人类单核细胞可分为两类，具有明显的特征。在本研究中，我们报告了CD 14在这两个亚群间的凋亡电位差异。+/低CD 16+单核细胞比CD 14更敏感+CD 16−单核细胞在活性氧(ROS)诱导下发生自发凋亡和凋亡。通过全球转录和蛋白质组学方法，我们观察到CD 14+/低CD 16+单核细胞表达较高水平的促凋亡基因和蛋白质，如肿瘤坏死因子。α、caspase 3、bax和细胞色素ccaspase 3和7活性较高。它们还表现出更强的有氧呼吸，从而使线粒体产生更多的活性氧。CD 14+CD 16−单核细胞则表现出较高的谷胱甘肽代谢基因(如谷胱甘肽过氧化物酶和微粒体谷胱甘肽S-转移酶)的表达，并比CD 14更能抵抗氧化应激。+/低CD 16+单核细胞。CD 14细胞凋亡+/低CD 16+单核细胞是依赖于ROS的，因为降低ROS水平可以显著降低细胞死亡。这是人类单核细胞亚群存在差异凋亡倾向的第一次报告，更好地了解这一过程可能有助于更好地理解这些亚群在稳态和病理条件下的作用，特别是在存在高水平氧化剂的情况下。

单核细胞在骨髓中产生，并在稳定状态下补充死亡的组织巨噬细胞。1由于组织巨噬细胞的寿命相对较长，骨髓中产生的单核细胞通常远远超过补充死亡组织巨噬细胞所需的数量。因此，单核细胞将留在血液中最多3天，然后自发地进行凋亡。2, 3

细胞凋亡是调节免疫细胞数量的重要机制。单核细胞培养离体在没有血清或激活因子的情况下，会自发地死亡，这会被抗Fas或FasL的中和抗体(Abs)所阻断。4活性氧(ROS)和半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)参与了Fas介导的单核细胞和其他细胞的死亡。5, 6ROS在细胞死亡中的作用已经有了很好的记录。它在细胞凋亡过程中升高。7并能诱导多种不同类型的细胞凋亡。6用抗氧化剂阻断活性氧也能抑制细胞凋亡。5ROS通过bax易位、细胞色素释放诱导线粒体功能紊乱，从而促进细胞死亡。c激活caspase。8除了外源性的ROS外，细胞内的ROS也被认为是一种保守的凋亡信号。事实上，线粒体在有氧呼吸过程中会主动持续地产生活性氧。9除有氧呼吸外，谷胱甘肽(GSH)库的耗竭也会导致细胞内活性氧(ROS)在细胞凋亡过程中增加。10

单核细胞是异质性的，可大致分为两大类，即CD 14。+CD 16−(以下称为CD 16−)和CD 14+/低CD 16+(下称CD 16+)；11和Gr1+CX3CR1低层(以下简称Gr1+)和GR1−CX3CR1嗨(下称Gr1−)小鼠。12这些子集在表面标记的表达上表现出明显的表型，11, 13以及迁移能力和分化潜能等功能。12有趣的是，几组人在转基因小鼠模型中观察到小鼠单核细胞亚群发生凋亡的差异倾向，使Gr1−单核细胞不能持续存在。12, 14, 15在人类身上，CD 16+单核细胞在许多炎症条件下，如脓毒症，都会大量膨胀，16HIV感染17以及自身免疫性疾病，18, 19这可能是因为存活率的提高。3, 20

我们从转录和蛋白质组学数据中观察到一个凋亡信号，表明CD 16+单核细胞有更大的凋亡倾向。尽管有数据表明上述小鼠单核细胞亚群之间存在差异凋亡潜能，但在人类单核细胞亚群中还没有类似的数据。在本研究中，CD 16+单核细胞表现出较高的有氧呼吸能力，表达较低水平的抗氧化基因，提示这些细胞正经历氧化应激。因此，他们有一个更大的倾向，自发经历凋亡。更好地了解这些亚群差异凋亡潜能的机制，将有助于阐明它们在稳态和炎症条件下的作用，特别是在存在高水平氧化剂的情况下。

