经许可的流感病毒疫苗针对的是血凝素(HA)糖蛋白的头部结构域，该糖蛋白经历了持续的抗原漂移。高度保守的HA秸秆结构域是提高通用流感病毒疫苗免疫范围的一个有吸引力的靶点。我们检验了大流行性流感病毒疫苗免疫增强现有抗茎抗体的假设。我们在ELISA中用嵌合的cH6/1、全长H2和H18 HA抗原检测了参与A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2疫苗临床试验的接受者的抗茎抗体。该疫苗诱导成人和儿童产生高滴度的抗H1茎抗体，而AS 03佐剂疫苗诱导的抗体效价较高。我们还观察到与H2和H18 HAS的交叉反应。A/H9N2疫苗可诱导成纤维细胞和记忆性B细胞反应。疫苗接种后的血清可保护小鼠免受cH6/1N5和CH5/3N4病毒的致命攻击。这些发现支持了以HA秸秆为基础的通用流感病毒疫苗的概念.电子邮件：NCT 02415842。

流感是重大的公共卫生负担，对临床和经济产生重大影响。1预防流感疫苗是预防流感的基石，世界卫生组织(世卫组织)建议为幼儿、老年人、孕妇、某些慢性病患者和保健工作者接种疫苗。2

血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是流感病毒表面的两种主要糖蛋白。HA包括膜-远端球状头结构域和膜-近端柄结构域.在流感病毒感染期间，病毒通过病毒HA球状头部与宿主细胞的唾液酸受体结合进入宿主细胞。3目前的流感病毒疫苗通过诱导针对HA头部结构域的血清中和抗体发挥作用。4头部结构域是免疫显性的，流感病毒疫苗引起的大部分体液免疫反应都是针对它的。5它具有很高的可塑性，并且经历了恒定的抗原漂移，6,7,8这意味着，季节性流感病毒疫苗几乎每年都必须重新设计，以使它们能够诱导出识别新的变异体的抗体。9

世卫组织每年就季节性流感病毒疫苗的组成提出建议，其依据是对哪些病毒株将在下一个季节中占主导地位的预测。9在某些季节，预测是不完美的，导致病毒疫苗株与循环株不匹配，以及相关的疫苗效果差。10此外，利用目前鸡蛋生产的新疫苗配方，然后灭活和洗涤剂裂解疫苗病毒需要几个月的时间，这显然是不理想的。一种改变游戏规则的通用流感病毒疫苗，能够获得对所有流感病毒株和亚型的持久免疫，可以克服这些问题，是疫苗工业的一个重点领域。

A型流感病毒按系统发育分为第1组和第2组。与HA头部结构域相比，茎结构域在这些组中相对保守。抗茎抗体在动物模型中被广泛应用于流感病毒株和亚型的保护，广泛地遵循了这一系统发育。11,12因此，茎结构域是开发通用流感病毒疫苗的一个有吸引力的目标。在临床前的研究中，用含有茎结构域但缺乏头部结构域(微型HA结构)的结构物进行免疫接种已被证明能诱导免疫反应。13,14,15第一阶段的临床试验正在使用这种方法(NCT 03814720)。另一种方法是利用一系列具有不同HA头部结构域和保守的茎结构域的嵌合流感病毒进行顺序免疫，以克服头部结构域的免疫优势，并将免疫系统转向茎结构域。16,17使用佐剂可以增加体液免疫反应的强度。18,19,20

成年人类对以前的季节性流感病毒暴露的HA茎结构域有预先存在的免疫力。21从理论上讲，用含有非人类流通的流感病毒株的HA的流感病毒疫苗免疫应该会提高这些预先存在的抗茎抗体，因为头部结构域不会被识别，记忆中具有保守茎结构域特性的B细胞也会被召回。10,11因此，含有大流行或大流行前流感病毒的疫苗可以作为一剂HA嵌合的广泛反应性疫苗的替代品。在先前的研究中观察到了这一效应，即检测H5和H7流感病毒疫苗接种后HA茎抗体的水平。22,23,24在本研究中，我们进一步验证了这一假设，使用测定血清中HA-茎抗体的方法，这些抗体来自于以往的临床试验，包括含有大流行或大流行前病毒的不同疫苗(即A/H1N1、A/H5N1、A/H9N2)或季节性流感病毒疫苗。

