Helios增强了人类胎儿CD4 +幼稚T细胞向调节性T细胞的优先分化

Helios增强了人类胎儿CD4 +幼稚T细胞向调节性T细胞的优先分化

Helios点亮了免疫耐受的道路

在通过T细胞受体刺激后，胎儿幼稚T细胞比成年T细胞更易于分化为调节性T（Treg）细胞。 Ng等。 使用转录和表观遗传学分析研究了这种偏倚的起源，以比较胎儿和成年幼稚T细胞与诱导Treg细胞。 大多数胎儿幼稚T细胞表达Treg相关转录因子Helios，而成年幼稚T细胞则没有，这表明Helios可能起关键作用。 CRISPR-Cas9介导的幼稚T细胞中Helios的缺失削弱了它们在缺乏外源性TGF-β的情况下分化为诱导性Treg细胞的能力。 这些发现为开发新的转化方法以哄骗成年幼稚T细胞分化为稳定的Treg细胞奠定了基础。

摘要

T细胞受体（TCR）刺激和细胞因子提示驱动CD4 +幼稚T细胞分化为具有独特促炎或调节功能的效应T细胞群体。与成年幼稚T细胞不同，人类胎儿幼稚CD4 + T细胞在TCR激活后优先于外源细胞因子信号传导而分化为FOXP3 +调节性T（Treg）细胞。 Treg分化的这种细胞内在诱因与子宫内耐受的产生有关。但是，其基本机制仍然未知。在这里，我们确定了在幼稚T细胞和成年Treg细胞之间共享的表观遗传学和转录程序，这些成年Treg细胞在成年幼稚T细胞中没有活性，并表明胎儿衍生的诱导Treg（iTreg）细胞保留了该转录程序。我们显示，Treg特异性增强子的一个子集可在胎儿幼稚T细胞中获得，包括Helios的两个活跃的超级增强子。 Helios在胎儿幼稚T细胞中表达，但在成年幼稚T细胞中不表达，胎儿iTreg细胞维持Helios表达。胎儿幼稚T细胞中Helios的CRISPR-Cas9消融破坏了TCR刺激后它们分化为iTreg细胞的能力，降低了胎儿iTreg细胞中免疫抑制基因的表达，例如IL10，并增加了包括IFNG在内的促炎基因的表达。因此，Helios基因敲除的胎儿iTreg细胞具有降低的IL-10和增加的IFN-γ细胞因子产生。在一起，我们的结果表明Helios在增强优先胎儿Treg分化和微调最终Treg功能方面的重要作用。胎儿幼稚T细胞中鉴定的Treg偏倚程序可能会被用于工程化增强的iTreg人群以进行过继细胞治疗。

介绍

适应性免疫系统必须产生免疫耐受性，以预防或解决可能引起宿主损害的促炎反应（1-3），同时仍允许功能效应子反应对宿主防御病原体（4、5）。实现这种灵活性的主要机制是CD4 +幼稚T细胞分化为具有促炎或免疫抑制功能的多个专门T辅助（TH）亚型的能力。极化细胞因子在其直接环境中的存在通过触发制定谱系特异性转录程序的主转录因子的表达和/或激活，决定了最终的TH细胞命运（6）。例如，通过转化生长因子-β（TGF-β）进行的信号传递促进了叉头盒P3（FOXP3）的诱导（7-9），这是将幼稚T细胞分化为免疫抑制性调节性T所需的主要转录因子（ Treg）细胞。

