡性B细胞数量没有变化（图S1E），这也不代表患者中发现的表型（17）。这些可能是由于人类和小鼠模型之间的差异或患者的免疫学特征所致，而我们的实验性小鼠模型则没有此特征。

NF-κB活性对于MZ和FO B细胞发育都是必不可少的（21）。因为CARD11 E134G突变体是具有同时上调的NF-κB激活的GOF突变体（17），所以我们期望MZ B细胞成熟度增加，如先前在NF-κB组成性激活的小鼠模型中所示（22）。但是，在E134G突变小鼠中，与WT对照相比，MZ B细胞数量明显减少，并伴随着更多的FO B细胞（图1A）。对过渡性B细胞发育的详细分析表明，E134G突变型小鼠在T1和T3阶段的细胞群体轻度减少，但T2阶段的细胞增加（图1B）。这表明E134G突变体可能在过渡B细胞阶段具有发育缺陷。

图1 Card11 E134G突变体损害了与Card11 KO小鼠无关的T细胞体液免疫的发育。

（A）顶部：来自WT和E134G突变小鼠脾脏的B220 + CD93-成熟B细胞中MZ和FO B细胞比例的流式细胞仪分析。下图：计数脾脏中的MZ和FO B细胞绝对数，并显示如下（n = 5）。 （B）在T1（IgM + CD23-），T2（IgM + CD23-）和T3（IgM- CD23-）阶段的WT和E134G突变B220 + CD93 +过渡性B细胞的流式细胞仪。过渡T1，T2和T3电池的百分比如下所示（n = 5）。 （C）WT和E134G突变小鼠PC中CD19 + B220mild B1 B细胞和CD19 + B220high B2-B细胞的流式细胞仪染色。计算PC中B1和B2 B细胞的绝对细胞数，并显示如下（n = 4）。 （D）顶部：通过流式细胞仪测量B1 B细胞的CD5 + CD43 + B1a和CD5-CD43 + B1b亚型。底部：还计算了B1a和B1b细胞的总数（n = 5）。 （E）WT和E134G突变小鼠的7天新生脾脏中CD5 + CD43 + B1a和CD5-CD43 + B1b细胞的流式细胞仪分析。还测量了B1a和B1b细胞的总细胞数，并显示如下（n = 4）。 （F和G）在用50μgNP-LPS或NP-Ficoll免疫12天后，通过酶联免疫吸附法评估了WT和E134G突变小鼠中的NP特异性抗体（n = 4）。 OD450，450 nm处的光密度。 （H）顶部：通过流式细胞术分析了WT和Card11 KO小鼠脾脏中的MZ和FO B细胞。下图：测量了WT和Card11 KO小鼠脾脏中的MZ和FO B细胞百分比（n = 5）。 （I）WT和Card11 KO小鼠PC中B1和B2 B细胞的流式细胞仪分析。 B1和B2 B细胞的百分比显示如下（n = 4）。 （J）通过流式细胞术测量WT和Card11 KO小鼠PC中的B1a和B1b细胞。 B1a和B1b细胞的百分比显示如下（n = 6）。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001，配对t检验。 N.S.，不重要。所有数据均为平均值±SEM。

接下来，我们分析了另一类外周血B细胞B1 B细胞，它们主要位于腹膜腔（PC）中。 基于CD5表达，B1 B细胞可以进一步分为B1a和B1b亚型。 像许多其他B细胞类型一样，B1 B细胞发育也需要NF-κB活性（23）。 出乎意料的是，在E134G突变小鼠的PC中消融了B1 B细胞，尤其是B1a细胞（图1，C和D）。 B1 B细胞的早期发育过程主要发生在胎儿和新生儿阶段，然后在成年小鼠中减少（24）。 因此，为了分析B1 B细胞的早期发育，我们收集了7天大的新生小鼠的脾细胞，因为大多数脾脏过渡B细胞都有发展为B1 B细胞的潜力。 E134G突变体阻碍了新生儿过渡性B细胞向新生儿CD5 + B1a细胞的发育（图1E），并伴随着T1期的显着减少和T2期的增加（图S1F）。