临床试验包括25,26,27,28,29,30,31,32参加人数见表1...补充表显示了HI对疫苗同源病毒和A/H1 N1pdm09病毒的人口学特征和疫苗接种前血清阳性率。1和2分别。

ELISA法

抗H1茎抗体

所有成年受试者在接种前均为ELISA阳性(≥66 EU/mL)抗H1茎抗体。在甲型H1N1流感研究中，接种前GMT约为7000 EU/mL(试验1)，而在其他成人研究中，接种前GMTs介于8500至14，000 EU/mL之间。在同源的主要促进成人研究(试验1−3)中，大流行的A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2疫苗引起了对H1柄的免疫反应(图1)。1A)。GMTs在第一次接种疫苗后大幅上升，21天后第二次注射后，GMTs的上升幅度很小，或者没有增加(图一)。1A；补充表3)。GMTs仍高于接种后6个月的基线水平(A/H5N1疫苗为12个月)，每种疫苗的下降速度与之相似(图1)。1A)。季节性IIV 4(试验4)也引起抗H1茎抗体(图4)。1A)。本试验的大多数参与者(90%)对甲型H1N1疫苗-同源病毒基线HI呈阳性反应(A/克赖斯特彻奇/16/2010；补充表)。2)。与A/H5N1或A/H9N2疫苗相比，A/H1N1疫苗的MGIS更高(见图)。1B；补充表3).

补充表3显示了95%CI和MGI的GMT和MGI值。IND：A/印度尼西亚/5/05；Turk：A/土耳其/土耳其/1/2005；VT：A/越南/1194/2004。误差栏表示95%的置信区间。Ci：置信区间；ELISA：酶联免疫吸附试验；GMT：几何平均滴度；IIV 4：灭活四价流感疫苗；MGI：平均几何增量。

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观察到对所有大流行疫苗都有佐剂效应，尽管A/H1N1疫苗在佐剂或不佐剂的情况下会引起强烈的H1茎反应。第一次接种疫苗后21d的GMT比值(佐剂/非佐剂)为：A/H1N1疫苗1.12(95%CI：0.73，1.72)，H5N1疫苗1.66(1.12，2.47)，A/H9N2疫苗1.39(1.14，1.69)。≥效价增加4倍的参与者(−16.5，36.8)，27.1(6.0，47.0)和3.3(−13.1，20.2)的相应值分别为10.8(−16.5，36.8)，27.1(6.0，47.0)和3.3(−13.1，20.2)。

抗H1茎反应的模式在异源主要促进研究(试验5和6)反映了试验1−3(图1)。1C，d；补充表3)。A/印度尼西亚/5/2005(A/H5N1，印度尼西亚)和A/土耳其/土耳其/1/2005(A/H5N1土耳其)在18个月后进行的反应类似于两个剂量的A/H5N1土耳其，间隔12个月(试验5)。在试验6中观察到了类似的结果(图6)。1C，d；补充表3)。两种增强疫苗都能产生类似于初级疫苗的高滴度。

所有儿童在接种前均为抗H1杆抗体阳性，GMTs约为2000 EU/mL(试验7)。接种后抗H1茎抗体GMT在AS 03-佐剂A/H5N1疫苗组升高，但滴度低于成人(图一)。1E，f；补充表3)。安慰剂组GMTs没有增加。

抗H2和抗H18茎抗体

在第二次疫苗接种后21天进行应答评估，因为此时预期抗体滴度最高。H2和H18抗体与H1茎反应相似(图1)。2A-f；补充表4；补充表5；补充图。1)。注射IIV 4后的抗体水平低于佐剂大流行疫苗(图1)。2A)。在异源一级增强试验(试验5和试验6)中，抗体反应与使用两剂A/H5N1土耳其或越南的方案相似，而使用A/H5N1印度尼西亚，然后是A/土耳其或A/越南，然后是A/印度尼西亚(图5/印度尼西亚)。2C).

