细菌菌毛利用整联蛋白机制促进免疫激活和有效的血脑屏障渗透

B组链球菌(GBS)是新生儿脑膜炎的主要病因。细菌细胞表面附属物，被称为皮毛，最近被描述为链球菌病原体，包括GBS。毛尖粘附素PilA参与GBS对血脑屏障(BBB)内皮的粘附，但其宿主受体及其在中枢神经系统(CNS)发病机制中的作用尚不清楚。这里我们展示了PilA与胶原的结合，它促进了GBS与α的相互作用2β1在感染期间，整合素导致宿主趋化因子表达的激活和中性粒细胞的募集。感染缺乏PilA突变体的小鼠表现出延迟死亡率、中性粒细胞浸润减少和细菌CNS传播。我们发现，PILA介导的毒力依赖于中性粒细胞的内流，因为中性粒细胞的耗竭导致BBB通透性和GBS-BBB渗透降低。我们的结果表明，细菌毛，特别是PilA粘附素，在免疫激活和细菌进入中枢神经系统中具有双重作用。

细菌性脑膜炎是一种严重的中枢神经系统感染，是世界范围内死亡和致残的主要原因。无乳链球菌(B组)链球菌GBS是一种革兰氏阳性的细菌病原体，是导致新生儿脑膜炎的主要原因，并与老年人的侵袭性疾病有关。尽管孕妇采用了产前抗生素预防以防止GBS的传播，但新生儿死亡率仍然很高(10%)，25-50%的存活婴儿会出现永久性的神经后遗症，包括脑瘫、癫痫活动、耳聋和/或失明。1...GBS脑膜炎后的脑损害可能是由于细菌产品的毒性和(或)影响bbb功能的宿主炎症介质的激活而丧失血脑屏障(Bbb)完整性所致。2...人血脑屏障主要由一层专门的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)组成，是保护中枢神经系统免受微生物侵袭的重要屏障。推测GBS与hBMEC的相互作用是脑膜炎发病的第一步，细菌转运、内皮细胞损伤和炎症机制结合在一起破坏了bbb。3.

最近在gbs和其他链球菌病原体中发现了称为菌毛的细胞表面细胞器。4,5,6...菌毛是细菌表面的柔软附属物，已被证明参与了感染建立的基本事件，包括与宿主细胞的粘附、dna转移和生物膜形成。7...革兰氏阳性细菌的皮毛是由主要菌毛的共价连接单体与相关的小柔毛蛋白组成的骨架，这些蛋白被证明是粘附于多种宿主组织所必需的。8,9,10.

在gbs中编码菌毛的基因位于两个不同的位点上，分别命名为菌毛岛1和2(pi-1和pi-2)，pi-2有两个变体：pi-2a和pi-2b。11...这两个岛的基因结构相似，包括三个编码lpxtg基序蛋白的基因，它们对应于主要的菌毛亚基(PilB)，两个辅助蛋白(Pila和Pilc)，以及两个编码与毛组装有关的转肽酶酶(Sortase)的基因。12...所有临床分离的gbs至少携带两个柱状岛中的一个。13...我们曾证明GBS临床分离物NCTC 10/84(血清型V型)表达皮毛，并且PILA参与GBS对脑内皮的粘附作用。8...然而，宿主细胞受体的同一性和GBS菌毛在中枢神经系统疾病发病中的作用尚不清楚。

在本研究中，我们用gbs等基因Δ检测了脑内皮细胞对感染的基因表达谱。皮拉突变体采用微阵列、实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质分析。我们的研究表明，BBB内皮细胞对GBS PilA有功能基因表达，从而促进急性细菌性脑膜炎的特征性中性粒细胞炎症反应。我们还证明，PilA与胶原直接相互作用，参与整合素和整合素信号机制，这在脑膜炎的发病机制中起着重要作用。体内.

GBS PilA诱导脑内皮细胞趋化因子表达

我们曾证明，bbb内皮细胞在启动对gbs感染的特异性天然免疫反应、促进中性粒细胞活化和募集方面具有积极作用。3,14...在本研究中，与wt gbs感染相比，hbmec在gbs PilA缺陷突变体感染过程中的cxc家族白细胞介素8、cxcl-1和cxcl-2以及ccl-20和IL-6的表达明显降低(补充表S1)。这些结果在独立的实验中得到了证实。图1A)，进一步提示hBMEC转录反应受PilA介导的相互作用的影响。

(a)hbmec感染黑棒或等基因突变体Δ后4h内趋化因子IL-8、IL-6、CxCL 1、CXCL 2和CCL 20的实时RT-PCR分析。SRR-1(灰条)和Δ皮拉(白酒吧)。转录水平归一化为GAPDH，折叠变化按方法描述，用双向方差分析(Bonferroni检验)进行统计分析。(b)hBMEC分泌IL-8对GBS WT株(黑条)和等基因Δ感染的影响皮拉变种人(白条)感染后4h收集的hBMEC上清液中IL-8浓度采用ELISA、双向方差分析(Bonferroni检验)；**P<0.005; ***P<0.001. (c)用不同GBS血清型的PilA-GST融合蛋白及对照GST蛋白(0.5μM)处理4h后IL-8的转录水平。大肠杆菌内毒素(0.3纳克毫升)−1)。如方法所述，用PilA-GST融合蛋白和GST控制蛋白制剂中检测的内毒素量处理细胞；用单向方差分析(Tukey‘s多重比较检验)对细胞进行统计学分析。所有实验在三层三层的井中进行了三次，杆表示一个典型实验的平均值的标准差，**P<0.005; ***P<0.001. (d–f纯化的PilA-GST蛋白与hBMEC结合。用PilA-GST(d)或一般事务费(f)用抗PilA抗血清或抗GSTAb进行检测。细胞核被DAPI染色。放大框的面积d‘显示在’e“”刻度棒，20μm。