B细胞以非T细胞（TI）或T细胞依赖性方式产生抗病原体感染的抗体。在没有抗原特异性T细胞帮助的情况下，B1 B细胞和MZ B细胞积累为抵抗感染的第一道防线，从而提供了快速但特异性较低的抗体应答（25）。因此，B1和MZ B细胞也被认为是先天性B细胞（26）。我们用非蛋白质免疫原NP-LPS（脂多糖）和NP-Ficoll免疫了E134G突变小鼠，这可以引起MZ和B1细胞介导的TI抗体反应（27）。与WT对照小鼠相比，E134G突变小鼠未产生针对NP-LPS和NP-Ficoll的免疫球蛋白M（IgM）或IgG抗体反应（图1，F和G）。这些结果概括了来自BENTA病患者的临床数据，他们对TI抗原（例如基于多糖的疫苗）的疫苗接种反应明显受到损害（17）。我们还分析了仅具有一个E134G突变等位基因的杂合小鼠的表型，发现MZ（图S1G）和B1 B细胞发育（图S1H）以及从T1到B的过渡B细胞群体存在中间缺陷。与E134G纯合突变小鼠相比（图S1I）。我们相信，由E134G突变体引起的TI体液免疫缺陷是导致BENTA疾病患者免疫缺陷症状的原因，而杂合突变足以引起疾病表型。

与WT B细胞相比，E134G突变B细胞甚至在B细胞受体（BCR）刺激之前就显示出增强的核因子κBα（IκBα）磷酸化抑制剂所反映的自主激活的NF-κB（图S2A）。我们生成了Card11基因敲除（KO）小鼠，并将其B细胞发育表型与E134G突变小鼠进行了比较。如前所述（4-7、28），在不存在CARD11的情况下，抗原刺激的NF-κB活化被破坏，反映为纯化的B细胞中IκBα磷酸化以及受损的IκBα降解（图S2B）。在E134G突变MZ和B1 B细胞中，总IκBα也降低，但在Card11缺失的MZ和B1 B细胞中，总IκBα升高（图S2，C和D）。这些数据证实了先前的发现，即E134G是抗原诱导的NF-κB途径的GOF突变体（17）。但是，E134G突变小鼠中的MZ和B1 B细胞发育表型让人联想到Card11缺陷型小鼠中报道的类似表型（4-7）。 Card11缺陷型小鼠的脾脏MZ B细胞（图1H）和PC中的B1 B细胞（图1，I和J）减少。之前曾有人提出CARD11以NF-κB依赖性方式调节MZ和B1 B细胞的发育，因为具有组成性激活NF-κB活性的小鼠增强了MZ和B1 B细胞的发育（22）。但是，携带E134G突变（导致NF-κB活性升高）的小鼠具有与Card11缺陷型小鼠相同的发育缺陷。总之，我们的数据挑战了当前的CARD11模型，并表明E134G突变体在CARD11调控的MZ和B1 B细胞发育中也具有未知的功能，而与NF-κB途径无关。

Card11 E134G突变体通过FoxO1途径加剧AKT激活并损害B细胞发育

为了弄清E134G突变体是否对MZ和B1 B细胞发育产生细胞内在作用，我们通过将E134G突变体小鼠的BM细胞与WT控制小鼠的BM细胞混合而生成了BM嵌合小鼠，该小鼠通过转基因表达绿色荧光蛋白并将这种BM混合物重新引入亚致死剂量辐照的小鼠体内（29）。 GFP用作标记，以区分嵌合体中的WT细胞与E134G突变细胞，并且GFP的表达不会改变脾脏和PC中B细胞的发育潜能（图S3，A至C）。在嵌合小鼠的脾脏中，具有E134G突变的MZ B细胞相对于WT（GFP +）MZ B细胞明显减少（图2A，左）。 WT和E134G突变型FO B细胞以相似的频率出现在受体小鼠中（图2A，右）。在嵌合体的过渡性B细胞阶段，E134G突变体破坏了过渡性B细胞发育，如减少的T1期细胞和增加的T2期种群所示（图S3D）。 WT B1 B细胞是嵌合小鼠PC中细胞的重要部分，而来自E134G突变小鼠的B1细胞可以忽略不计。但是，PC中的B2细胞在WT和E134G突变细胞之间具有可比性（图2B）。这些结果表明，E134G突变以细胞内在的方式对MZ和B1 B细胞发育产生影响。