补充表4显示了95%CI和MGI的GMT和MGI值。IND：A/印度尼西亚/5/05；Turk：A/土耳其/土耳其/1/2005；VT：A/越南/1194/2004。误差栏表示95%的置信区间。Ci：置信区间；ELISA：酶联免疫吸附试验；GMT：几何平均滴度；IIV 4：灭活四价流感疫苗；MGI：平均几何增量。

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微整化试验

对于所有疫苗，观察到一定水平的中和抗H1茎抗体。3A-f)。在疫苗异型抗体中，A/H5N1和A/H9N2组疫苗免疫后GMTs和MGIS对A/H 5 N8、A/H1N1类猪流感病毒和A/H1 N1pdm09病毒的抗率普遍较低，在A/H1N1和IIV 4组中抗A/H 5 N8的抗体水平较低(附图)。2, 3和4)。但是，A/H1N1和IIV 4组对A/H1N1禽流感病毒和A/H1N1 N1pdm09病毒有较高的中和效价。

IND：A/印度尼西亚/5/05；土耳其：A/土耳其/1/2005；VT：A/越南/1194/2004。误差栏表示95%的置信区间。GMT：几何平均滴度；IIV 4：灭活四价流感疫苗；MGI：平均几何增量。

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质体细胞与记忆B细胞反应

外周血细胞中纤溶细胞检测的动力学符合预期，33,34疫苗接种后1周达到高峰。对A/H9N2裂解病毒和H1茎结构域(cH6/1)的质体细胞在第一和第二次疫苗接种后7d后均有反应，第二次接种后有较高的应答趋势(图二)。4A-C)。相反，第一次给药后，细胞对H9头结构域的反应较少，但大多数人在第二次剂量调整后才能诱发，说明同源增强剂重新建立了HA头部结构域的免疫优势(如图所示)。4C)。佐剂疫苗比非佐剂疫苗有更强的纤溶细胞反应。对A/H9N2分裂病毒和H1茎区的记忆B细胞反应与同源纤溶细胞反应相同。4D-f).

接种H9N2疫苗后，质体细胞和记忆B细胞对H9N2分裂病毒、H1茎区和H9头部结构域的反应。

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被动转移/病毒挑战

对接种AS 03-佐剂A/H5N1疫苗(试验2)的接种者血清抗体对致命剂量为cH6/1N5或CH5/3N4病毒的小鼠提供的保护程度进行了评价。由于人类对H6头和N5是天真的，因此cH6/1N5病毒中唯一能够启动人类的抗原是H1茎，因此，挑战cH6/1N5病毒主要是检测H1 HA茎抗体。基于同样的原则，挑战CH5/3N4病毒主要测量HA头部抗体。

疫苗接种后42天血清对cH6/1N5病毒攻击所致的体重减轻有保护作用，降低了病毒的肺滴度(图一)。5A，b)，而在基线和接种后1年采集的血清则没有。在接种后42天收集的血清中，CH5/3N4头部结构域病毒对体重减轻和非常低的病毒肺滴度有更大的保护作用(图一)。5D，e)。在基线和接种后1年收集到人血清的小鼠在接种CH5/3N4病毒后体重大幅下降，并有较高的病毒肺滴度。

误差条表示平均值(SEM)的标准误差。D：日；dpi：注射后的天数；pbs：磷酸盐缓冲溶液；pfu：菌斑形成单位。

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以高度保守的HA秸秆结构域为靶点，采用含有外来头和保守茎结构域的嵌合HA疫苗进行连续免疫，是开发通用流感疫苗的途径之一。虽然HA头部结构域具有免疫优势，但这种策略可能会将免疫系统转向茎结构域。16,17成人通过自然接触循环污渍和/或季节性接种，对流感病毒抗原有高度复杂和可变的接触史。从理论上讲，先前这些经验引发的抗秸秆抗体应该通过流感大流行疫苗的免疫来增强，该疫苗含有来自非人类流通的流感病毒株的HA，因为头部结构域不会被识别，而针对茎区保守表位的记忆B细胞将被激活。在本研究中，我们验证了大流行性流感疫苗可以替代一剂HA嵌合疫苗的假设，并在启动的人群中增强对茎结构域的免疫反应。