FOXP3基因突变导致Treg细胞缺失或功能异常，导致Treg介导的免疫耐受性丧失，并在小鼠和人类中引发致命的，早发的多器官自身免疫（10-15）。由人体内FOXP3 + Treg细胞介导的耐受性丧失引起的自身免疫可定义为IPEX（免疫失调，多内分泌病，肠病，X连锁）综合征，可在胎儿体内出现子宫内并导致流产，早产或死亡。在没有造血干细胞移植的儿童中（16-20）。 IPEX自身免疫的开始与人类发育中期的T细胞出现相吻合，这表明胎儿发育过程中需要Treg细胞介导的外周耐受（21、22）。次要淋巴组织中存在大量胎儿Treg细胞，这与成人相比，占CD4 + T细胞总数的较大百分比（23–25），这证明了这一点。但是，我们以前没有观察到胎儿和婴儿胸腺中胸腺Treg细胞频率的差异（24），这表明胸腺输出量增加与胎儿Treg细胞频率增加无关。胎儿初生T细胞与成年后的T细胞不同，在抗原刺激后优先分化为功能性Treg细胞，其中包括母体抗原呈递细胞上未遗传的母体同种异体抗原（即NIMAs）（24）。这些发现暗示在胎儿淋巴组织中观察到的大量胎儿Treg细胞是由于幼稚T细胞的外周转化所致。这种Treg分化的倾向在体外得以保留，因为即使在没有外源TGF-β的情况下，T细胞受体（TCR）活化后，高频率的胎儿T细胞也可以分化为FOXP3 + Treg细胞。在没有外源性TGF-β的情况下，胎儿幼稚T细胞启动Treg分化的独特能力表明该能力是细胞内在的。然而，这种诱因的分子机制在很大程度上尚不清楚。

染色质的变化也牵涉到驱动分化的T细胞的最终效应子表型和功能，这由活性谱系特异性基因的染色质可及性增加以及与其他效应谱系相关的基因沉默所决定（27、28）。在胸腺和外周血Treg细胞中，与Treg相关的基因（例如IL2RA（即CD25），CTLA4，IKZF2（即Helios）和IKZF4（即Eos））的许可/活性组蛋白标记和DNA脱甲基化（29，30）必须获得对Treg表型的承诺和维持（29–32）。该Treg-染色质景观是在FOXP3蛋白表达之前在发育中的胸腺Treg前体中获得的（30），表明Treg特异性表观基因组可能负责启动和促进FOXP3的表达。此外，与Treg表观基因组相关的其他关键基因（例如Helios）的表达独立于FOXP3表达（29、30、33），当在FOXP3-CD4 + T细胞中过表达时，可以指导部分获得Treg特异性转录标记（34）。因此，我们假设胎儿幼稚T细胞可能已经具有部分Treg特异的表观遗传学和转录特征，即使没有外源性TGF-β信号传导，它们也容易向Treg细胞命运分化。

在这里，我们询问了胎儿和成年幼稚和Treg细胞的转录和染色质景观，发现Treg基因调控程序的组件仅在胎儿幼稚T细胞中被激活。然后，我们表明在胎儿幼稚T细胞中稳定状态下检测到的部分Treg特异性基因标记仅保留在胎儿来源的诱导Treg（iTreg）细胞中。接下来，我们鉴定了两个与Helios基因座相关的Treg特异超增强剂（SEs），它们在胎儿幼稚T细胞中活跃，随后我们在其中证实了Helios蛋白的表达。在体外，仅从胎儿幼稚T细胞产生的iTreg细胞保留Helios表达，并以抑制白介素2（IL-2）产生为特征。在成年iTreg细胞中均未观察到。 CRISPR（聚簇的规则间隔的短回文重复序列）–Cas9（CRISPR相关蛋白9）介导的胎儿T细胞中Helios的消融损害了它们在没有外源TGF-β的情况下其细胞内在分化为iTreg细胞的能力。对Helios敲除的iTreg细胞中的转录组的分析显示，Helios增强了Treg特异性基因（例如IL10）的上调并介导了涉及T效应子分化和功能的促炎基因的抑制（例如IFNG）。胎儿iTreg细胞中的Helios消融导致IL-10产生减少，同时干扰素-γ（IFN-γ）和IL-2增加。鉴于Helios先前已被表征为胸腺Treg细胞特异的基因，我们的数据揭示了Helios作为人类胎儿幼稚T细胞中预先存在的表观遗传和转录程序的一部分的先前未知的作用，从而降低了Treg分化和功能的阈值承诺。因此，我们一起确定了胎儿幼稚T细胞特有的TGF-β独立机制，该机制有利于它们分化为Treg细胞，这可能有助于从幼稚T细胞体外更好地工程改造Treg细胞用于免疫治疗。