图2 Card11 E134G突变体通过FoxO1途径加剧了AKT激活并损害了B细胞的发育。

（A）在WT（GFP +）和E134G（GFP-）突变BM混合嵌合体中，对WT（GFP +）MZ和FO B细胞以及E134G（GFP-）突变MZ和FO B细胞进行流式细胞术分析。测量每组的百分比，并显示如下（n = 5）。 （B）通过流式细胞术分析嵌合体PC中的B1和B2B细胞，B1和B2B细胞的百分比显示如下（n ＝ 4）。 （C）从WT和E134G突变B细胞获得的RNA-seq数据上的FoxO途径基因的GSEA分析。 FDR，错误发现率。 （D）在不同的时间点用抗IgM（20μg/ ml）刺激来自WT和E134G突变小鼠的静息B细胞，并通过Western blot检测AKT308，AKT473，FOXO1和S6的磷酸化。 （E）通过流式细胞术（n ＝ 4）测量WT和E134G突变小鼠的MZ和FO B细胞中T308残基上的AKT的磷酸化。 （F）通过流式细胞术测量来自WT和E134G突变小鼠的MZ和FO B细胞中的总FOXO1蛋白水平（n ＝ 4）。 （G）WT和E134G突变小鼠脾B细胞中FOXO1靶基因表达的qRT-PCR分析。 （H）分别用空的逆转录病毒或FOXO1逆转录病毒转导WT和EG BM造血干细胞，然后将其应用于BM嵌合体。 6周后，通过流式细胞术分析受体小鼠脾脏中的GFP阳性MZ B细胞。 MSCV，鼠干细胞病毒。 （I）逆转录病毒转导的BM嵌合体中GFP阳性脾脏B细胞中MZ B细胞的百分比显示在右侧。 （J）在不同的时间点用抗IgM（20μg/ ml）刺激来自WT和Card11 KO小鼠的静息B细胞，并通过免疫印迹测量AKT308，AKT473，FOXO1以及总AKT和FOXO1的磷酸化。将免疫印迹定量标准化为肌动蛋白，如下所示。 （K）通过流式细胞术测量来自WT和Card11 KO小鼠的MZ和FO B细胞中的AKT磷酸化（n = 4）。 （L）通过流式细胞术测量来自WT和Card11 KO小鼠的MZ和FO B细胞中的总FOXO1蛋白水平（n ＝ 5）。 （M）WT和Card11 KO脾脏B细胞中FOXO1靶基因表达的qRT-PCR分析。 * P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001，配对t检验。所有数据均为平均值±SEM。

为了阐明CARD11调节MZ和B1 B细胞发育的潜在机制，我们使用了RNA测序（RNA-seq）对E134G突变B细胞进行转录组分析。京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集分析显示，FoxO信号传导是E134G突变B细胞中最显着改变的途径（图S4A）。基因集富集分析（GSEA）也证实FoxO基因标记在E134G突变型过渡B细胞中被下调（图2C）。在B细胞中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和雷帕霉素复合物2（mTORC2）的哺乳动物靶标可以通过分别在T308和S473残基处磷酸化AKT来活化AKT，并且活化的AKT磷酸化FOXO1并从核中排除FOXO1（30）。 FOXO1是调节B细胞发育的关键转录因子（31）。我们从WT和E134G突变脾脏中纯化了静止的B细胞，并用山羊抗小鼠IgM刺激了它们，以激活BCR下游信号传导。与野生型相比，在BCR刺激后，E134G突变B细胞中的磷酸-AKT308，磷酸-AKT473和FOXO1磷酸化都增加了（图2D）。但是，在E134G突变B细胞中，mTORC1 S6磷酸化的下游靶标以及AKT的上游调节子（如SYK和PDK1）的激活没有改变（图S4B）。我们还通过流式细胞术在B细胞的不同亚型中测量了AKT磷酸化和总FOXO1蛋白水平。来自E134G突变体的其余MZ和FO B细胞都具有更大的AKT磷酸化（图2E）和降低的MZ B细胞中总FOXO1表达水平（图2F）。我们通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）评估了WT和E134G突变体静止B细胞中FOXO1调控的基因表达。与来自RNA-seq转录组分析的数据类似，大多数FOXO1调控的基因，特别是与细胞周期相关的基因表达，例如细胞周期蛋白D2（CCND2），在E134G突变B细胞中被下调。调节性细胞因子II-10和终末分化调节剂基因Prdm1也显着降低（图2G）。 E134G突变B细胞中IL-10的蛋白水平降低（图S4C），并且还观察到了细胞周期蛋白CCND2的相同降低趋势（图S4D）。 E134G突变与MZ和FO B细胞（图S4E）以及过渡性B细胞（图S4F）的细胞活力变化无关，这通过胱天蛋白酶3的细胞内裂解来测量。但是，DNA细胞循环分析证实，与WT相比，来自E134G突变体的过渡B细胞和成熟B细胞导致进入S期的细胞更少（图S4，G和H）。 E134G杂合突变体的AKT和FOXO1磷酸化水平也升高，但在野生型和纯合突变体细胞之间处于中等水平（图S5A）。还观察到成熟B细胞中FOXO1靶基因表达的相同趋势（图S5B）。这些数据表明，E134G突变的单个等位基因足以影响AKT / FOX1信号轴并有助于BENTA疾病的发病机理。