在我们的研究中，所有的成人在接种前都是ELISA阳性的抗H1茎抗体，这与以前的研究一致，表明成人已经存在HA茎抗体。21,35成人疫苗接种前GMT在不同试验中基本一致，范围在7，000−-14，000 EU/mL之间.试验间疫苗接种前滴度的微小差异可能是由不同的试验纳入/排除标准(包括参与者年龄)或试验之间先前病毒暴露程度的差异造成的。其中一些试验是在2009年甲型H1N1流感大流行之前进行的，另一些是在2009年甲型H1N1大流行之后进行的。6)，而且以前已经证明HA茎抗体的滴度在大流行后得到了提高。36,37

临床试验的时间表。

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我们观察到，第一次接种甲型H1N1、A/H5N1和A/H9N2疫苗后，抗H1茎抗体的效价显著提高，这与类似的研究相一致，该研究评估了接受A/H5N1或A/H7N9疫苗的人诱导抗H1茎抗体的情况。22,23,24根据MGI的测定，A/H1N1疫苗的诱导率高于A/H5N1或A/H9N2疫苗，这可能是由于甲型H1N1流感疫苗接种前滴度较低所致。佐剂作用在疫苗之间是有差异的，A/H1N1疫苗在佐剂或不佐剂的情况下会引起强烈的免疫反应，而对A/H5N1和A/H9N2疫苗则有很强的佐剂效应。这可能是由于疫苗病毒株在免疫原性上的差异或研究小组之间在现有抗体滴度水平上的差异所致。A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2疫苗接种6个月后(A/H5N1/H5N1疫苗接种后1年)，特别是佐剂组，抗H1茎抗体效价仍高于接种前水平。接种季节性IIV 4(非佐剂)也可诱导抗H1茎抗体。在另一项研究中，我们观察到连续接种A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2流感病毒疫苗的小鼠也显示出HA茎抗体的诱导，在接受佐剂疫苗的组中抗体水平较高。补充图描述了这项研究的数据和方法。5.

在接种前，所有儿童的抗H1茎抗体均呈ELISA阳性，尽管水平远低于成人。接种A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2疫苗后，儿童抗H1杆抗体滴度低于成人，但反应模式相似。对没有接触过流感病毒的幼儿进行感染或疫苗接种，可能需要采取特定的疫苗接种策略，在使用通用流感病毒疫苗抗原诱导高抗体滴度之前，首先首先接种HA茎抗体。在临床前的研究中，用灭活的季节性流感病毒疫苗启动已显示出一些前景。19,38在使用通用疫苗抗原之前，也有可能使用季节性流感病毒疫苗。

在同源的质促进研究中，有21天的质数提升计划(试验1−3和7)，第二个疫苗剂量诱导了有限的抗茎抗体。这是意料之中的，因为反应可能是针对医管局的头域，而不是医管局的茎。事实上，在本研究中证明了这一点，在第二次注射A/H9N2疫苗后，H9头部特异性的纤溶细胞反应就证明了这一点。试验5和试验6比较了异源增强方案(A/H5N1印度尼西亚方案，随后是A/H5N1土耳其促进方案和A/H5N1越南方案，随后是A/H5N1印度尼西亚方案)与同源增强方案(两剂A/H5N1土耳其方案或两剂A/H5N1越南方案)进行了比较。比较的目的是评估A/H5N1亚型的异源毒株是否具有足够的特异性，以增强HA茎抗体，而不是HA头部特异性反应。抗茎抗体滴度在启动剂量后上升，在注射助推器剂量前的12个月内下降到略高于基线水平，然后在注射剂量后上升到类似于启动剂量所诱导的水平。无论是异源的还是同源的助推器剂量，助推器剂量诱导的效价都是相似的。在异源一级增强方案中，启动疫苗和增强疫苗的头部结构域是相似的。因此，增强剂的剂量可能提高了头部反应，而不是引起抗茎效价的进一步上升。这突出表明，作为通用疫苗战略的一部分，需要采用完全不同的头部结构域或无头HA秸秆进行连续接种。