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这个皮拉编码于PI-2a中的基因与携带该位点的GBS菌株高度同源(~89%的同源性)。为了研究PilA蛋白在GBS脑膜炎相关的其他GBS血清型中的作用，我们构建了皮拉GBS菌株NEM 316(Ⅲ型)和515株(1a型)补充图S1a)。Δ与WT的生长动力学及溶血活性无明显差异。皮拉突变株(补充图S1b，c)。与我们的微阵列分析相一致的是，与wt亲本菌株相比，与wt亲本菌株相比，受PilA缺陷株感染导致的IL-8蛋白分泌减少。图1B)。Δ的互补性皮拉完整突变体皮拉基因使hBMEC IL-8分泌恢复到WT GBS感染时的水平(补充图S1d).

Pila促进IL-8分泌和中性粒细胞趋化

接下来，我们试图用纯化的重组PilA来确定GBS PilA是否足以诱导IL-8。从几株血清型菌株中分离到的pila蛋白以氨基末端gst标记融合蛋白(补充图S2A)。纯化后，所有蛋白质，包括gst蛋白控制，都含有较低的内毒素水平(3 EU毫升)。−1或0.3纳克毫升−1)。用PilA-GST蛋白处理hBMEC能显著诱导IL-8的转录(图1c)。我们还观察到与hBMEC直接结合的PilA蛋白与GST对照蛋白(图1D-f)。我们用皮肤进一步分析了中性粒细胞在感染部位的吸收情况。体内中性粒细胞招募试验，如前所述15...中性粒细胞酶髓过氧化物酶(MPO)，是中性粒细胞浸润的有效指标。16，在感染Δ后明显降低。皮拉突变株与WT菌株比较图2A)。这种增加的中性粒细胞的吸收与组织中的细菌数量无关，因为wt和Δ都从皮肤中恢复了类似的细菌集落形成单位(Cfu)。皮拉在这些条件下突变(图2B)。同样的结果被观察到在评估多形性核(PMN)细胞招募直接在中枢神经系统。Δ注射小鼠皮拉突变体pmN浸润量明显低于接种wtgbs(图2c-h)。这些结果表明，GBS PilA促进了IL-8的分泌和功能性中性粒细胞信号通路。体内在活动性GBS感染过程中，导致中性粒细胞增多。

(a) 体内通过测定小鼠(CD1，男性，n(每组8例)感染后4h皮肤匀浆用WT-GBS(黑色方块)或Δ皮拉突变体(红色方块)用1×10皮下注射法对小鼠皮肤匀浆进行MPO检测。6wtgbs或Δ的cfu皮拉突变株(b)在托德-休伊特肉汤琼脂平板上进行连续倍稀释法测定皮肤匀浆中细菌的数量。实验进行了两次，给出了一个有代表性的实验。BAR代表平均MPO水平或细菌CFU，统计分析用学生的t-试验；**P<0.005; NS, non-significant. (c–h)在5日龄小鼠直接颅内注射后，对CNS中嗜中性粒细胞的吸收情况进行了评估。n(每组4例)接种WT、GBS或Δ后8~10h。皮拉变种人。两个独立实验的代表性大脑图像显示在两只老鼠身上。c–e)感染WT(同一只老鼠在c,d)和两只老鼠(f–h)感染Δ皮拉突变体(同一只老鼠f,g)。苏木精和伊红染色脑切片(H&E)(c,f)描述在WT感染期间脑膜增厚的情况(c用FITC-抗Ly6G抗体免疫组织化学检测PMN浸润。d,e,g,h)。刻度棒，20μm。

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胶原蛋白促进PilA-BBB相互作用

GBS PilA序列分析及与近期晶体结构的比较17揭示了几个不同的区域，包括两个类似cna-B的结构域，它们类似于金黄色葡萄球菌粘附素18，以及一个类似于人vonWillebrand因子a3结构域的整合素i样结构域，该分子与胶原相互作用。19...因为最近的一份报告显示PilavonWillebrand因子区域赋予宿主细胞粘附的特性20我们进一步推测，这可能包括PilA介导的与胶原的结合。我们首先观察到，在Δ中，与固定的I型胶原的结合受到损害。皮拉突变型(图3A)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测纯化的PilA-gst蛋白与I型胶原的直接结合，观察到PilA蛋白与胶原结合的剂量依赖性增加，而不是GST对照。图3B)。当gbs被大量的胶原蛋白孵育时，我们观察到wtgbs的细菌附着和内化增加，而不是Δ。皮拉突变株(图3C d; 补充图S2B，c)。此外，与bsa或gst包覆的微珠相比，在胶原存在的情况下，PilA包覆的乳胶珠与hBMEC的结合更为丰富。图3e)。这些结果提示胶原促进PilA-hBMEC相互作用。