单核细胞亚群间差异表达转录本和蛋白质的鉴定

从外周血单个核细胞(PBMCs)中常规纯化CD 16+和CD 16−两种单核细胞亚群，纯度>95%。图1)。在转录学方面，实验分别使用来自四个不同个体的样本进行。蛋白质组学实验使用三个不同个体的样本，并在QSTAR(应用生物系统；MDSSciex，ForstCity，CA，USA)和LTQ-Orbitrapp(热芬尼恩，圣何塞，加利福尼亚州，美国)质谱计上运行三次。由于从单个样本中获得的CD 16+单核细胞数量有限，所以收集样本进行蛋白质组学研究。用于转录组学和蛋白质组学的样本是不同的。通过转录谱分析，在Illumina微阵列(Illumina，San Diego，CA，USA)上的48701个转录目标中，有10982个被可靠地鉴定为两个单核细胞亚群，并用于确定差异表达的转录本。使用≥的折叠变化∣2∣以单核细胞亚群为截止标准，鉴定了520份差异表达的转录本(图1a)。通过蛋白质组学分析，从QSTAR和LTQ-OrbitRAP两种靶标中共鉴定出2776个单核细胞亚群。根据≥标准，共鉴定出1493种蛋白质。∣2∣MS与相对强度比<∣1.5∣对于这两个平台的技术复制，只使用了一个误差因子<2的QSTAR。在1493个蛋白质中，455个在≥上有差异表达。∣1.5∣-单核细胞亚群之间的多重变化(图1a)。有趣的是，在这两个平台上，只有27个差异表达的目标被识别出来(图1b)。然而，当差异表达的转录本和蛋白质被映射到生物过程中时硅中利用大卫20MetaCore(GeneGo，San Diego，CA，USA)或独创性路径分析(IPA，Increence Systems，Inc.，Redwood City，CA，USA)，他们共享许多共同的生物过程(数据未显示，赵先生)。等人21细胞死亡是鉴定的主要过程之一。当比较与细胞死亡过程相关的目标时，只有两个目标在两个平台之间是共同的(图1c)。差异表达的转录本和蛋白质的列表可在http://mendel.bii.a-star.edu.sg/SIgN/PKGroup/BloodMonocyte/.

差异表达的转录本和蛋白质的鉴定。(a)流式分析显示在FACSCalibur上使用抗CD 14和抗CD 16的分离单核细胞亚群的纯度。百分比表示子集的纯度。所显示的情节代表了所有的孤立。然后将分离的单核细胞用于转录组学和蛋白质组学，流程图显示了从转录组学和蛋白质组学鉴定出的转录本和蛋白质的数量，以及确定差异表达转录本和蛋白质的统计标准。(b)Venn图显示了两个平台之间重叠的总差异表达的转录本和蛋白质的数量。(c)Venn图显示了两个平台之间重叠的与细胞死亡相关的差异表达的转录本和蛋白质的数量

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凋亡相关转录本和蛋白在单核细胞亚群间的差异表达

与凋亡相关的差异表达靶点列表由56个转录本和23个蛋白质组成。图2a和b和补充表1和2)。其中24份具有促凋亡功能，14份具有促凋亡功能，29份具有抗凋亡功能，8份具有抗凋亡功能，3份和1份同时具有促凋亡和抗凋亡功能。补充表1和2)。在CD 16+单核细胞中，大量具有促凋亡功能的转录本(17/24)和蛋白质(12/14)在较高水平上表达。另一方面，参与抑制凋亡的转录本(29份中有21份)在CD 16−单核细胞中表达较高。图2c和补充表1和2)。所选转录本(TNF)的相对表达水平α、CSP 5、CASP 3、SGPP1、RNF 122、Cyfip 2、IL-1β、VEGF、PROK 2、即时早期反应3(IER 3)、SERPINB 2、ACTN 1和蛋白(Bax、Bid和细胞色素)c)芯片和蛋白质组学数据，分别用实时聚合酶链反应(PCR)进行验证。图2d)、Westernblot(图2e)和流式细胞术(图2f)。对来自三个个体的样本进行了验证，这些样本与转录组学和蛋白质组学中的样本不同。

单核细胞亚群凋亡特征的聚类和验证。促凋亡和抗凋亡转录本的监督聚类(a)和蛋白质(b)使用GEPAS。(c)面板中数据的条形图表示a和b...实时PCR对转录数据的验证(d)和蛋白质组学数据。e)和流式细胞术(f)。与肌动蛋白控制正常后，西方印迹下的数字是相对强度值。错误条代表S.E.M.所显示的数据来自至少三个与转录和蛋白质组学实验不同的生物复制。红色和蓝色分别表示高表达强度和低表达强度。