我们使用全长重组H_2和H_(18)HA抗原评估了佐剂大流行疫苗和IIV 4的免疫应答范围。我们选择H2是因为它来自与H1病毒相同的类别，并且以前曾在人类中引起过一次大流行。39H18之所以被选中，是因为它是甲型流感病毒组中与H1最不同的一组。疫苗接种后，所有人群的抗H2和抗H18 GMTs均有增加，表明大流行性流感病毒疫苗诱导的一些抗体可与第1组中的病毒发生交叉反应。在我们之前的研究中，我们发现对H2和H18病毒都有交叉反应，但对2H3病毒没有交叉反应。22因此，一种以茎为基础的通用流感病毒疫苗可能需要来自甲型流感病毒第1组和第2组的HA抗原，或诱导抗两组抗体的茎结构域，以及流感B病毒柄抗原。

在所有研究中都观察到了一些中和抗茎抗体的诱导，尽管其水平低于A/H5N1和A/H9N1研究中诱导的疫苗-同源株中和抗体(试验2和试验3)。26,27较弱的中和抗茎抗体的诱导与描述的抗HA茎抗体的低中和活性是一致的，这已经被证明主要是通过fc介导的功能来介导保护。39,40,41,42,43A/H5N1和A/H9N2疫苗组疫苗亚型中和率较低。然而，接种A/H1N1和IIV 4疫苗后，对甲型H1N1禽流感病毒和A/H1N1 N1pdm09流感病毒的中和效价较高。这一效应很可能是由头部区域的抗原位点的保护所驱动的。

在A/H9N2疫苗组第一次接种疫苗后，A/H9N2裂解病毒和H1茎区(尽管频率较低)有强烈的纤溶细胞反应，但对三聚体H9头部结构域无明显反应。在第二次疫苗剂量后(遵循类似于茎特异性抗体反应的模式)，对分裂病毒和茎结构域的纤溶细胞应答频率相似，并观察到对H9头结构域的反应(与第一次剂量后的反应相比)。这与以前用A/H5N1大流行疫苗产生的数据相一致，表明第二种疫苗剂量(Re)指导对头部结构域的免疫反应。23AS 03佐剂组的浆细胞反应明显高于非佐剂组。我们观察到A/H9N2分裂病毒和H1柄结构域在第一和第二次疫苗剂量后对记忆B细胞的反应增加，但对H9头部的反应仅在第二次接种AS 03-佐剂疫苗后才出现。

我们评估了接受A/H5N1疫苗(试验2)的人血清中的抗体是否能在体内保护小鼠免受致命剂量的cH6/1N5或CH5/3N4病毒的攻击。cH6/1N5病毒的挑战主要是测量抗H1茎抗体；因为人类对H6头部和N5都很幼稚，因此H1茎是这种病毒中唯一一种可以为人类准备好的HA抗原。同样，CH5/3N4病毒的挑战主要是检测抗H5头部抗体。我们发现，免疫前采集的血清在所选择的设置中没有保护作用，但在接种AS 03-佐剂A/H5N1后42天收集的血清可防止体重下降，降低病毒肺滴度。血清似乎对CH5/3N4在LD的5倍范围内具有完全的保护作用。50剂量，在小鼠没有表现出发病率和有一个几乎没有病毒复制，暗示H5头部反应完全中和病毒。保护免受cH6/1N5挑战(也是LD的5倍)50)不完全(在恢复前观察到一些体重减轻)，但与疫苗接种前血清相比仍然非常可观。病毒肺滴度降低，说明H1茎反应具有一定的感染修饰活性。

A/H5N1疫苗诱导的抗茎抗体对表达H1柄的病毒株的攻击具有保护作用。40两种抗体(HA头特异性抗体与HA茎特异性抗体)对两种攻击菌株的保护效果之间的差异可能突显出这两种抗体的不同作用机制。然而，由于病毒在小鼠体内表现出不同的表型，在本实验中不可能直接比较HA头和HA茎抗体所提供的保护水平。总的来说，cH6/1N5病毒在低剂量下比CH5/3N4病毒具有更高的杀伤力，这表明它是一种更适合的病毒，这反映在接受预先接种血清的小鼠的肺病毒滴度之间的差异。因此，我们不能得出结论，与抗HA茎抗体相比，抗HA头部抗体提供了更好的保护。接种1年后采集的血清对两种病毒(cH6/1N5和CH5/3N4病毒)均无保护作用。这表明，在这一临床前模型中，佐剂A/H5N1疫苗诱导的抗HA头部反应在长期对抗致命挑战剂量方面没有表现出优于抗HA茎反应的效果。应该注意的是，如果有预先存在的抗体的人类面临类似的挑战，那么与这些抗体相对应的产生抗体的细胞就会产生更多的抗体来对抗感染。这可能导致人类对病毒的清除速度比在这些天真的老鼠身上观察到的要快。