(a)WT-GBS与Δ的结合皮拉用结晶紫染色法鉴定固定化胶原的突变体。在595 nm处测定吸附菌释放的色素。学生的t-测试。(b用ELISA法测定重组PilA蛋白与I型胶原或BSA的剂量依赖性结合，并与GST对照蛋白进行比较。遵守(c)和入侵(d)的Δ(黑色条形图)皮拉突变体(白条)在胶原I含量增加的情况下，用指示浓度的可溶性胶原预孵育，用抗生素保护试验测定细菌对hBMEC的粘附能力和侵袭能力。数据是报告的百分比，粘附或细胞内细菌相对于输入接种。所有实验三次，一式三份，棒状代表一个典型实验的均值和标准偏差。统计分析用学生的t-测试(a)或单因素方差分析与Tukey的多重比较检验(所有其他实验)(*P<0.05; **P<0.005; ***P<0.001. (e)在胶原或BSA存在下与hBMEC结合的PilA-GST、GST或BSA乳胶珠的相位对比图像。细胞被广泛地用PBS清洗，移除任何未结合或松散结合的珠子，并用蔡司Axiovert 200倒置显微镜(卡尔蔡司)观察。箭头表示hBMEC表面的珠子。刻度棒，20μm。

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α的作用2β1整合素和FAK信号在BBB激活中的作用

胶原等细胞外基质蛋白通常与细胞表面整合素相互作用，启动下游信号级联，而下游信号级联是通过整合素介导信号的核心--粘着斑激酶(Afk)介导的。21...如图所示图4a共聚焦显微镜观察到PILA-GST-乳胶珠与FAK在聚焦点粘附位点的共定位.这导致我们研究整合素是否存在于局灶性粘附位点，是否作为PilA的宿主受体。细胞通常表达两种主要的胶原结合整合素：α1β1和α2β1(参考文献)22)。以前的整合素分析显示hbmec只表达α。2和β1整合素23...当α2β1或β1用相应的功能阻断单克隆抗体阻断整合素，我们观察到与同型对照抗体相比，wtgbs粘附和侵袭明显减少。图4B; 补充图S3A，b)。Δ的依从性和侵袭性没有明显的变化。皮拉突变株，表明α2β1PILA介导的GBS穿透BBB内皮细胞需要整合素。有趣的是，hbmec对wtgbs感染的IL-8分泌在两种α的存在下也明显减少。2β1或β1整合素功能阻断单克隆抗体(图4c; 补充图S3c)。此外，正如方法中所描述的，我们删除了β的表达式。1短发夹RNA在hBMEC中的整合素(英文)补充图S3D)。在β中，细菌入侵以及wtgbs感染时的IL-8分泌明显减少。1整合素敲除hBMEC细胞与转染shRNA的细胞比较(图4d e)。最后，我们观察到Pila-gst与β的结合显著减少。1整合素敲除hbmec细胞和抗α细胞2β1单克隆抗体与转染shRNA的细胞比较补充图S3E-g)。这些结果进一步提示整合素α2β1作为GBS PilA的受体。

(a用共聚焦显微镜观察了聚乳酸乳胶珠与FAK的共定位。用抗PilA抗血清(绿色)染色，FAK用抗FAK单克隆抗体(红色)染色，核用to-Pro(蓝色)染色。标尺，100μm.对GBS内化的抑制(b)和IL-8分泌(c)α预处理后的hBMEC。2β1整合素功能阻断单克隆抗体与同类型对照抗体比较。GBS渗透(d)和IL-8的释放(e)在β中1用靶向β的shRNA敲除hBMEC细胞1整合素RNA(hBMECΔβ)1)或控制的shRNA(混乱的shRNA)。细菌侵袭用抗生素保护法测定，IL-8分泌用ELISA法测定.黑条表示WT gbs，白条表示Δ。皮拉变种人。所有实验三次，一式三份，条形图表示一次代表性实验平均值的标准差。采用单因素方差分析(Tukey‘s多重比较检验)进行统计分析；*P<0.05; **P<0.005; ***P<0.001; NS, non-significant.

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非受体β定位1整合素并在整合素启动的信号过程中被激活21...在此之前，FAK的磷酸化被证明是gbs血清型Ⅲ型菌株入侵hBMEC的关键。24...我们同样表明，在wtgbs感染过程中，afk以及akt和erk 1/2被磷酸化，而在Δ感染期间则观察到少量到无磷酸化。皮拉同一时期的突变体(图5A)。为了进一步研究FAK对PilA介导的细胞侵袭和IL-8分泌的影响，hBMECs转染了不含活性激酶结构域的羧基末端截短的fk-衍生物fnk(fak-relatednon-kinase)，并在hbmec(frnk/hbmec)中过度表达时充当主导的阴性形式。25...我们没有观察到不同细胞株在wtgbs或Δ感染期间细菌粘附的变化。皮拉突变型(图5b)。然而，我们确实观察到与WT FAK对照组相比，FRNK/hBMEC细胞在WT GBS感染过程中细胞侵袭和分泌减少。图5C d)。为了研究PILA介导的IL-8分泌是否需要细菌侵袭本身，我们使用细胞松弛素D来阻断GBS感染时hBMEC中肌动蛋白的聚合。这种治疗以一种剂量依赖性的方式抑制细菌的内化，但并没有导致细菌粘附或PilA介导的IL-8分泌减少。补充图S4)。综上所述，这些结果证实了gbs对脑内皮细胞的侵袭并不是IL-8分泌的先决条件，并暗示prA介导了α的参与。2β1整合素启动FAK信号事件，导致趋化因子分泌和细菌渗透。