结果

人类胎儿幼稚T细胞表达部分Treg转录组

考虑到仅在TCR刺激下胎儿幼稚T细胞就优先分化为Treg细胞（26），我们首先询问胎儿幼稚T细胞是否与Treg细胞共享其转录组元件，从而使它们倾向于Treg谱系。我们对分选的胎儿和成年CD4 +幼稚和Treg细胞进行了RNA测序（RNA-seq）（分类门控策略和纯度确认见图S1）。主成分分析（PCA）显示，胎儿和成年人口首先在细胞表型（PC2，纯朴与Treg；图1A）之前按细胞起源（PC1，胎儿或成年）分离。胎儿幼稚样本的PC2评分介于成年幼稚样本和Treg样本之间（图1A），表明Treg特异性基因在胎儿幼稚T细胞中的中间表达。为了验证这一假设，我们首先通过基于错误发现率（FDR）阈值<0.05和log2倍数变化来鉴定相对于成年幼稚T细胞在胎儿和成年Treg细胞中差异表达的基因，从而定义了Treg特异性的转录特征（ log2FC）的表达式增加了1.5（图S2和表S1）。胎儿幼稚T细胞在我们的Treg特异性转录特征中跨上调/下调的基因具有中间上调/下调（图1B）。更具体地说，相对于成年幼稚T细胞，胎儿幼稚T细胞具有88个Treg上调和42个Treg下调的基因（图1C）。我们在Treg特异性转录组中定义了四个不同的簇（图1B和表S1），其中两个对应于所有Treg上调的基因（簇1.1和1.2），而另外两个簇包含所有Treg下调的簇。调控基因（第1.3和1.4节）。在Treg上调的基因中，胎儿幼稚T细胞不表达经典的Treg基因，例如FOXP3，IL2RA和CTLA4（集群1.1；图1B）。取而代之的是，胎儿幼稚T细胞的Treg上调基因先前与Treg功能相关的表达增加，例如CCR4（35，36）和KLF10（37-39）。此外，胎儿幼稚T细胞的转录因子IKZF2（Helios）（40-42）和IKZF4（Eos）（34，43）（簇1.2；图1，B和C）的表达增加。 FOXP3在小鼠中的表达（29、33、44）。胎儿初生T细胞和两个Treg细胞群体都具有类似的下调基因子集的功能，这些基因以前被表征为在Treg细胞中被下调，例如TSHZ2和SERPINB6（45-47）（图1.3；图1B）。相反，在胎儿和成年幼稚T细胞之间共享的基因包括有助于幼稚T细胞表型的已知基因，例如TCF7和IL7R（图1.4；图1B）。总之，在胎儿初生T细胞中存在部分Treg特异性标记可以在收到TCR信号后增强Treg分化，这与这些细胞降低阈值和倾向于Treg分化的倾向相一致（24、26）。

图1胎儿幼稚T细胞表达了一部分Treg转录组。

（A）比较成人幼稚（AN），胎儿幼稚（FN），成人Treg（AT）和胎儿Treg（FT）细胞的RNA-seq数据的PCA图。箱线图显示PC1（底部）和PC2（右侧）的得分。 （B）热图显示了成年幼稚，胎儿幼稚，成年Treg和胎儿Treg细胞中Treg特异性差异表达基因的相对表达水平。聚类通过k均值聚类进行标记和定义。标记与Treg和幼稚T细胞功能相关的基因。箱线图（左）显示了所有上调（顶部；簇1和2）和下调（底部；簇3和4）基因的M值（TMM）标准化读数的平均修剪平均值。 Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验，采用Bonferroni校正进行多重检验，*** P <0.001； n.s.，P> 0.05（每组n = 4个生物学重复）。 （C）胎儿和成年幼稚T细胞中差异表达（log2FC，> 1.5; Padj <0.05）基因的火山图，所有差异表达基因均为浅灰色。虚线（灰色）表示FC截止。在胎儿幼稚T细胞中，分别有88个和42个Treg特异性基因被上调（橙色）和被下调（蓝色）。在Treg上调的基因中，以前与Treg功能相关的基因被标记。在Treg下调的基因中，具有最低Padj值的前五个基因被标记。此图中的所有箱线图均显示中位数（中线），四分位数范围（框）以及第10和第90个百分位数（晶须）。