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CD 16+单核细胞表现出较高的自发性凋亡离体

为探讨CD 16+单核细胞中促凋亡基因的高表达是否反映了细胞自发凋亡的趋势，将分离的单核细胞亚群培养于血清培养基中，用磷脂酰丝氨酸早期凋亡指标Annexin-V和凋亡晚期膜损伤指标-PRO 3检测细胞自发凋亡。离体培养的CD 16+单核细胞早期和晚期凋亡细胞比例均明显高于CD 16−亚群。早在2h和30.6就可以观察到显著的差异。对决13.5%的AnnexinV阳性细胞分别检测到CD 16−和CD 16+(图3a和b)。细胞培养24h后，CD 16+单核细胞中凋亡细胞的比例以较快的速度积累。

CD 16+单核细胞表现出较高的自发凋亡离体文化。(a)流式细胞仪(FACS)分析Annexin-V和to-PRO 3分离的单核细胞亚群凋亡。离体培养所指的不同时间点。在右下象限和右上象限分别显示Annexin-V阳性细胞和Annexin-V/to-PRO 3双阳性细胞占细胞总数的百分比。数据是至少三个独立实验的代表。(b)条形图显示在培养的两个单核细胞亚群中凋亡细胞的百分比，即Annexin-V单阳性细胞和Annexin-V/to-pro 3双阳性细胞。离体指定的时间点。错误条表示S.E.M.，显示的数据来自至少三个生物复制体。**指示P<0.01

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为确定caspase在细胞凋亡中的作用，单核细胞亚群在pa-caspase抑制剂zVAD-fmk存在或不存在的情况下培养24h。如图所示图4a，zvad-fmk处理降低了这两个亚群的细胞死亡，这表明这两个群体都是通过caspase依赖的途径死亡的。在培养3、6h的单核细胞中测定caspase下游活性时，CD 16+单核细胞的caspase 3和7活性显著升高(P<0.0 5)。图4b，下面板)。事实上，caspase 3和7的基础活性也显著升高(图4b、上面板)。虽然这两个亚群都是通过caspase依赖的途径自发凋亡的，但这种途径在CD 16+单核细胞中更为明显。

自发凋亡是caspase依赖的，并通过线粒体发生。(a)培养24h后单核细胞亚群Annexin-V染色直方图图。离体无论是在没有或在z-vad-fmk存在的情况下。数据是三个独立实验的代表。(b)单核细胞亚群中的相对caspase 3和7活性，无论是新分离的(上面板)还是培养的单核细胞亚群。离体3或6小时(下面板)。来自至少三个独立实验的数据被合并，错误条代表S.E.M。**指示P<0.01. (c)分离单核细胞亚群TMRM荧光直方图图。离体文化。数据代表了三个独立的实验，数字表明，相对于细胞总数而言，减少了TMRM荧光的细胞所占的百分比。(d)细胞色素的westernblot分析c在不同时间点从单核细胞亚群中分离出的胞质分数(上板)和线粒体分数(下板)。离体文化。β-肌动蛋白(Actin)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)分别作为细胞浆和线粒体组分的负载对照。在污点下面的数字是与各自的加载控件正常化后的相对强度值。所显示的数据代表了四个独立的实验。

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caspase介导的途径既可以通过死亡受体(外源性)途径发生，也可以通过线粒体(固有)途径发生。一些促凋亡蛋白，如bax，bid和细胞色素。c在我们的研究中发现的是线粒体蛋白，并与通过本征途径发生的细胞凋亡有关。为确定CD 16+单核细胞凋亡是否通过内源性途径发生，检测了线粒体膜通透性(MMP)。用亲脂阳离子荧光染料TMRM观察到CD 16+单核细胞与CD 16−单核细胞相比，在所有时间点均有较高的去极化率，包括培养前的细胞。图4c)。另外两种荧光染料--二极管(Dioc)也得到了类似的结果。6并使用JC-1(数据未显示)。MMP丢失的一个特点是细胞色素的释放。c从线粒体进入胞浆。细胞色素c对这两个亚群的胞浆中的含量进行了评估，发现细胞色素含量较高。c6、24h时，CD 16+细胞的胞浆率均有不同程度的变化。离体文化(图4d)，提示CD 16+细胞的固有凋亡途径更为活跃。