最后，我们通过逆转录病毒转导在WT和E134G突变型造血干细胞中引入了异位FOXO1表达，并将转导的细胞应用于BM嵌合体。 6周后，更高水平的FOXO1不仅增强了嵌合体中WT MZ B细胞的发育，而且还挽救了E134G突变MZ B细胞的发育缺陷（图2，H和I），这证实了E134G突变体破坏了MZB。通过FOXO1途径的细胞发育。

如在E134G突变B细胞中所见，用抗IgM刺激Card11 KO B细胞与类似的AKT信号增强相关，并且在Card11 KO B细胞中AKT的磷酸化和FOXO1的磷酸化均增加（图2J）。体外流式细胞仪分析表明，与WT相比，Card11 KO MZ和FO细胞中T308处的AKT磷酸化增强（图2K），总FOXO1蛋白水平降低（图2L）。缺乏Card11的B细胞还显示出FOXO1靶基因表达的下调，如Ccnb1，II-10和Prdm1（图2M），与在E134G突变B细胞中观察到的相似。

这些数据表明，CARD11作为AKT信号通路激活的负调节剂具有非规范作用，与抗原受体刺激后的NF-κB激活无关。 WT CARD11的缺乏加剧了AKT的活化，促进了下游FOXO1的磷酸化和降解，并减弱了FOXO1目标基因的表达。尽管CARD11 E134G突变体具有增强激活NF-κB的潜力，但它失去了其负调控功能，这导致了Card11 KO细胞中增强的AKT激活。

Card11 K215M突变体通过抑制AKT激活来加速B细胞发育

据报道，包括AKT在内的各种调节蛋白都可以结合CARD11并促进CARD11介导的NF-κB活化（32）。 CARD11包含几个独特的蛋白质结构域，包括CARD，卷曲螺旋（C-C），接头，PDZ和MGUK结构域。通过应用不同的CARD11片段，我们证实了CARD11的C-C结构域对AKT结合至关重要（图S6A）。 C-C结构域也是致病性CARD11突变的热点（15、33）。除BENTA疾病外，大多数与DLBCL相关的CARD11突变都位于C-C结构域上。 DLBCL可以分为活化B细胞样（ABC）型和生发中心B细胞样GCB（34）。大多数致癌的CARD11突变会导致NF-κB活化升高，并显示出对ABC型DLBCL的偏爱（35、36）。在GCB型DLBCL中报告了一些CARD11突变体，例如K215M和L232LI（图S6B）。我们测试了几种CARD11致癌突变体（包括G123S，K215M和L232LI）与WT CARD11和E134G突变体的个体AKT结合能力。免疫共沉淀数据表明，CARD11突变体具有与AKT的各种结合能力。与WT CARD11相比，E134G突变体和G123S突变体与AKT的结合活性降低（图S6C）。与WT CARD11相比，GCB型CARD11突变体K215M显示出增强的AKT结合，而L232LI突变体与WT CARD11具有相似的结合亲和力（图S6C）。接下来，我们将WT CARD11和各种CARD11突变体转导到两个人B细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly10（ABC-DLBCL型）和OCI-Ly19（GCB-DLBCL型）中，并测量了它们对AKT磷酸化的影响。我们发现E134G和G123S突变体可以增强OCI-Ly10细胞系中的AKT磷酸化，而K215M和L232LI突变体则抑制AKT激活（图S4D）。在OCI-Ly19细胞中，E134G和G123S突变体也增加了AKT活化，但是K215M和L232LI突变体则轻度抑制AKT磷酸化（图S6E）。 CARD11的CC缺失形式对任一DLBCL细胞系中的AKT激活几乎没有影响。据报道，AKT K63泛素化促进了AKT膜的募集和进一步激活（37、38），并且我们研究了CARD11突变体是否影响转染的293T细胞中AKT K63泛素化。在存在WT CARD11的情况下，AKT K63泛素化被抑制，表明WT CARD11是AKT激活的负调节剂，并解释了Card11 KO B细胞中更强的AKT激活。与WT对照相比，在用CARD11突变体转染的细胞中，E134G增强了AKT K63泛素化，而K215M和L323LI突变体抑制了K63泛素化（图S6F）。无法与AKT结合的CARD11的CC缺失形式也增强了AKT泛素化。各种WT和CARD11突变体引起的AKT K63泛素化改变对应于它们对稳定细胞系中AKT活化的不同调节作用。因此，CARD11及其突变体通过调节AKT K63泛素化途径来调节AKT活性。因为与WT对照相比，可降低AKT泛素化和激活的L232LI突变体与AKT的结合亲和力与WT CARD11相同，这也表明AKT与不同CARD11突变体之间的相互作用强度对于调节AKT活性可能不是关键的。