胎儿来源的iTreg细胞维持幼稚T细胞中存在的部分Treg特异性转录组的差异表达

接下来，我们问在胎儿幼稚T细胞中检测到的部分Treg特异性转录组是否会在胎儿iTreg细胞中保持差异表达，以及成年iTreg细胞在体外分化后是否也获得了Treg特异性转录组。为了评估这一点，我们在单独添加了IL-2（IL-2–iTreg）或另外添加了TGF-β（TGF-β–iTreg）的培养基中，对经过TCR刺激分化的胎儿和成年iTreg细胞进行了RNA-seq分析。 。 PCA揭示PC1仍按细胞起源（胎儿或成年）隔离iTreg种群，此后通过分化过程中受到的刺激进行隔离（TGF-β，PC2的存在/不存在；图2A）。这表明胎儿来源的iTreg细胞在转录上仍与成人来源的iTreg细胞不同，尽管添加TGF-β足以驱动一组共享基因的差异表达。然后，我们评估了所有iTreg群体（图2B）中所有差异表达的基因（FDR <0.05； log2FC> 1.5），并定义了六个簇（表S2）。胎儿和成年TGF-β–iTreg细胞均上调两个基因簇（簇2.1和2.2；图2B和图S3A），而下调一个基因簇（簇2.6；图2B和图S3A）。簇2.1和2.2中的Treg特异性基因包括已知被TGF-β信号上调的基因，例如FOXP3和IKZF4（48），以及可能与Treg分化和功能有关的基因，例如SEMA4A（49），LTBP1， LTBP4（50）和LGALS3（51，52）。但是，只有胎儿IL-2–和TGF-β–iTreg细胞的Treg特异性基因的表达增加，这些基因在离体胎儿幼稚T细胞（图1C）中被上调，例如IKZF2，DUSP4，TOX和RGS1。 （群集2.3；图2B和图S3A）。促炎性转录物如IFNG，IL2，GZMB和IRF7的转录减少（图2.5;图2B和图S3A），涉及Treg细胞抑制功能的基因如IL10的表达增加（图2.3B;图2B）。仅在胎儿而非成人iTreg细胞中观察到。这表明，定性地，相对于成年iTreg细胞，胎儿iTreg细胞的转录组可能更能反映离体Treg群体。因此，我们使用基因集富集分析（GSEA）来针对发表的基因集独立评估胎儿或成人来源的iTreg细胞的转录组，比较了Treg和常规T细胞群体（在体外也经历了TCR和细胞因子刺激的激活）（图。 S3B和表S3）。与成年iTreg细胞相比，在两种刺激条件下分化的胎儿iTreg细胞均富集了激活的Treg群体中上调的基因（图2B），并且富集了部分Treg特异性标记（如聚类1.2和1.3所定义）（图5和图6）。图1B和2C（左）和图S3C）。 Treg分化过程中的外源性TGF-β信号传导导致胎儿TGF-β–iTreg细胞中簇1.1基因的富集和1.4基因的耗竭，而成年TGF-β–iTreg细胞中则无（图2C，右和图S3D）。因此，我们的数据表明，独立于外源性TGF-β的胎儿幼稚T细胞的分化保留了在离体幼稚T细胞中检测到的部分Treg特异性转录信号的增加表达。此外，这些基因的表达在成年iTreg细胞中没有达到相同的水平，这表明上游机制可能负责驱动有利于胎龄T细胞中Treg分化的转录差异。