CD 16+单核细胞较少受到氧化应激的保护

GSH代谢是一种与细胞凋亡相关的生物学过程。硅中在两个子集中进行差异调节。GSH代谢保护细胞免受氧化损伤。4种参与谷胱甘肽代谢的转录本，即过氧化物GSH 1(GPX 1)、微粒体谷胱甘肽S-转移酶1(MGST 1)、IER 3和含硫氧还蛋白结构域蛋白1，在CD 16+中的表达低于CD 16−单核细胞。图5a)。用实时聚合酶链反应(PCR)验证了GPX 1和MGST 1的差异表达。图5b)和westernblot(图5c)。为了确定抗氧化基因的低表达是否意味着CD 16+单核细胞处于更氧化的状态，还原型谷胱甘肽水平降低。对决对两种单核细胞亚群中的氧化谷胱甘肽(GSSG)进行检测。CD 16+单核细胞的GSH/GSSG水平低于CD 16+单核细胞的2倍以上，表明CD 16+比CD 16−单核细胞处于更多的氧化状态。图5d)。为了进一步研究抗氧化基因的低表达是否会使CD 16+单核细胞更容易被氧化诱导的细胞死亡，我们用不同浓度的过氧化氢(H)处理这两个亚群。2O2)2或4小时。2O2，在所有处理条件下，CD 16+单核细胞的凋亡细胞比例均高于CD 16−单核细胞，表明其对H的保护作用较差。2O2-诱导凋亡(图5e)。为了证实gpx 1和mgst 1在CD 16−单核细胞中的高表达使这些细胞对氧化剂有更好的保护作用，我们研究了这些单核细胞对4h H的敏感性。2O2用siRNA阻断GPX 1或MGST 1的表达后进行治疗。事实上，这些细胞更容易感染H。2O2-与转染对照siRNA的细胞相比，诱导凋亡图5f)。用两个不同的siRNA序列对每个基因靶点进行比较，得到了相似的结果。在mrna上评估了基因敲除的效率(补充图2a)和蛋白质水平(补充图2b)转染后48h。这表明CD 16−单核细胞中抗氧化蛋白的表达较CD 16+单核细胞更好地保护其免受氧化诱导的细胞死亡。

CD 16+单核细胞不受氧化应激的保护。(a)对与谷胱甘肽代谢相关的转录物进行监督聚类，根据单个转录本的规范化表达水平，利用GEPAS进行聚类。标度上的红色和蓝色分别表示高强度和低强度。用实时PCR技术验证GPX 1和MGST 1在离体单核细胞亚群中的表达b)和西方的杂交β-肌动蛋白作为装载控制(c)。与肌动蛋白控制正常后，西方印迹下的数字是相对强度值。(d)条形图，显示了离体单核细胞亚群中GSH(即还原态)与GSSG(即氧化态)的比值。(e)条形图描述了在单独的单核细胞亚群中凋亡细胞的百分比，即Annexin-V单阳性细胞和Annexin-V/to-pro 3双阳性细胞。2O2关于它们各自未经处理的单核细胞亚群。(f)条形图显示CD 16−单核细胞凋亡的百分比增加，这是GPX 1或MGST 1对siRNA控制的细胞敲除的结果，而siRNA控制则是未处理或用所指示的H浓度处理的细胞。2O2每个靶区分别使用两个不同的siRNA序列。数据按所示公式绘制。所有显示的数据来自至少三个不同的独立实验，错误条代表S.E.M。**指示P<0.01 and *指示P<0.05

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CD 16+单核细胞表现出较高的有氧呼吸率

由于CD 16+单核细胞表达较低水平的抗氧化基因，我们研究了它们是否会表现出较高的细胞内氧自由基水平。CD 16+单核细胞表现出较高的基础ROS水平，用二氯荧光素(DCFH)评价一般的ROS，用二氢乙烷(DHE)评价超氧阴离子，用3‘-(p-氨基苯基)荧光素(APF)对羟基和次氯酸根(图6a).22

CD 16+单核细胞具有较高的有氧呼吸能力。(a)直方图显示细胞内活性氧自由基的水平，用DCFH测定一般ROS，用DHE测定超氧阴离子，用APF测定未受刺激淋巴细胞(固体线)、CD 16−(虚线)和CD 16+(破折线)单核细胞中的羟基和次氯酸根。(b)蛋白质组学数据的蛋白质组学数据，对3种不同个体分离的单核细胞亚群的ATP 5B和NDUFS 3进行Westernblot分析。与肌动蛋白控制正常后，印迹下面的数字是相对强度值。(c)条形图描述了离体单核细胞亚群细胞内ATP水平。(d)流式细胞仪(FACS)用MitoSox分析新分离的单核细胞亚群(0 Min)或以后的线粒体超氧化物歧化酶(线粒体超氧化物歧化酶)。离体培养30 min。这些数字代表了每个盒子内的细胞占细胞总数中线粒体超氧物的百分比。所有显示的数据来自至少三个独立的实验，错误栏代表S.E.M。**指示P<0.01