连同K215M突变体对OCI-Ly19细胞中AKT活化的抑制作用和转染的293T细胞中K63泛素化的作用，数据表明，与E134G突变体相比，K215M突变体对AKT活化具有相反的作用。我们生成了携带K215M突变的基因小鼠模型，以阐明GCB型CARD11突变体的体内功能（图S7A）。 K215M突变在mRNA或蛋白质水平上都不会影响Card11基因的表达（图S7B）。 K215M突变小鼠确实表现出与E134G突变小鼠相反的表型。与WT对照相比，K215M突变小鼠的BM中有更多的pre-B细胞，但成熟的B细胞却较少（图S7C），脾脏明显增大（图S7D）。尽管在K215M突变小鼠脾脏中MZ B细胞的百分率与WT对照相当，但MZ B细胞数的绝对数是WT MZ B细胞的绝对数的两倍（图3A）。在K215M突变小鼠的PC中，B1 B细胞数（图3B），B1a和B1b细胞（图3C）也明显增加。过渡性B细胞分析表明，在K215M突变小鼠（图S7E）的发育过程中，T2期百分比略有降低，这也与E134G突变小鼠的T2期表型相反。我们通过将K215M突变型BM细胞与表达GFP的WT对照BM细胞混合，然后将它们重新引入到亚致死剂量照射的受体小鼠中，来使用BM嵌合体模型。与在WT和E134G突变体中观察到的表型相反，K215M突变体细胞显示出比WT细胞更高的发育特权。 K215M突变体MZ和B1 B细胞分别是嵌合体的脾脏（图3D）和PC（图3E）的主要种群。这些结果证实K215M突变体也以细胞内在的方式影响B细胞的发育。

图3 Card11 K215M突变体通过抑制AKT激活来加速B细胞发育。

（A）顶部：WT和K215M突变小鼠脾脏中B220 + CD93-成熟B细胞中MZ和FO B细胞比例的流式细胞仪分析。下图：计算小鼠脾脏中的MZ和FO B细胞绝对细胞数，并显示如下（n = 5）。 （B）WT和K215M突变小鼠的PC中CD19 + B220mild B1 B细胞和CD19 + B220high B2细胞的流式细胞术染色（上）。计算PC中B1和B2 B细胞的绝对细胞数，并显示如下（n = 5）。 （C）顶部：WT和K215M突变小鼠PC中的CD5 + CD43 + B1a和CD5-CD43 + B1b细胞也通过流式细胞仪进行了测量。下：计数B1a和B1b细胞的绝对细胞数（n = 5）。 （D）在WT（GFP +）和K215M（GFP-）突变型BM嵌合体中，通过流式细胞仪分析了WT和K215M突变型MZ和FO B细胞，MZ和FO B细胞的百分比如下所示（n = 5） 。 （E）通过流式细胞术分析了WT和K215M突变BM混合物嵌合体的PC中的B1和B2 B细胞，B1和B2 B细胞的百分比显示如下（n ＝ 5）。 （F）在不同时间点用抗IgM（20μg/ ml）刺激来自WT和K215M突变小鼠的脾静息B细胞，并通过Western blot检测AKT308，AKT473，FOXO1以及总AKT和FOXO1的磷酸化。将免疫印迹定量标准化为肌动蛋白，如下所示。 （G）通过流式细胞术分析了WT和K215M突变小鼠脾脏中MZ和FO B细胞中的AKT磷酸化（n ＝ 4）。 （H）通过流式细胞术分析WT和K215M突变小鼠脾脏中MZ和FO B细胞中的总FOXO1蛋白水平（n = 5）。 （I）WT和K215M突变小鼠脾B细胞中FOXO1靶基因表达的qRT-PCR分析。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001，配对t检验。所有数据均为平均值±SEM。