图2胎儿iTreg细胞保持稳定状态下在胎儿初生T细胞中检测到的部分Treg特异性转录组的表达。

（A）比较单独在IL-2（IL-2–iTreg）或添加外源TGF-β（TGF-β–iTreg）时产生的胎儿和成年iTreg细胞的RNA-seq数据的PCA。箱线图显示PC1（底部）和PC2（右侧）的得分。 （B）热图显示了成年和胎儿IL-2–iTreg和TGF-β–iTreg中差异表达基因的相对表达水平（log2FC> 1.5； FDR <0.05）。聚类通过k均值聚类进行标记和定义。标记与Treg或促炎性/效应性T细胞功能相关的基因。 （C）使用预先分级的GSEA评估胎儿（橙色）或成年（蓝色）IL-2–iTreg细胞（左侧）或成人（蓝色）中预定义的激活的Treg相关基因集（所有基因集的详细信息，请参见图S3B）。 TGF-β–iTreg细胞（右）。在所有条件下n = 4。条形图显示了FDR <0.05的基因集的标准化富集得分（ES），箭头表示成年或胎儿iTreg细胞的富集方向。 （D）使用预先分级的GSEA评估图1B中鉴定的每个基因簇的过度表达。条形图显示了对于胎儿（橙色）或成年（蓝色）IL-2–iTreg细胞（左）或TGF-β–iTreg细胞（右）FDR <0.05的所有簇的归一化富集得分。

胎儿iTreg细胞对TGF-β信号传导的敏感性增加

胎儿IL-2–iTreg细胞除了增加与Treg功能相关的基因的表达外，还强烈上调了一个基因簇，该簇含有与TGF-β螯合和下游信号传导相关的关键基因，包括SMAD1，TGFBR3，LRRC32（53，54 ）和LIN28B（26）（群集2.4；图2B和图S4A）。胎儿初生T细胞中Lin28b蛋白的表达有助于TGFBR1，TGFBR3和SMAD2的表达增加，以及SMAD2 / 3的磷酸化增加（26）。糖蛋白A重复优势（GARP）（LRRC32）在活化的Treg细胞的细胞表面高度表达，并捕获与潜伏期相关肽（LAP）结合的非活性TGF-β（53，55）。这种与细胞表面相关的TGF-β的储存库与维持小鼠的口腔耐受（54）以及与GARP + Treg细胞共培养的初次T细胞中FOXP3的诱导有关（53）。在这里，我们证明胎儿而不是成年的iTreg细胞以线性方式高表达GARP（图S4B）和LAP（图S4C）。此外，胎儿iTreg细胞的ITGB8（簇3；图2B）的转录增加，这是整联蛋白αvβ8的β链，可从LAP处理并释放生物活性TGF-β1（54）。因为胎儿iTreg细胞具有增加的细胞表面相关TGF-β和介导其潜在释放的机制，所以我们测试了用TGF-β中和抗体阻断TGF-β1是否导致仅响应TCR刺激的胎儿Treg分化减少。如所假设的，在TGF-β阻滞的情况下胎儿Treg的诱导减弱（图S4，D和E）。然而，即使添加了外源生物活性TGF-β，胎儿幼稚T细胞仍比成年幼稚T细胞具有更高的Treg分化能力（图S4，D和E）。因此，尽管在缺乏外源性TGF-β的情况下，活跃的TGF-β1生物合成可能有助于胎儿iTreg的分化，但其他上游机制在体外驱动了胎儿Treg的增强分化。