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有趣的是，我们的蛋白质组学数据显示，参与有氧呼吸的四种蛋白质在CD 16+单核细胞中更丰富。它们是细胞色素NADH脱氢酶(NDUFA 4和NDUFS 3)的两种亚型。c还原酶(UQCRF)和腺苷5‘-三磷酸(ATP)合成酶(ATP 5B)。这四种蛋白质是线粒体内呼吸链复合物I、III或V的组成成分。有氧呼吸是一种代谢途径，利用电子传输系统中电子传递产生的能量，产生ATP。在好氧呼吸过程中，电子可能从呼吸链中的各种配合物中泄漏出来，部分地将氧还原成超氧阴离子，而超氧阴离子是许多活性氧的前驱体。Westernblot检测NDUSF 3和ATP 5B在CD 16+单核细胞中的高表达。图6b)，与检测到的更多的胞内ATP相对应(图6c)。为了确定活性氧是否来源于有氧呼吸所致的线粒体，应用MitoSOX检测线粒体中的超氧物。CD 16+单核细胞在分离(0 Min)和分离后均比CD 16−单核细胞显示出更高的mtsox染色细胞百分比。离体培养30分钟(图6d)。这些数据证实，CD 16+单核细胞中检测到的超氧阴离子含量明显升高，确实来源于线粒体(图6a)。这意味着CD 16+单核细胞代谢活性的提高导致细胞内ROS的产生。

CD 16+单核细胞自发凋亡是氧化应激所致

CD 16+单核细胞内ROS生成增加，抗氧化基因表达降低，提示其可能正经历氧化应激。为了确定CD 16+单核细胞自发凋亡的增强是否是细胞内活性氧过量所致，对细胞进行了不同剂量的ROS处理。N-乙酰-半胱氨酸(NAC)或过氧化氢酶，以降低其氧化状态。NAC是一种补充细胞内GSH含量的硫醇肽，23过氧化氢酶是一种催化H水解的酶。2O2水和氧气。NAC或过氧化氢酶的加入导致CD 16+单核细胞凋亡细胞百分率呈剂量依赖性下降。图7a和bCD 16+单核细胞内ROS水平升高是其凋亡潜能增高的原因。

CD 16+单核细胞自发凋亡是由于氧化应激所致。条形图描述了在不同浓度过氧化氢酶存在或不存在不同浓度过氧化氢酶的情况下培养4h的离体单核细胞亚群中凋亡细胞的百分比。a)或NAC持续24小时(b)。所有显示的数据来自至少三个不同的独立实验，错误条代表S.E.M。***指示P<0.005 and *指示P<0.05

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本研究采用全局转录和蛋白质组学相结合的方法，研究了CD 16、−和CD 16+亚群之间的凋亡相关基因特征。CD 16+单核细胞具有较高的促凋亡基因表达、较低的抗氧化基因表达和较高的内源性ROS水平，从而表现出较高的自发凋亡倾向。虽然已知人单核细胞的自发凋亡，但这是关于单核细胞亚群差异自发凋亡潜能的首次报道。

单核细胞寿命相对较短，在没有细胞因子、微生物产物和粘附等外部存活信号的情况下，会发生自发凋亡。3, 24当单核细胞被处理时离体与促炎介质如肿瘤坏死因子α，IL-1βLPS可抑制其自发凋亡。2, 3 体内，CD 16+单核细胞在许多炎症条件下，如细菌脓毒症时优先增多，16溶血性尿毒症，25艾滋病毒感染，17其他急性和慢性感染，26心血管疾病27以及自身免疫紊乱。18, 19在这些病理条件下CD 16+单核细胞扩增的一个推测是提高这一亚群的存活率。埃勒里等人在HIV感染者和离体HIV优先存在于CD 16+单核细胞的研究。28来自hiv患者的感染单核细胞被发现具有抗凋亡基因的特征，且凋亡较少。20因为它们通过线粒体途径调节Bcl-2/Bax比值的增加。29

Fas-FasL相互作用与通过caspase依赖机制介导的单核细胞自发凋亡有关。5我们的研究表明，两种单核细胞亚群的凋亡都是caspase介导的，zVAD-fmk可以抑制细胞凋亡。图4a)。然而，在CD 16+单核细胞中，caspase 3和7活性明显升高，在培养过程中进一步增加。离体 (图4b)。CD 16+单核细胞的凋亡潜能不能通过Fas或TRAIL介导，因为Fas、TRAIL和TRAIL受体的表达低于CD 16−单核细胞。补充图3).