免疫印迹结果表明，K215M突变B细胞在BCR刺激后显示出升高的NF-κB活化（图S7F），并在T308和S473位点显着降低了AKT磷酸化（图3F）。 AKT的FOXO1磷酸化也降低了（图3F）。 WT和K215M突变小鼠的离体流式细胞仪分析表明，在K215M突变MZ和FO B细胞中，T308的AKT磷酸化均得到缓解（图3G），同时伴随着FOXO1蛋白水平的升高（图3H）。我们纯化了K215M突变B细胞，并以与E134G突变B细胞相同的方式通过RNA-seq应用了转录组比较分析。 K215M突变B细胞也富集了FoxO途径基因签名，但与E134G突变体（图S4A）相反，K215M突变细胞具有更多的FoxO途径基因表达上调（图S7G）。定量RT-PCR（qRT-PCR）结果证实，在K215M突变B细胞中，FOXO1调控的细胞周期相关基因Chek1，Ccnd1和Ccnd2以及Il-10和Prdm1的表达水平均升高（图3I）。在K215M突变B细胞中，IL-10（图S7H）和CCND2（图S7I）的蛋白质水平也升高。 K215M突变体不影响细胞活力（图S7J），但它通过促进B细胞进入S期而改变了细胞周期（图S7K）。在杂合子K215M突变小鼠中，与野生型对照和纯合子突变体相比，MZ B和B1 B细胞的发育也有所增强（图S8，A和B）。杂合子K215M突变B细胞显示出AKT和FOXO1磷酸化（图S8C）和FOXO1目标基因表达（图S8D）的中等变化。这些数据表明，与E134G突变体相比，K215M突变体具有相反的功能，并且对AKT激活具有增强的抑制作用，这导致比WT对照更具侵略性的B细胞发育表型。

E134G和K215M突变体对GC B细胞反应具有反向影响

GC是专门用于成熟B细胞进一步分化的特定组织学结构。 GC中的功能异常与多种B细胞相关疾病有关，尤其是B细胞恶性肿瘤（39）。最近的研究表明，PI3K / AKT / FOXO1信号转导轴在GC B细胞反应中起主要作用（40-42），但是在GC B细胞中这种高度动态的信号网络仍然难以捉摸。 CARD11在AKT1 / FOXO1信号轴上的非规范功能可能对GC B细胞反应至关重要。在缺少CARD11的情况下，B细胞无法完全激活，因为抗原刺激的B细胞中依赖CARD11的NF-κB激活被破坏（4-7）。 CARD11 E134G和K215M突变体为我们提供了有用的平台，以分析受CARD11非规范功能调节的GC反应。

用模型抗原绵羊红细胞（SRBC）免疫后，我们发现E134G小鼠脾脏中GC B细胞的百分比和绝对数量显着降低（图4A）。在E134G突变小鼠的肠系膜淋巴结（mLN）（图4B）和派伊尔斑块（PP）（图4C）中，观察到肠GC反应也有类似的降低。在免疫的K215M突变小鼠中，GC B细胞略有增加（图S9，A和C）。这些数据表明，其他淋巴谱系细胞也可能影响K215M突变小鼠的GC B细胞反应。混合BM嵌合体实验证实这种GC缺陷是B细胞固有的，并且我们发现与WT对照相比，与E134G起源相关的GC间隔严重缩小，而E134G FO B细胞间隔保持正常（图4D）。与E134G小鼠相反，与WT细胞相比，K215M突变GC B细胞在混合BM嵌合体中不堪重负（图4E）。与K215M小鼠中总B细胞数量增加相一致，我们观察到K215M混合BM嵌合体中的FO B细胞区室也略有增加，尽管不如GC B细胞区室明显。 E134G突变的GC B细胞比WT细胞保留更高水平的AKT磷酸化（图4F），而FOXO1蛋白的总水平较低（图4G）。与WT对照相比，K215M突变GC B细胞的AKT磷酸化减少（图4H），总FOXO1蛋白水平升高（图4I），并且K215M突变GC B细胞的FOXO1靶基因表达上调。 Ccnd1（图4J）。