胎儿幼稚T细胞与成年Treg细胞共享部分表观遗传景观

鉴于胎儿初生T细胞已经表达了部分Treg特异性信号，我们接下来评估了我们是否还能在胎儿初生T细胞中检测到允许的表观遗传标记，从而进一步推动了Treg细胞分化的能力。为了鉴定这些染色质特征，我们使用了转座酶可接近染色质的检测方法，然后对组蛋白3（H3K27ac）染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）的Lys27进行了测序（ATAC-seq）和乙酰化，以比较成人中开放和活性染色质的区域Treg细胞相对于胎儿和成年幼稚T细胞。 SEs和典型的转录增强子（TEs）使用超级增强子（ROSE）算法的等级排序（56，57）进行分类，并且PCA在所有样品中鉴定的增强子上进行。在ATAC-seq（图3A）和H3K27ac ChIP-seq（图3B）中，细胞起源（胎儿与成年）是主要的变异来源（PC1），并且与细胞表型（幼稚或Treg）一起被广泛考虑所有三个人群中表观基因组的差异。但是，在两个数据集中，第二个方差来源（PC2）的幼稚Treg细胞样本和成年Treg细胞样本聚集在一起（图3，A和B）。这表明，除了表达部分Treg特异性转录组外，胎儿幼稚T细胞与成年Treg细胞共享一小部分开放的和活性的Treg特异性增强子。

图3胎儿幼稚T细胞在与Helios相关的两个Treg可及的SE处增加了ATAC和H3K27ac富集。

（A和B）使用映射的（A）ATAC或（B）H3K27ac读数在所有SE和TE上执行PCA。箱线图显示PC1（底部）和PC2（右侧）的得分。 （C）条形图显示相对于成年幼稚T细胞，胎儿幼稚T细胞中ATAC和H3K27ac信号增加（橙色）或减少（蓝色）的Treg可访问/不可访问的增强子的数量（补充材料和补充资料中定义的Treg可访问/不可访问的增强子方法）。 （D）图显示了在12.5 kb范围内针对增强子等级的缝合增强子处的累积H3K27ac信号，并且SEs在绘制曲线的切线为1的地方定义。虚线（灰色）显示了成人Treg的一个代表性样品的SEs截止值（ n = 3）。定义为可访问Treg且满足FC> 1.5和FDR <0.05临界值的SE标记为红色，并标记了与关键Treg基因相关的SE。 （E）与（D）相同的图显示了一个胎儿T样本（左）和成人T样本（右）的代表性样本（n = 3）。评估（D）中鉴定的Treg可及的SEs相对于成年幼稚T细胞的幼稚胎儿差异富集，反之亦然。 FC> 1.5和FDR <0.05的每个样品中差异富集的Treg SE均被红色标记。 （D）中与关键Treg基因相关的TEs也被标记。 （F和G）在胎儿幼稚的所有缝合增强子区域针对成年幼稚T细胞的标准化（F）ATAC-seq读数和（G）H3K27ac读数的散点图。 FC> 1.5和FDR <0.05的差异富集的SE和TE显示为浅灰色，其中Treg可访问的SE（橙色）和Treg无法访问的SE（蓝色）。与转录因子相关的Treg可及的SE被标记； Helios（IKZF2）用粗体标记。

为了解决这种可能性，我们首先独立定义了相对于成年幼稚T细胞而言，成年Treg细胞中的ATAC（图S5A）或H3K27ac（图S5B）信号差异富集的增强子（FDR <0.05；表达FC> 1.5）。在成年Treg细胞中分类为H3K27ac和ATAC信号均增加的差异富集增强子称为Treg可及增强子（图S5C和表S4），而普通增强子定义为两种信号的富集没有差异（图S5C）。 。类似地定义了具有降低的信号的Treg不可接近的增强子（表S5）。然后，我们评估了相对于成年幼稚T细胞，任何Treg可及的增强子是否在胎儿幼稚T细胞中富集。我们发现，胎儿幼稚T细胞在Treg可及的增强子上分别增加了38.8％（2405的933）和4.6％（2405的110）的ATAC和H3K27ac信号（图3C和图S5，D和E）。这些Treg可及的增强子（表S4）被注释为先前描述为Treg特异性表观基因组一部分的基因，例如IKZF2（即Helios），IKZF4（即Eos）和RXRA（即视黄酸受体RXR- α）（29，30，32）。同样，在未受Treg刺激的胎儿T细胞中，分别有23.1％（1837年的426个）和14％（1837年的258个）的ATAC和H3K27ac信号也降低了（图3C和图S5，D和E）。 。总之，这些数据表明，通过在部分Treg可及的增强子中有三分之一以上获得了染色质可及性增强的特征，部分处于稳定状态的胎儿T细胞已准备好进行Treg分化。考虑到染色质可及性可能在H3K27ac沉积之前（58），胎儿T细胞内Treg表观遗传学标记的获取可能以逐步的方式发生，其中通过触发Treg细胞分化获得通过H3K27乙酰化的完全增强子激活。