(a)检测tt gbs和Δ感染不同阶段hbmec裂解液中FAK(Tyr-397)、Akt(Ser-473)和ERK 1/2(Tyr-204)的磷酸化形式以及非磷酸化形式。皮拉变种人。在指定的时间点感染细胞，用各自的抗体对收集到的细胞裂解物进行检测。遵守(b)，入侵(c)和IL-8的分泌。d)FRNK/hBMEC与FAK-WT/hBMEC相比，感染WT-GBS(黑棒)或Δ皮拉变种人(白条)转染hBMECs C末端截短的FAK衍生物FRnk(FAK相关的非激酶)，当ffnk/hBMEC过表达时，ffk/hBMEC以显性阴性形式存在。细菌入侵e,g)和IL-8在hBMEC中的分泌(f,h)感染WT-GBS(黑条)或Δ皮拉PI3K抑制剂LY 294002存在的突变体(白条)e,f)或MEK 1/2抑制剂U 0126(g,h)。所有实验以三份一式三次进行，以标准偏差表示平均值。采用单因素方差分析(Tukey‘s多重比较检验)进行统计分析；*P<0.05; ***P<0.001; ns: non-significant. KC levels (i)和MPO活动(j)小鼠(n(每组8例)皮下注射wtgbs(黑色方块)或Δ后4h皮肤匀浆。皮拉突变体(红色方块)细菌注射前2h，小鼠皮下注射1mg kg。−1以U 0126、LY 294002或DMSO作为对照。实验进行了两次，棒代表了一个典型实验的均值和标准偏差。所有实验均采用单因素方差分析(Tukey‘s多重比较检验)；*P<0.05; **P<0.005; ***P<0.001; NS, non significant.

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我们进一步研究了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和MAP激酶ERK 1/2通路(FAK下游信号)在PilA介导的免疫激活和细胞侵袭中的作用。LY 294002抑制PI3K活性，在不影响IL-8分泌的情况下，可显著减少细菌的侵袭。图5e，f)。相比之下，ERK 1/2通路抑制剂U 0126处理细胞后，IL-8的释放急剧下降(85%)，而不影响细胞的侵袭过程。图5g，h)。我们还分析了这些抑制剂对趋化因子分泌和中性粒细胞趋化性的影响。体内通过测量KC(功能性小鼠IL-8的同系物)和MPO的水平，如上文所述。经U 0126治疗后，在WT GBS感染部位观察到KC水平明显降低，随后中性粒细胞增多(图5i，j)。用PI3K抑制剂LY 294002或感染Δ时进行类似治疗，无显着性差异(P>0.05)。皮拉变种人。总的来说，这些研究表明PilA介导的细菌入侵和诱导趋化因子信号通路在FAK下游可能是独立的。

Pila在脑膜炎发病机制中的作用体内

PILA在GBS CNS感染发病机制中的作用体内，我们采用小鼠GBS血源性脑膜炎模型，如前所述。3,26...小鼠(8周，CD-1雄性)静脉注射wtgbs或Δ。皮拉变种人。所有wtgbs感染的小鼠在54小时后死亡，而所有Δ则需时148小时。皮拉被感染的老鼠会屈服于感染。wtgbs感染小鼠的中位生存期明显低于Δ小鼠。皮拉突变型感染小鼠(P=0.036，对数等级测试)(图6a)。在一个类似的单独实验中，小鼠感染了WT gbs或Δ。皮拉突变体，24小时后处死，评估细菌向大脑的传播情况。各组小鼠血液和脾脏中GBS水平基本相同，而Δ中细菌脑负荷基本相同。皮拉-感染小鼠明显低于WT感染小鼠(图6B)。同时，与Δ相比，WT感染小鼠脑内cfu的恢复相对于血流有显著的提高。皮拉突变型(图6c)。RT-PCR分析显示感染Δ的小鼠皮拉突变体与WT-GBS感染小鼠相比，KC的转录水平降低(P<0.05)。图6d)。所有感染wtgbs动物的脑组织切片组织学分析显示脑膜炎的典型特征是脑膜增厚，大量炎症细胞，特别是中性粒细胞大量涌入，以及在感染Δ的动物中罕见或不存在的大量出血。皮拉突变株(补充图S5)。典型小鼠感染WT和Δ的图像皮拉突变体，或pbs注射后，显示在图6e-j...免疫组织化学方法观察到脑膜中有WT GBS的存在，而PilA缺乏的菌株很少出现(P<0.05)。图6k-n)。在一个单独的实验中，我们评估了细菌负荷和趋化因子在多个组织中的表达，以及在WT和Δ感染期间的脑病理学。皮拉随着时间的推移而变异。一般来说，在所有时间点测试，甚至在死亡时，小鼠感染了Δ。皮拉突变体在脑组织中的炎症浸润和坏死损伤明显少于WT GBS感染组(补充图S6)。与我们以前的实验相一致，在感染WT株的小鼠脑和肺中观察到更多的细菌CFU和KC的表达。补充图S7)。得到了类似的结果。离体宫颈上皮细胞(HeLa)和肺上皮细胞系(A 549)补充图S8)证明PilA对这些不同细胞类型的粘附和趋化因子诱导均有促进作用。