图4 E134G和K215M突变体对GC B细胞反应具有反向影响。

（A至C）用SRBCs免疫WT和E134G小鼠，并在7天后通过流式细胞术分析脾脏（A），mLN（B）和PP（C）中的GC B细胞。数据代表三个实验。 （D）用SRBC免疫由约50％WT或E134G突变细胞加约50％CD45.1 + WT细胞产生的混合BM嵌合体，并通过流动分析CD45.2 + FO B细胞和GC B细胞的百分比细胞计数。数据来自两个实验。 （E）用SRBC免疫由约20％WT或K215M突变细胞加约80％CD45.1 + WT细胞产生的混合BM嵌合体，并通过流式细胞术分析CD45.2 + FO B细胞和GC B的百分比。数据来自两个实验。 （F）在分离期间，将来自SRBC免疫的小鼠的脾细胞固定并在GC B细胞中对p-AKT（308）进行细胞内染色。数据代表两个实验，并表示为平均值±SEM。 （G）流式细胞术分析来自SRBC免疫的小鼠的GC B细胞中的细胞内FOXO1。数据代表两个实验，并表示为平均值±SEM。 （H）来自免疫的K215M突变小鼠的mLN GC B细胞中p-AKT（308）的流式细胞术分析。数据代表两个实验，并表示为平均值±SEM。 （I）来自K215M突变小鼠的mLN GC B细胞中细胞内FOXO1的流式细胞仪分析。数据代表两个实验，并表示为平均值±SEM。 （J）qRT-PCR分析来自免疫小鼠mLN的分选的WT和K215M GC B细胞FOXO1靶基因的mRNA表达。数据代表两个实验，并表示为平均值±SEM。 （K和L）通过流式细胞术分析了WT和E134G突变小鼠（K）以及WT和K215M突变小鼠（L）的BM中的浆细胞分化。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001，配对t检验。所有数据均为平均值±SEM。

分为两个功能不同的部分：暗区（DZ）和亮区（LZ）。 DZ B细胞的FOXO1水平升高且高度增殖（41、42）。与E134G突变B细胞中FOXO1的下调一致，我们发现与WT对照相比，E134G突变GC中DZ区室减少，伴随着LZ B细胞的增加（图S9D）。免疫的小鼠注射DNA类似物EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷），以监测细胞增殖速率。我们发现E134G突变体GC B细胞的增殖率降低（图S9E），但K215M突变体产生了更多的EdU阳性GC B细胞（图S9F），证实了加速的GC B细胞增殖。 E134G和K215M突变体均未显示基于细胞内裂解的半胱天冬酶3的GC B细胞活力的变化（图S9，G和H）。细胞周期分析表明，与野生型对照（图S9I）相比，E134G突变型GC B细胞在S期的细胞更少（相反，K215M突变促进了GC B细胞进入S期并增殖）（图S9J）。

GC反应后，B细胞最终分化为分泌抗体的浆细胞。根据下调的Prdm1表达，SRBC免疫的E134G突变小鼠在BM中显示出明显较少的浆细胞分化（图4K）。但是，K215M突变小鼠的浆细胞分化显着增加（图4L）。这些数据表明，CARD11 E134G和K215M突变体对GC B细胞分化和浆细胞末端分化具有相反的影响。