根据这一假设，我们评估了在幼稚和定型成年Treg细胞（以与TEs / SEs相似的方式定义）之间共享的所有Treg可接近的峰内的转录因子基序富集。高峰调用用于最大程度地减少由SE地区的广度引起的误报。胎儿初生T细胞的Treg可及H3K27ac峰富集程度最小，但在所有Treg可及ATAC峰的三分之一处，染色质可及性增加（图S6A）。这些共享的Treg可接近峰在激活剂蛋白1（AP-1）（图S6B）和Runt相关转录因子1（RUNX1）（图S6C和表S6）的结合基序中富集，它们位于TCR的下游作为FOXP3基因座的转录调节子和FOXP3的辅因子，它们发挥了重要的信号传导作用（59）。我们还检测到了较小的峰子集，这些子集具有丰富的信号转导和转录激活因子5（STAT5）（图S6D）和SMAD2 / 3（图S6E）的结合基序。因此，增加的染色质可及性可能与胎儿Treg分化过程中具有IL-2和TGF-β信号转导的STAT5和SMAD2 / 3结合位点潜在基因的增强子激活和更快的转录协同作用。最后，我们检查了胎儿纯正T细胞中差异富集的Treg可及峰，以了解先前在人Treg细胞中鉴定的FOXP3结合位点的存在（60）。我们显示，只有5％（2213中的116）具有增加的ATAC-seq信号的共享Treg可访问峰具有FOXP3结合位点（图S6F）。在一起，我们进一步说明，胎儿纯正T细胞内染色质可及性的提高在很大程度上有望与TCR和细胞因子信号提示信号协同作用，并且在较小程度上直接结合FOXP3以驱动其优先分化为Treg细胞。

这项研究的目的是确定人类胎儿T细胞优先Treg细胞分化的分子机制。因此，来自胎儿脾脏和成年外周血单个核细胞（PBMC）的原代人CD4 +幼稚T和Treg细胞是用于本研究的主要细胞来源。使用RNA序列，H3K27ac ChIP序列和ATAC序列进行转录和表观遗传分析。流式细胞仪用于确认测序数据集的观察结果，以验证基线表达水平，并评估体外胎儿和成年幼稚T细胞的活化和随后的分化。 CRISPR-Cas9介导的敲除用于证实观察研究的结果。鉴于从每个胎儿样本中分离出的细胞稀缺，测序数据集的样本大小（每个实验n = 2至6）被确定为统计分析的最佳大小，并允许独立复制。随后在所有附图说明或补充表中指出了用于体外实验的样品大小和实验重复。根据组之间可测量差异的大小和一致性确定样本量足够。研究人员没有盲目，并且样品在治疗之间均等地分配，即接受的gRNA。有关数据集分析和实验技术的更多详细信息，请参见《补充材料和方法》。