我们的数据表明，CD 16+单核细胞自发地产生更多的ROS，这是一种高度反应性的分子，有可能引起细胞损伤和凋亡。活性氧诱导的细胞凋亡在包括单核细胞在内的多种细胞类型中得到了广泛的证实。5, 30ros介导的细胞死亡涉及线粒体去极化，随后细胞色素等线粒体促凋亡因子的释放。c.31本研究表明，内源性ROS参与了CD 16+单核细胞凋亡的增强，NAC和过氧化氢酶对CD 16+单核细胞的凋亡率有明显的降低作用，而对CD 16−单核细胞的作用较小。图7a和b)。CD 16+单核细胞高氧呼吸所产生的内源性活性氧(ROS)，主要是超氧阴离子。线粒体产生的活性氧作为有氧呼吸的副产品，已被广泛报道.32内源性ROS，Bid和bax蛋白丰度较高，线粒体膜电位改变，胞浆细胞色素较高。c在CD 16+中，单核细胞共同支持通过线粒体介导的ROS依赖性细胞死亡。

与人类相似，老鼠中也有两种单核细胞亚群。13他们是CX3CR1loGr1+(Gr1+)和CX3CR1hiGr1−(Gr1−)单核细胞与人CD 16−和CD 16+单核细胞分别具有同源性。12, 33使用CX的几个研究3CR1缺陷小鼠报告，在没有cx信号传递的情况下，gr1−单核细胞不能在血液中持续存在。3CR112, 14, 15而抗凋亡基因Bcl-2在这些小鼠中的表达也明显降低。14, 15当bcl-2在cx中过度表达时3CR1缺乏的小鼠，Gr1−单核细胞的数量优先恢复，尽管这两个亚组的转基因水平相当。14因此，作者推测Gr1−细胞比Gr1+单核细胞更容易发生凋亡。15Bcl-2与Bax的比值可决定细胞的存活或死亡.34我们的数据显示CD 16+单核细胞表达bax和Bid的数量高于CD 16−单核细胞。图2e)，但这两个子集表达的Bcl-2水平相似(补充图4)，从而导致bcl-2/bax比值降低，提示Bcl-2/bax是一种更有利于凋亡的表型。

与CD 16+单核细胞相比，CD 16−单核细胞的抗氧化基因(如GPX 1和MGST 1)的高表达也表明CD 16细胞对氧化应激的抵抗力更强。GPX 1和MGST 1具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，并可能通过降低细胞内H来保护细胞免受氧化损伤。2O2以谷胱甘肽为底物的水平。35, 36CD 16−单核细胞中GPX 1或MGST 1表达的下调使其对H更敏感2O2-诱导细胞死亡。CD 16−单核细胞能够更好地抵抗氧化应激有两个可能的原因。首先，我们以前报道过CD 16−单核细胞在遇到病原体时会产生更多的ROS，21因此，应该更好地保护它们免受氧化剂介导的细胞死亡。其次，CD 16−单核细胞在其表面表达较高水平的G-CSF受体，并可能与中性粒细胞共同迁移，以响应G-CSF向炎症部位的反应。在炎症部位，它们可能通过表达较高的吞噬细胞受体(如CD 36、C1qR和CD 14)来清除凋亡的中性粒细胞(我们未公布的数据和赵教授)。等人21)。在这个过程中，他们还会遇到由活化的中性粒细胞产生的氧自由基。单核细胞亚群处理氧化应激的这种差异能力让人想起NK细胞亚群中的CD 56。明快CD 16−NK细胞对外源H诱导的细胞死亡有较强的抗性。2O2或由邻近的吞噬细胞，如活化的中性粒细胞。这是因为与CD 56相比，它们具有更高的抗氧化能力。昏暗CD 16+NK子集37