基于嵌合HA的流感病毒候选疫苗目前正在临床试验中测试。第一阶段随机试验正在评估方案的免疫原性，包括初始接种CH8/1N1减毒活疫苗，然后是佐剂和非佐剂CH5/1N1灭活疫苗，或初始接种CH8/1N1佐剂灭活疫苗，然后是佐剂CH5/1N1灭活疫苗(NCT03300050)，第I/II阶段试验评估9种佐剂和非佐剂嵌合HA灭活疫苗(NCT 03275389)的免疫原性。使用CH8/1N1结构对试验进行的中期分析表明，用灭活疫苗(而不是减毒活疫苗)进行的主要免疫接种会引起免疫应答，而所有方案在增强接种后都会产生免疫应答。44虽然我们先前在一种临床前小鼠模型中已经证明，HA茎抗体反应可以维持在较高的水平上，持续很长时间，19在第一阶段试验中产生的抗体滴度在最初的强增长后开始下降。44这可能是由于先前存在的B细胞分化成短命的浆细胞，而不是长寿命的浆细胞。然而，在接受佐剂疫苗的个体中，HA茎抗体滴度维持在基线以上。44为了进一步提高持续的高抗体反应，必须找出优先诱导长寿命血浆细胞产生HA茎抗体的途径。

总之，我们的研究表明，表达HA头部结构域的A/H1N1、A/H5N1和A/H9N2大流行疫苗在成人和儿童中诱导了抗H1茎免疫应答。疫苗接种前，成人的抗H1茎抗体水平高于儿童。AS 03佐剂的作用是可变的。疫苗接种后产生的抗体与H_2和H_(18)病毒交叉反应，显示为异亚型免疫。此外，疫苗接种者的血清在小鼠体内具有保护作用，说明尽管中和抗体滴度低，抗体功能最有可能通过FC区域。这些发现支持基于诱导抗茎抗体的通用疫苗策略的概念，通过不同HA头结构域的序贯免疫来诱导抗茎抗体。

伦理

这是一项回顾性研究，使用了七个已完成的临床试验的存档血清样本。该研究议定书由H pital Erasme独立道德委员会批准(布鲁克斯大学；第P 2015/173号议定书)，这项研究是根据“赫尔辛基宣言”和“良好临床做法”进行的。参与者或法律上可接受的代表提供书面知情同意参加原始临床试验，并同意其样本用于进一步研究。这项研究于2015年4月14日在临床试验中注册(NCT 02415842)。

临床试验、参与者和疫苗

我们包括以下大流行或大流行前流感病毒疫苗(以下简称大流行性流感疫苗)或季节性流感病毒疫苗的试验数据：三个在成人中灭活、分裂-病毒A/H1N1、A/H5N1/H5N1和A/H9N2大流行性流感疫苗(试验1、2和3)的同源主要促进试验(试验1、2和3)、成人单剂量季节性灭活四价流感病毒疫苗(IIV 4)试验(试验4)、成人A/H5N1大流行性流感疫苗两次异源促进试验(试验5和6)，和一项与A/H5N1大流行流感疫苗在儿童中的同源的一级推进试验(试验7)(图7)。6表1；补充表6).25,26,27,28,29,30,31,32我们的目标是从每个试验的相关治疗组中选出大约30名参与者。如果参与者已经按照协议完成了临床试验，并且在所有协议指定的样本时间点都有足够的剩余样本量，那么他们就有资格参加本研究。

除试验2中使用的A/H5N1疫苗外，所有疫苗都是在鸡蛋系统中生产的，该疫苗是细胞培养衍生的。对<12个月的儿童在三角肌或大腿注射0.5 mL体积的疫苗。表中描述了疫苗株、疫苗接种计划和用于免疫反应测量的血液取样计划。1...AS 03是一种含ɑ-生育酚(AS 03)的水乳状液辅助体系。A：11.86毫克；AS 03B：5.93毫克。45