磁性分离CD4 + T细胞和荧光激活的细胞分选，用于测序和细胞培养

在进行荧光激活细胞分选（FACS）之前，使用EasySep人CD4 + T细胞分离试剂盒（＃17952，STEMCELL Technologies）将胎儿脾细胞和成年PBMC预富集CD4 + T细胞。为了获得足够数量的成年Treg细胞用于表观遗传分析，还使用人CD4 + CD127lo T细胞预富集试剂盒（＃19231，STEMCELL Technologies）对成年PBMC进行了CD4 + CD127lo T细胞的预富集。富集的细胞级分在FACS染色缓冲液[含2％热灭活胎牛血清（HI-FBS）和2 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）中]和荧光染料偶联的抗人表面单克隆抗体（mAbs）中孵育： CD25异硫氰酸荧光素（2A3，BD Biosciences），CD127藻红蛋白（PE）/ BV421（hIL-7R-M21，BD Biosciences），CD45RA PE-CF594（HI100，BD Horizon），CD4 PE-Cy7（SK3，BD Biosciences），和CD27 eFluor780（O323，赛默飞世尔科技）。用活/死标记物（Ghost Dye Violet 510，Tonbo Biosciences）将所有细胞染色以排除死细胞。根据图中的门控，将细胞分为补充的RPMI-1640 [10％HI-FBS，L-谷氨酰胺（300 mg /升），青霉素（10 U / ml）和链霉素（10μg/ ml）]。 S1。所有种类均在BD FACSAria III上进行。

用于离体分选细胞的RNA-seq

RNA测序用于2.5×105细胞，用于成年和胎儿幼稚和Treg细胞的四个生物学复制。用NucleoSpin RNA试剂盒（MACHERY-NAGEL）提取和纯化RNA，并通过RNA Pico（Agilent Technologies）评估质量。 HiSeq 3000上的文库制备和测序由位于加利福尼亚大学洛杉矶分校的基因组和生物信息学技术中心（TCGB）核心进行。

成人和胎儿iTreg人群的RNA序列

在200μl培养基[RPMI 1640中添加5μlImmunoCult人T细胞激活剂（CD3 / CD28 / CD2四聚体，STEMCELL Technologies）在U底96孔中刺激分选的成年或胎儿初生T细胞的四个生物学重复。 10％HI-FBS，L-谷氨酰胺（300 mg /升），青霉素（10 U / ml），链霉素（10μg/ ml），10 mM Hepes，1倍最低必需中非必需氨基酸和β-巯基乙醇]。根据相关实验设置，添加外源性IL-2（10 ng / ml； PeproTech）和TGF-β（50 ng / ml； PeproTech）。从刺激的第一天开始，每2天进行100微升培养基更换。诱导后第6天，用NucleoSpin XS RNA试剂盒（MACHERY-NAGEL）提取和纯化来自2.5×104 iTreg细胞的RNA，并通过RNA Pico（Agilent Technologies）评估其质量。使用NEBNext Poly（A）mRNA磁分离模块（New England Biolabs）除去核糖体RNA，并使用用于Illumina的NEBNext Ultra™II定向RNA文库制备试剂盒（New England Biolabs）进行文库制备。 HiSeq 4000上的测序是由位于加利福尼亚大学旧金山分校的先进技术中心（UCSF）进行的。

流式细胞仪染色的幼稚和Treg细胞

将来自胎儿和成人样品的初次分离的幼稚细胞和Treg细胞在FACS缓冲液中与偶联有荧光的抗人表面单克隆抗体一起孵育。使用Foxp3 /转录因子染色缓冲液组（Tonbo Biosciences）进行固定和通透。用活/死标记物（GhostDye Violet 510，Tonbo Biosciences）对所有细胞染色以从分析中排除死细胞。所有数据均使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）获取，并使用FlowJo（BD Biosciences）软件进行分析。 Helios +和Helios-门是根据成人Treg样本中明显的阳性和阴性种群设置的；观察到所有成年幼稚T细胞样本都完全在Helios-种群内，随后被用于定义Helios-门，用于随后的实验作为生物学阴性对照。

Treg诱导测定

如上所述，根据相关实验设置，将分选的成年或胎儿幼稚T细胞分化成Treg细胞。为了通过TGF-β阻断诱导Treg，在指定的培养基中添加中和性抗TGF-β（2.5或0.5μg/ ml； 1D11，R＆D Systems）抗体。培养1、3、5天后收集细胞用于流式细胞仪分析。从刺激的第一天开始，每2天进行一次培养基更换（100μl）。如流式细胞术染色中所述，对细胞进行染色，固定和透化。所有数据均使用LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）获取，并使用FlowJo（BD Biosciences）软件进行分析。