了解单核细胞凋亡在病理条件下对维持体内平衡至关重要。CD 16+单核细胞表达较高水平的促炎细胞因子，如TNFα并被称为“促炎”单核细胞(我们未公布的数据和Belge)。等人38)。在此，我们建议人类通过单核细胞亚群的差异凋亡来发展一个自我调节系统，在这种系统中，炎症性CD 16+细胞的数量是由其在稳定状态下的促凋亡倾向所控制的。在感染过程中，促炎症介质可增强CD 16+单核细胞的存活，使其能够控制感染。然而，一旦病情得到控制，促炎症介质水平下降，CD 16+单核细胞可能在没有生存信号的情况下死亡，使情况恢复到稳定状态。2然而，CD 16+单核细胞的扩增也可能对宿主有害，因为它们产生的大量促炎介质会导致组织损伤。因此，更好地了解单核细胞亚群差异凋亡潜能的机制，将使我们能够调节CD 16+亚群在病理条件下的存活率，从而促进其在有助于根除外来病原体的感染情况下的生存。

因此，我们的数据支持CD 16+单核细胞对ROS诱导的细胞凋亡具有选择性敏感性的模型，因为其抗氧化能力较低，内源性ROS的产生也明显高于CD 16−单核细胞。单核细胞凋亡的内在调控可能是调节CD 16+单核细胞亚群的一种机制。使用动物模型的进一步研究可能有助于更好地了解这些单核细胞亚群的差异凋亡潜能。体内设置。

抗体

流式细胞术的抗体为CD 16(3G8)(Biolegend，圣地亚哥，CA，美国)，CD 14(61D3)和细胞色素。c(6H2)(电子生物科学，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。西式吸墨画的Abs正在竞标，39ATP合酶β(10/ATP)，细胞色素c(7H8.2C12)，MnSOD(19/MnSOD)(BD，圣地亚哥，CA，美国)，bax(127606)，NADH脱氢酶(17D95)(圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，CA，美国)，GPX1(ABCAM，剑桥，MA，美国)，MGST 1(LS-C36495)(寿命周期生物科学，西雅图，美国华盛顿州)和肌动蛋白(LV 1435643)(Milli孔隙，Billerica，MA，美国)。

细胞

PBMC采用Ficoll-Hypaca密度梯度离心法从卫生科学管理局(新加坡)获得的Buffy外套中分离出来。CD 16−和CD 16+单核细胞亚群的分离采用CD 16单核细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，BergischGladbach，德国)。总之，在NK细胞和中性粒细胞磁耗后，CD 16+单核细胞用CD 16微球进行了纯化。用CD 14微球从阴性部分分离CD 16−单核细胞。用荧光活化细胞分选法(Fcs)分离单个核细胞，先用CD 14微球纯化单个核细胞，然后用荧光标记抗CD 14和抗CD 16抗体染色，然后按门控法进行分类。补充图1...用流式细胞仪检测获得的单核细胞亚群的纯度，用荧光标记的抗CD 14抗体和抗CD 16抗体进行检测。除蛋白质组学和转录组学实验外，还从不同供体获得了用于实验的样本。

治疗

为抑制细胞凋亡，细胞与20细胞共同孵育。μmpan-caspase抑制剂Z-vadfmk(美国明尼阿波利斯研发系统有限公司)在37℃下24小时用于过氧化氢(H)的测定。2O2)诱导细胞凋亡，用一定浓度的H处理细胞。2O2为抑制ROS，细胞在无血清的情况下用过氧化氢酶(CalBiochem，La Jolla，CA，USA)作用2h，在人血清存在下用NAC(CalBiochem)作用24h。

流式细胞术

细胞表面染色：4°C与细胞共孵育15 min，检测细胞色素。c水平，细胞内染色用固定和渗透试剂盒根据制造商的指示(EBioscience)进行。用荧光标记Annexin-V染色15 min，在流式细胞仪分析前加入-PRO 3，观察细胞凋亡情况。所有数据在FACSCalibur流式细胞仪(BD)上进行测量，并使用Flowjo软件进行分析(TreeStar Inc.，Ashland，OR，USA)。

利用Q星或LTQ-Orbitrapms进行蛋白质鉴定和定量

采用Q-STAR(应用生物系统；MDSSciex)进行蛋白质鉴定和定量。21对LTQ-OrbitRAP MS(热Finnign，圣何塞，CA，USA)进行了如前所述的分析.40简单地说，重组组分被注入Zorbax肽陷阱并在线脱盐(Agilent，Palo Alto，CA，USA)。肽分离采用国产纳米钻孔C18柱(75)进行。μMID×15厘米，5-μ(M粒子)具有微微颗粒的纳米祈祷尖端。LTq-轨道饶舌被设置为以正离子模式执行数据采集，所选质量范围为350-2000。m/z...在脉冲Q解离(PQD)和碰撞诱导解离(CID)两种情况下，从每组分中筛选出8个电荷最多的多肽，每部分500计数阈值以上的MS/MS，并以±5M.U动态排除20s。大规模容忍。PQD的设置为Q激活0.3，活化时间30 ms，碰撞能60%，CID的Q激活值为0.35，激活时间为30 ms，碰撞能为35%。