研究目标

我们包括试验1−4，以测试具有外来HA头结构域的大流行性流感病毒疫苗的潜力，与季节性流感病毒疫苗相比，该疫苗能在个体中诱导抗HA茎抗体，而季节性流感病毒疫苗被认为主要是由于以前暴露于同型季节性毒株而引起抗HA头部特异性免疫反应。试验5和试验6测试相同病毒亚型(A/H5N1)的异源毒株是否有足够的不同，主要是提高HA茎抗体，而不是HA头部特异性反应。我们包括了儿童队列(试验7)，以测试是否可以在已经存在的HA茎抗体水平很低的个体中激发HA茎抗体。

我们选择试验和抗原来评估大流行疫苗引起的抗茎抗体的水平和功能，以及免疫应答的呼吸。此外，我们还从B记忆细胞和浆细胞反应的角度评价了细胞介导的免疫功能，以及实验参与者血清对小鼠体内的保护作用。

本研究有四个共同的目的：(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗H1茎抗体的应答；(2)接受AS 03佐剂疫苗或IIV 4的参与者的微整化(MN)抗H1茎抗体反应；(3)接受AS03佐剂疫苗或IIV 4的参与者的抗H2全长HA和抗H18全长HA抗体应答；(4)接受AS03佐剂疫苗或IIV 4患者的疫苗异型抗体应答。从几何平均滴度(GMT)和平均几何增量(MGI)两方面综述了抗体的应答情况。

我们以AS 03佐剂对抗茎抗体水平的影响为次要指标(AS 03-佐剂/非佐剂)和≥效价升高4倍者(AS 03-佐剂减非佐剂)的比例差异进行了评价。本研究还以HI法检测大流行疫苗同源病毒的免疫前血清学阳性率，作为第二目标。

我们在试验3(收集这些细胞的唯一试验)的B记忆细胞和浆细胞反应方面评估了细胞介导的免疫作为第三级终点。此外，血清被动转移/病毒攻击实验评估了试验2中接受AS 03佐剂疫苗的参与者的体内保护作用。

免疫原性试验

ELISA法

我们使用来自A/mallard/瑞典/81/2002(A/H6N1)和来自A/California/04/2009(A/H1N1大流行株)的h6头结构域的重组嵌合hh 6/1 HA抗原(A/h1n1)检测抗H1柄抗体。2)。此外，我们还分别基于A/Japan/305/1957和A/平面BAT/秘鲁/033/2010病毒，用全长重组h2和h18 HA抗原评估了免疫应答的宽度。46,47(表)2)。重组蛋白在毛滴虫利用杆状病毒表达系统衍生的BTI-TN-5b1-4细胞。所有蛋白均含有C端三聚结构域和用于纯化的六氮胞苷标记.我们采用经典的ELISA法，将抗原包被在96孔板上，阻断后加入血清，然后依次稀释。经过培养和洗涤后，检测抗体(小鼠抗人IgG HRP克隆JDC-10[Southern Biotech，CAT])。第9040-05号；1：2000)用于区分附在抗原上的血清抗体。用光密度法测定血清抗体含量。除抗原特异性标准外，还建立了阳性和阴性对照。检测截止量为66 EU/mL(ELISA单位/mL)。

锰测定

我们用反向遗传重组病毒与A/mallard/瑞典/81/2002(A/H6N1)、A/California/04/2009(A/H1N1大流行株)和N5(A/mallard/瑞典/86/2003(A/H12N5)的H6头结构域进行MN分析，评价抗H1茎抗体的功能。2)。由于人类一般对H6头部结构域和N5神经氨酸酶是天真的，这种病毒应该主要测量HA茎抗体介导的中和作用。用A/H5N8(A/GyrFalcon/Washington/41088-6/2014的HA和NA反向遗传学重组病毒)、A/H1N1类禽流感病毒(A/猪/江苏/40/2011)和A/H1 N1pdm09病毒(A/新加坡/GP 1908/2015)的同一方法对疫苗-异型中和进行了评估(表A/新加坡/GP 1908/2015)。2).