(a腹腔注射后小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。注入WTGBS(黑面积)或Δ皮拉突变体(红色方块)CD-1雄性小鼠组(n(每组10例)静脉注射7×10。7一段时间内监测细菌的CFU和存活情况，并使用对数秩检验进行分析；*P<0.05. Bacterial counts in the blood, spleen, brain (cfu per ml or cfu per g of tissue) (b)以及脑和血液中细菌计数的比率(c)24h。小鼠注射(n=每组8)，无论是WT GBS还是Δ皮拉变种人。(d)用rt-PCR定量方法检测小鼠脑组织中wtgbs或Δ感染后表达的趋化因子kc的转录强度。皮拉突变24 h后，将转录水平归一化为β-actin，并与单纯注射PBS的小鼠比较，表达为皱襞变化。实验进行了两次，条形图表示一个典型实验平均值的标准差。统计分析用学生的t-测试；*P<0.05; NS, non significant. Histopathology of brain tissues of representative individual mice infected with WT GBS (e–h)与PBS治疗(i)，或感染Δ皮拉突变型(j)。扩大箱形面积e和g显示在f和h分别描述脑膜增厚和中性粒细胞浸润。(k–n)。WT-GBS感染小鼠脑组织中GBS的免疫组织化学检测(英文)k,m)或Δ皮拉突变型(l,n)。用单克隆抗gbs抗体标记细菌，用与HRP结合的抗小鼠二次抗体检测，并与苏木精反染色(k–l)。用免疫荧光法观察GBS，并与AlexaFluor 488(绿色)偶联。血管用抗层粘连蛋白抗体(红色)染色，细胞核用to-Pro(蓝色)染色。m,n)。刻度棒，20μm。

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中性粒细胞在GBS脑膜炎中的作用

我们观察到WT-GBS感染小鼠具有较高水平的趋化因子KC，以及大量的白细胞浸润，尤其是中性粒细胞，因此我们研究了中性粒细胞对BBB通透性和GBS脑膜炎进展的影响。用单克隆抗体RB6-8C5使小鼠产生中性粒细胞(参考文献)。27)在静脉注射前(i.v.)我们在实验过程中观察到了持续的中性粒细胞减少。补充图中9)。大约45%的RB6-8C5处理过的动物在感染后24小时内死亡，可能是由于感染性休克。与同型对照抗体相比，中性粒细胞癌小鼠的体温下降，血液和肺细菌负荷增加，血清、脾和肺中与脓毒症相关的细胞因子(IL-1β和IL-6)水平升高。补充图S10A-h)。有趣的是，rb6-8c5处理后的小鼠在最初的脓毒症中存活时间更长，而且在大脑中的细菌计数也比对照组低。图7a-c)。脓毒症存活后，中性粒细胞增多小鼠的中位生存期高于对照组(61对46h)。这些结果提示中性粒细胞减少可能在GBS中枢神经系统疾病中具有生存优势。我们接下来用伊文思蓝(EB)染料外渗法检测脑内皮细胞的通透性。28...用PBS、RB6-8C5或等型对照抗体免疫小鼠。注射PBS(对PBS处理的小鼠)或WT GBS(对Ab处理的小鼠)。感染后24h处死小鼠。EB注射液(100μl，2%，w/v)。与rb6-8c5或pbs处理的非感染小鼠相比，从同型对照抗体处理的小鼠恢复过来的大脑明显更蓝。图7D)。与中性粒细胞或pbs处理的小鼠相比，对照Ab处理的小鼠脑内EB浸出量明显增加(P<0.05)。图7e)。Δ感染24h后脑内细菌负荷及血脑屏障通透性的测定皮拉突变体在中性粒细胞消耗和同类型对照抗体处理的小鼠中相似。补充图S10i，j)。在另一个实验中，我们还使用fITC-白蛋白作为示踪剂来评估bbb的渗透性。29...我们同样观察到用同型对照抗体治疗的小鼠在GBS感染时脑实质内血管的普遍漏出，与单独使用RB6-8C5Ab或PBS的动物相比，差异有显着性(P<0.01)。图7F-i).

(a腹腔注射后小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。7×10注射7加拿大广播公司的CFU。CD-1雄性小鼠在细菌攻击前24小时(n每组10例，腹腔注射中性粒细胞耗竭抗体50μg、黑方Rb6-8C5和同型对照抗体(红方块)各50μg。在一周的时间里，每天至少监测两次患者的生存情况，并用对数秩检验对数据进行分析；P=0.07。血液、脑中的细菌计数(b)和细菌计数与血液的比率(c)24h。WT-GBS注射液。(d)小鼠大脑的图片。杀灭前1h注射EB染料。(eBBB通透性反映在EB染料向中枢神经系统的渗出量。用60%TCA处理脑组织，提取EB，在610 nm处测定吸光度。EB染色的血管通透性用标准曲线表示为每克脑组织EB的μg。实验进行了两次，条形图表示一个典型实验平均值的标准差。统计分析用学生的t-测试；*P<0.05; **P<0.005; ***P<0.001; NS, non significant. (f–i)血脑屏障的通透性表现为FITC-白蛋白(10毫升千克)的外渗。−1)注射静脉注射。在杀人前30分钟。代表小鼠的大脑仅在PBS治疗后显示(f)，用RB6-8C5Ab治疗后感染WT GBS(g)或对照IgG(h,i)。箭头表示大脑中染料渗漏的区域。刻度棒，20μm。

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GBS脑膜炎的发病机制包括血液传播和侵入BBB进入中枢神经系统；然而，细菌离开血液进入中枢神经系统的确切机制仍未阐明。本研究报告，在急性细菌性脑膜炎中，PILA介导GBS附着于脑内皮细胞，通过促进特异性中性粒细胞浸润而促进毒性作用。我们进一步证明，PilA结合细胞外基质成分胶原，然后与α结合2β1脑内皮细胞整合素对细菌粘附和促炎趋化因子的释放具有双重促进作用。中性粒细胞浸润增加与BBB通透性增加和细菌CNS穿透性增高有关。体内 (图8)。因此，PilA-BBB相互作用很可能是导致疾病进展的早期分子事件之一，对宿主有害。