通过使用Mascot服务器对级联的目标-诱饵IPI人类数据库(2.2.1版)搜索数据，实现肽定量和蛋白质鉴定。两条缺失的乳沟是允许的。前体离子和MS/MS片段离子误差在下午30点以下。<0.8Da。只取大于30的多肽进行蛋白质鉴定和定量。对于这两个MS平台，所有报道的蛋白质至少应该有两个唯一的肽匹配与iTRAQ比率，其中至少一个匹配应该有一个期望值<0.05。该搜索的错误发现率(Decoy)也<1%。

RNA提取、实时PCR、Westernblotting和转录组数据分析

RNA提取、实时PCR、Westernblotting和转录组数据分析均如前所述。21对于实时聚合酶链反应，引物序列可在补充表3...在每次跑步中，为每个目标建立三重标记，并使用内务基因对结果进行归一化处理。18SrRNA

硅中生物和功能分析

我们用三种不同的方法来探讨不同表达的mRNA和蛋白质之间的功能关系：david(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)，MetaCore(GeneGo，https://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi)和IPA(http://www.ingenuity.com)。该清单被输入到每个平台，以确定不同单核细胞亚群之间的生物过程或途径。利用GEPAS对转录本和蛋白质的规范化表达水平进行监督聚类。http://www.gepas.org).

Caspase 3/7法

最多2×105在96孔板的每口井中加入细胞，并在5%的CO浓度下37°C下孵育一段时间。2孵化器。用caspase-glo法测定caspase 3/7的活性。*3/7检测试剂盒(Promega，Madison，WI，美国)根据制造商的指示，使用GloMax-Multi检测系统(Promega)检测发光强度。

线粒体膜电位的测定

线粒体膜电位用二极管(Dioc)测量。6(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，TMRM或JC-1(CalBiochem)。简而言之，1×106每毫升细胞与20纳米管孵育。6、200 NM TMRM或2μMJC-1在37°C下培养15 min，用PBS冲洗细胞，用流式细胞仪进行分析。

线粒体和胞浆组分的分离

亚细胞组分如前面所述被分离出来。39总共3×106细胞培养0，6和24 h，然后用271/2-G针头隔离缓冲液(200 mm蔗糖，20 mm蔗糖)破坏细胞。μm EGTA，5毫米琥珀酸酯，2μm鱼藤酮，1μG/ml寡霉素、20 mM Tris、20 mm HEPES和1mm KH2阿宝4，pH 7.2)。细胞匀浆在800×离心条件下离心。g4°C下取核10 min，取核不破细胞。上清液离心10 000×g经10 min，微丸为‘线粒体分数’，而上清液在10000×离心下进一步离心。g在4°C下培养60 min，得到“胞浆组分”。

细胞内ATP的测定

根据制造商的指示，使用ATP生物发光分析试剂盒(Sigma)测定细胞内ATP。在RT条件下，用0.1ml ATP试验混合液预处理反应小瓶3 min。然后，从3×10中提取0.1毫升的蛋白裂解液。6快速加入单核细胞亚群，并立即使用GloMax-Multi检测系统测量光量。ATP的生成与总蛋白浓度有关。

ROS测量

ROS测定：用10 mm DCFH-双乙酸、DHE、APF或米托索红(Invitrogen)处理15 min，用流式细胞仪检测。

siRNA敲除

针对GPX 1和MGST 1的siRNA序列以及对照siRNA均购自Invitrogen。转染根据制造商的建议使用脂质体2000 CD试剂(Invitrogen)。H型2O2分别转染siRNA后48h对细胞进行处理、实时PCR和westernblot分析。

GSH/GSSG法

GSH/GSSG比值的测定采用GSH/GSSG比值分析试剂盒(CalBiochem)，并对其进行小修改。

统计分析

数据用独立的两个样本进行统计分析。t-用SPSS软件进行单因素方差分析(SPSSInc.，芝加哥，美国).P<0.05 was considered significant.

ROS：

活性氧种类

GSH：

谷胱甘肽

H2O2:

过氧化氢

GPX1：

谷胱甘肽过氧化物1

MGST 1：

微粒体谷胱甘肽S-转移酶1

NAC：

N-乙酰半胱氨酸