样品经受体破坏酶(Denka Seiken)处理，56℃热灭活30 min，标准病毒量(200个菌斑形成单位[PFU]或50%组织培养感染剂量的100倍，视病毒株而定)与含N-甲基苯丙氨酸氯甲基酮的胰蛋白酶处理的胰蛋白酶(Lonza Bioscience)(1：1000稀释)混合，在室温下与病毒结合1 h。将病毒-血清混合物加入Madin-Darby犬肾细胞，在33°C或37°C(视病毒株而定)条件下孵育1h，孵育后取病毒血清混合物，以原浓度稀释血清代替。孵育48−72h(视病毒株而定)后，用细胞上清液测定鸡红细胞(浓度：0.5%)的血凝，观察病毒复制情况，并在血清稀释度最高时计算病毒的中和效价，使病毒完全中和。每例血清标本检测一次。检测截止时间为1：10。

血凝抑制试验

对相应的疫苗株进行了Hi试验。用标准化的、综合验证的微量法对解冻后的血清样品进行了测定，采用每25L适当抗原的两个血凝单位和0.45%的鸡红细胞悬液。48用RDE和热灭活方法去除非特异性血清抑制剂。从初始稀释度为1：10开始，配制了稀释系列(稀释倍数为2)，最终稀释倍数为1：10，240。以滴定终点为最高稀释步骤，完全抑制血凝。所有检测一式两份。截止值为1：10。

记忆B细胞和浆细胞检测法

采用酶联免疫吸附法(ELISpot)检测外周血HA茎特异性记忆B细胞的频率(每百万记忆B-细胞)。该方法是根据CroTTY(2004)的方法进行的。49在体外刺激外周血单个核细胞(PBMCs)5天后，将记忆B细胞分化为抗体分泌细胞，然后在涂有感兴趣抗原(用于检测抗原特异性记忆B-细胞)或抗人Ig(用于检测总记忆B-细胞)的硝基板中孵育。采用常规免疫酶法检测抗体/抗原斑点计数记忆B细胞，结果表示为抗原特异性记忆B细胞在总记忆B细胞群体中的频率。同样的方法不需要体外刺激步骤，用同样的方法来测定浆细胞的反应。对下列抗原的反应进行了评估：A/鸡/Hong Kong/G9/1997(A/H9N2)分离病毒、H1茎结构域(上述嵌合cH6/1抗原)和三聚体H9球头结构域(基于A/鸡/Hong Kong/G9/1997的重组蛋白)(见表)。2).

被动转移/病毒挑战

从试验2中接受AS03佐剂疫苗的参与者中收集的血清样本按时点(基线，第一次接种后42天[第42天]和接种后1年[第385天])汇总。我们包括基线数据，以便比较疫苗接种前与接种后血清的保护效果。受体BALB/c小鼠腹腔注射150 L混合血清，然后分别接种CH5/3N4或cH6/1N5病毒(分别测量头和茎反应)(表)2)。评估血清提供的保护水平，包括平均体重减轻(在挑战后14天内从基线上的变化)和肺病毒滴度的变化(Log)。10与基线[PFU/mL]之差翻倍)。50微升病毒制剂稀释在磷酸盐缓冲液生理盐水内。CH5/3N4病毒的剂量为16，000 pfu，用于减肥分析(相当于5xLD)。50在正常人血清存在下)和280 pfu进行肺病毒滴度分析。cH6/1N5病毒的相应剂量为200 pfu(相当于5xLD)。50在正常人血清存在下)和18 PFU。每组10只。病毒攻击后体重下降超过25%的小鼠由于伦理原因而被安乐死，并被视为死亡。

统计方法

GMT计算采用log 10滴度变换平均值的反对数。在GMT计算中，抗体滴度低于试验截止值的任意值为截取值的一半。每组分别获得95%可信区间(CI)。在对数变换值正态分布且方差未知的情况下，首次得到了对数转换滴度均值的95%CI。通过对95%CI的指数变换，得到GMTs 95%CI的对数转换效价均值。所有计算的顺铂均为双面。以Clopper和Pearson的方法为基础，对组内某一比例的95%顺铂进行了测定。50以疫苗组为固定效应，以基线滴度为协变量，采用方差分析模型，计算调整后的GMT比值和95%的顺铂(Cis)值，并与非佐剂组进行比较。