(1)PilA与细胞外基质成分胶原结合，然后与α结合2β1脑内皮细胞整合素。(2)这导致FAK的激活和随后的细胞内信号。(3)PI3K信号通路导致肌动蛋白重排和细菌摄取。(4)MEK 1/2和ERK 1/2激活的平行信号通路可导致IL-8的分泌。(5)这进一步导致功能性中性粒细胞趋化和活化。(6)中性粒细胞浸润增加会损害血脑屏障，导致血脑屏障通透性增加，这很可能促进细菌进一步从血液流向中枢神经系统。

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BBB主要由一层专门的脑微血管内皮细胞组成，它分离大脑及其周围组织，维持正常脑功能所需的生化条件。30...细菌成分与血脑屏障的相互作用是血脑屏障贯通发病的中心事件，也是严重脑膜炎发展的先决条件，是脑膜炎的标志。促进细菌与脑内皮细胞相互作用的GBS因子包括脂质体酸。31，β-溶血素/细胞溶解素(β-h/c)3柔毛8，富含丝氨酸的重复糖蛋白(SRR-1)26纤维蛋白原结合蛋白32，层粘连蛋白33最近一种高毒力的GBS粘附素34...这些细胞表面相关因子大多直接促进GBS在包括hBMEC在内的不同宿主细胞中的附着和/或侵袭。我们先前已经证明，在hbmec感染过程中，缺乏锚定脂质体酸的gbs突变体诱导的IL-8表达水平与wt gbs株相当。31...在此，我们同样证明了GBS表面粘附素/侵入素SRR-1对细胞因子/趋化因子的诱导没有贡献。补充表S1)，表明细菌粘附/侵袭的减少并不是感染期间所观察到的基因转录普遍下降的唯一原因。

我们以前已经证明，gbs感染hbmec会导致促炎细胞因子和趋化因子的上调，这些细胞因子和趋化因子对中性粒细胞的合成和活化起着重要作用，这主要是由于主要的细胞毒力因子β-h/c所致。3,14...与WT GBS相比，与WT-GBS相比，PILA缺乏突变体的感染导致关键中性粒细胞CXC趋化因子的基因诱导和分泌明显减少，且中性粒细胞对感染部位的趋化作用明显减弱。我们推测，由于毛皮是长丝状细胞器，远离细菌表面，毛介导的接触可能是GBS-bbb接触的重要第一步，此后，β-h/c毒素等其他毒力因子可能会导致疾病的进展。我们的研究结果表明，GBS蛋白参与宿主的促炎反应，这一结果与其他致病菌的研究结果是一致的。结果发现，肺炎球菌在全身感染过程中引起的肿瘤坏死因子α反应高于非肺炎球菌。5...类似地，泌尿系的Ⅰ型毛(P质毛)大肠杆菌已被证明能刺激尿路粘膜中IL-8的释放。35.

Pila介导的胶原结合增强了GBS的附着，并以剂量依赖性的方式摄取到hBMEC。我们的结果与其他研究结果一致。RrgA是GBS PilA的肺炎球菌同系物，与包括胶原在内的多种ECM蛋白结合。36，以及A组的微柔毛蛋白CPA链球菌(气体)具有胶原结合能力。37...RrgA与GBS的高度同源性(同源性水平~50%，相似性水平在70%以上)表明这些蛋白质的三维折叠可能是高度相似的，提示菌毛成分可能参与了病原体进入和炎症诱导的一般机制。

许多致病菌利用整合素介导的信号进入宿主细胞。38,39...这里我们证明了PilA和α之间的相互作用2β1BBB内皮细胞整合素可能导致FAK激活，启动信号通路，导致细菌内化和促炎症细胞因子释放，从而导致功能性中性粒细胞趋化和疾病进展。只有少数报告表明，其他细菌病原体采用类似策略的复杂因素。这些包括与α相互作用的口腔链球菌蛋白I/IIF。5β1整合素40，和雅达入侵的.假结核耶尔森菌外膜蛋白脑膜炎奈瑟菌，两者都将纤维连接蛋白与β锚定在一起。1整合素导致细菌摄取和分泌IL-8。41,42,43.

考虑到整合素优先定位于极化内皮的基底外侧表面。44，我们认为gbs与bbb的这些早期分子相互作用可能会改变细胞极性，正如人们所描述的。幽门螺杆菌45...这也证明gbs能够跨越上皮细胞屏障，在那里细菌与连接蛋白复合物共同定位。46...这些相互作用是否会破坏紧密连接蛋白，并导致蛋白质在BBB质膜上的非极化分布仍有待研究。

我们的离体结果得到证实体内在GBS血源性脑膜炎小鼠模型中。PILA缺乏突变株感染可导致小鼠延迟死亡，减少中性粒细胞浸润，减少CNS的传播，减少小鼠CXC趋化因子KC的表达。WT-GBS感染小鼠脑组织病理学分析显示脑膜炎的典型特征是脑膜增厚，大量炎症细胞大量涌入，特别是中性粒细胞大量涌入，脑组织损伤。在疾病进展过程中，WT和Δ的细菌负荷和Kc水平也有显着性差异。皮拉突变型感染动物仅见于脑、肺等典型GBS感染部位，而肝、肾、脾等其他组织无明显差异(P>0.05)。补充图S7)。因此，其他因素可能导致GBS CNS取向。Pila介导的毒力也依赖于中性粒细胞的流入。我们的结果表明，外周血中性粒细胞的减少在GBS感染的后期给予生存好处。中性粒细胞减少还伴随着细菌脑负荷和血脑屏障通透性的降低。虽然一些研究表明中性粒细胞的减少对宿主在细菌感染过程中是有害的。47,48,49,50，其他人观察到pmn耗竭会延长宿主在感染后的存活时间。51,52,53...我们的研究结果显示了血脑屏障通透性和中枢神经系统GBS通透性增加之间的联系，提示PMN介导的BBB损伤在GBS脑膜炎的发病机制中起着重要作用。