讨论

在多种B细胞相关的免疫性疾病中经常报告CARD11的致病突变（15、17、43）。为了阐明体内独特的致病性CARD11突变体的生理功能，我们建立了三种CARD11突变小鼠模型：Card11 KO小鼠模型和具有E134G点突变或K215M点突变的CARD11模型。系统比较表明，CARD11具有非规范的功能作为AKT激活的负调节剂，这对于B细胞发育和B细胞分化是必不可少的。尽管E134G和K215M都是NF-κB途径的GOF突变体，但E134G和K215M突变体对AKT / FOXO1信号轴的调节作用却不同。与BENTA疾病相关的E134G突变与AKT通路的过度激活以及缺陷的B细胞发育和分化相关，而致癌性K215M突变导致AKT激活减弱和B细胞表型相反。 E134G或K215M一个等位基因突变的杂合子小鼠倾向于B细胞发育异常，纯合子突变引起更明显的表型变化。

先前的研究表明，PI3K对于MZ B细胞发育必不可少（44），并且具有PI3K组成型激活的小鼠的MZ B细胞数量增加，如Foxo1缺陷小鼠所见（45）。但是，在不同B细胞发育阶段的Foxo1基因缺失会导致独特的MZ B细胞表型，从而在pro-B细胞阶段Cd19-Cre早期删除Foxo1会导致MZ B细胞数量增加（46），而Cd21-Cre –在过渡B细胞阶段介导的Foxo1缺乏会减少MZ和B1 B细胞（31）。在缺乏BCR的小鼠模型中，在过渡B细胞阶段组成性激活的PI3K（p110α* CA）可以恢复MZ B细胞发育，但是在过渡B细胞阶段删除Foxo1无法使MZ B细胞群体恢复正常范围（47）。这些结果表明，过渡性B细胞阶段涉及PI3K-FOXO1轴上的特定调控机制，以维持正常的MZ B细胞发育，该过程位于PI3K下游但FOXO1上游。我们测量了不同B细胞发育阶段的Card11表达水平，发现Card11表达在BM的前B细胞阶段保持较低水平，但在过渡B细胞阶段则显着增加（图S10）。这表明从B细胞发育的特定时间点开始，CARD11精确控制AKT活化和FOXO1活性。 AKT的另一个关键下游靶标是mTORC1，它对B细胞的发育和分化也至关重要。但是，在CARD11突变B细胞中，我们没有观察到mTORC1活性的变化。其他调节途径，如细胞外信号调节激酶和AMP（腺苷5'-单磷酸腺苷）活化的蛋白激酶或氨基酸营养物质，可能控制或促成mTORC1活化。

我们的数据不仅阐明了导致BENTA疾病的机制，还解释了B细胞恶性肿瘤的发生（39）。在ABC型DLBCL中，恶性B细胞起源于活化的B细胞，被禁止终末分化为浆细胞（35）。在大多数ABC-DLBCL病例中都发现了抑癌基因PRDM1的缺失，因为它在浆细胞分化中起着不可或缺的作用。由于PRDM1的下调，来自BENTA病患者的B细胞无法分化为浆细胞（48），这在我们的小鼠模型中也得到了证实。此外，在患有BENTA病的患者和患有ABC-DLBCL细胞的患者中均发现了CARD11 G123S突变。因此，与ABC型DLBCL和BENTA相关的CARD11突变可能具有相似的发病机理。 GCB型DLBCL细胞大多类似于GCB，与ABC-DLBCL细胞相比具有不同的分子特征。另一个众所周知的GCB型CARD11致癌突变是L232LI，它诱导了最强的NF-κB活化水平（15），并在小鼠模型中引起B细胞恶性肿瘤和出生后早期致死率（49）。 L232LI突变体还抑制了抗原受体刺激的B细胞中的AKT活化（49），与K215M突变体相似。具有K215M突变的患者样品还伴有另一个致癌突变F130I（15）。尽管K215M突变体轻度上调NF-κB活性，但同时发生的F103I突变或F130I / K215M双重突变可以强烈诱导NF-κB。这些数据表明，与NF-κB一起，下调的AKT活性和随后的FOXO1途径的增强可能对GCB-DLBCL的发病机理至关重要。最近，有报道说FOXO1促进了GC中B细胞淋巴瘤的形成（50），这与我们的发现一致，即与GCB-DLBCL相关的K215M突变体通过升高的FOXO1活性引起GC B细胞恶性增殖和分化。总之，CARD11的非规范调节功能可能决定了恶性B细胞转化为DLBCL的类型。失调的AKT-FOXO1信号轴也可以用作新标准，以更好地分类来自多种免疫性疾病的致病性CARD11突变体，从而有助于改善诊断和精确药物开发。