总之，我们的发现表明，GBS皮毛劫持了整合素机制的炎症激活脑内皮和随后的细菌中枢神经系统的进入。这些早期分子事件引发的局部炎症导致血脑屏障通透性增加，并促进细菌从血液流向中枢神经系统的免疫特权部位。据我们所知，这是第一个报告，描述了毛毛在中枢神经系统疾病的发病机制和双重作用，以及中性粒细胞浸润在GBS脑膜炎中的有害作用。虽然目前还没有针对gbs感染的疫苗，但最近的报告已经确定了gbs菌毛成分，特别是PilA，因为它在不同菌株之间高度保守，是潜在的候选疫苗。54...因此，我们的研究提供了进一步的机械洞察力的贡献，皮毛成分在GBS疾病的发病机制。

细菌菌株

无乳链球菌(GBS)血清型V株NCTC 10/84及其等基因Δ皮拉用氯霉素抗性盒取代框内等位基因所产生的突变体8主要用于实验。突变皮拉其他GBS血清型(血清型IA株515和Ⅲ型毒株NEM 316)的基因是通过插入重复诱变产生的。简单地说，部分皮拉采用以下引物进行PCR扩增：PilA(F)：GTTTGTCGCATACCGCTTA和PilA(R)：CATTACTCTTG，pHY 304克隆。重组质粒转化后，在红霉素选择板上筛选插入突变体。皮拉用抗PilA抗体对整个细菌裂解物进行Westernblotting分析，证实了该基因的缺失.用于补充研究，全长皮拉利用KpnI-PilA(F)：5‘-AGTCGTACCAGAAAATA-3’；BglII-PilA(R)：5‘-ATGATAATCTTTTTC-3’引物扩增基因，并在pDCErm中克隆。Δ皮拉用重组质粒转化突变株，产生互补菌株。WT，Δ皮拉在37°C.托德-休伊特肉汤中培养突变体和补体GBS菌株。红霉素浓度为5μg ml。−1在需要时加入到培养基中。

细胞株及感染检测

人脑微血管内皮细胞系由约翰·霍普金斯大学(Kwang Sik Kim，Johns Hopkins University)提供，在含有10%FBS、10%Nuserum和1%非必需氨基酸的RPMI 1640中培养。3,31...稳定表达靶向β的shRNA的hBMECs1整合素(hBMECΔβ)1)或表达对照shRNA的细胞通过转染产生(SantaCruz生物技术)。整合素β的敲除1采用标准流式细胞仪(FACS；BD生物科学)进行验证。据报道，FAK-WT/hBMEC和frnk/hBMEC细胞生长。25...基因芯片分析、细胞因子分泌、细菌粘附和侵袭等感染检测方法已被描述。3,31...细菌粘附和入侵计算为(回收CFU/初始接种CFU)×100%。为了抑制研究，细胞被预先处理30分钟，用指示数量的细胞松弛素D，LY 294002和U 0126，或10μg ml。−1抗整合素β1或反α2β1整合素抗体与细菌孵育前。

RT-PCR和ELISA

按标准程序进行RNA提取、cDNA制备和定量PCR。较早报道了IL-6、IL-8、cxcl 1、cxcl 2、ccl 20、kc和β-actin的引物序列和引物效率。15,55...用相对基因表达=靶基因效率×(CT对照−CT样本)/β-actin或GAPDH×(CT对照−CT样本)计算相对基因表达。ELISA法测定hBMEC上清液和小鼠组织匀浆中IL-8、KC、IL-1β和IL-6的浓度。

微阵列分析

用SentrixHuman-8表达微芯片(Illumina)进行微阵列实验。使用一种用于高密度寡核苷酸阵列的统计算法对数据进行了分析。56...微阵列数据已在EMBL-EBI中以登录码保存在EMBL-EBI中。E-MTAB-765.

Pila-GST的纯化及抗血清的产生

皮拉利用SALI-PilA-F(5‘-ATGCAGTCGACCGTAGGAAAAT-3’)、Noti-PilA-R(5‘-ATGCAGCGGCCGCTTCCTTGTGGAATA-3’)引物，从不同GBS株(血清型IA、III和V)的基因组DNA中扩增出基因，并在pGEX4T-2(GE HealthScience)中克隆。大肠杆菌在25℃培养BL 21(DE3)细胞，用1mM IPTG诱导表达8h，用谷胱甘肽-Sepharose(GE HealthScience)柱层析纯化GST-PilA蛋白。收集到的馏分用阿米孔超离心装置(Milli孔隙)浓缩，在PBS中用PD 10柱交换缓冲液(GE HealthScience)。同样，纯化的GST作为一种控制蛋白。用ToxinEraser内毒素清除试剂盒(Genscript)使蛋白质无内毒素，用ToxinSensenschromogenicLal内毒素检测试剂盒(Genscript)定量内毒素量。用PilA-(His)免疫新西兰白兔制备抗PilA血清。6蛋白质制剂与弗氏完全佐剂混合(太平洋免疫学)。ELISA法检测抗血清的特异性。

抑制剂和抗体

抗体和抑制剂：兔抗FAK，单克隆抗整合素β。1和单克隆抗α2β1integrin(Millipore)；monoclonal anti-GBS(Acris)；monoclonal anti-FAK，FITC rat anti-mouse Ly6G and FITC rat IgG2a(BD Biosciences)；anti-GST and goat polyclonal anti-Akt(Santa Cruz Biotechnology)；monoclonal anti-FITC biotin conjugate and anti-laminin(Sigma)；Alexa fluor 647 anti-mouse CD45(BioLegend)；anti-phospho p44/42 MAPK(pY204)and p44/42 MAPK rabbit Ab(Cell Signaling)；rabbit polyclonal anti-phospho FAK(pY397)and rabbit polyclonal anti-phospho Akt(pS473)(Invitrogen)；细胞松弛素D、PI3K抑制剂LY 294002、MEK 1/2抑制剂U 0126(Sigma)。

细菌和PilA与胶原的结合

用结晶紫染色法测定细菌与胶原的结合57...加入20 mm柠檬酸缓冲液(pH4.3)释放与细菌结合的染色，在595 nm处测定吸光度。

ELISA法检测PilA-GST或GST与胶原的结合36...用不同浓度包被Ⅰ型胶原或BSA(2μg/孔)的ELISA平板进行处理。无论是PilA-GST还是GST蛋白。用抗PilA或抗GST Ab和HRP结合的次级抗体孵育后，用3，3‘，5，5’-四甲基联苯胺(Sigma)显色，在450 nm处测定吸光度。

蛋白质包覆乳胶珠的细胞附着

乳胶微珠(直径1.1μm，西格玛)涂有PilA-GST或GST。58蛋白质(1毫克毫升)−1)在4°C的偶合缓冲液(50 mm MES pH6.1，200 mm NaCl)中过夜。洗涤后，非特异性部位被2%BSA或胶原所阻断。hBMEC单层与蛋白包覆的乳胶珠在1：10的比例下孵育4h。

共焦显微镜

4%PFA固定，0.1%TritonX-100渗透。Pila用抗PilA(1：1，000)Ab和Alexa Fluor 488结合山羊抗兔抗体(Invitrogen)染色.FAK用抗FAK抗体(1：1，000)染色，然后用Cy5结合兔抗小鼠抗体(Invitrogen)染色。DNA用碘化素-脯氨酸(Invitrogen)染色。使用Vectashed(向量实验室)在玻璃幻灯片上安装遮光片，并用共焦激光扫描显微镜(LeicaMicrosystems)进行可视化。

WESTERNBLOTTING

hbmec感染WT gbs和Δ皮拉突变体为不同时间点，用含2mm Na的RIPA缓冲液(热科学)溶解。3Vo4、100 mm NaF、10 mm焦磷酸钠、1mm PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(CalBiochem)。细胞裂解液(40μg)用抗FAK、Akt和ERK 1/2(Abs均为1：1，000)的非磷酸化和磷酸化形式的抗体进行检测。

体内中性粒细胞趋化性

所有动物实验均由圣地亚哥州立大学(SDSU)协议APF10-08-024D动物使用和照料委员会批准，并使用公认的兽医标准进行。用皮肤测定中性粒细胞的吸收。体内中性粒细胞趋化试验15,55...为了确定导致中性粒细胞趋化的信号通路，在细菌注射前2小时，小鼠皮下注射1mg kg。−1U 0126，LY 294002或DMSO。直接在CNS中评估PMN的招募情况，5天大的幼犬(C57BL/6，n=每组4人)591-3×105无论是WT GBS还是Δ的CFU(25μl)皮拉变种人。伤后8~10h，石蜡包埋脑切片用FITC大鼠抗小鼠Ly6G(1：50)或苏木精和伊红(H&E)染色。

血源性脑膜炎小鼠模型的建立

8周龄雄性CD-1小鼠静脉注射6-7×10。7等基因Δ皮拉变种人。在注射后的不同时间点(24、48和72h)，对小鼠进行安乐死，采集血液、脑及肺、脾、肝、肾等多种组织。用4%PFA固定脑的一半进行组织病理学分析。剩余脑组织中，~(30)mg进行RNA提取。其余脑组织和其他组织在PBS中进行匀浆，匀浆在THA平板上进行菌落计数，或用ELISA法测定趋化因子KC。

外周中性粒细胞耗竭

用50μg RB6-8C5单克隆抗体(BD生物科学)腹腔给6~8周龄CD-1雄性小鼠腹腔注射前24h诱导PMN耗竭。对照组小鼠接受等量的同型对照抗体，大鼠IgG2B...用alexa Fluor 647标记的抗CD 45抗体和fITC标记的抗Ly6G抗体(均在1：500)染色，并在注射rb6-8c5或IgG后24和48 h进行fcs，检测pmn耗竭程度。2B.

BBB通透性测量

bbb通透性由EB血管通透性和fITC-白蛋白渗漏量决定。28,29...在乙醇化前1h，腹腔注射2%EB的10 0μl。处死后用PBS匀浆，60%三氯乙酸沉淀蛋白质，在610 nm处测定上清液中EB的浓度。EB染色通透性按标准曲线表示为每克脑组织EB的μg。另外，在献祭前30分钟，小鼠被静脉注射。注射10毫升公斤−1对FITC-白蛋白和脑组织进行免疫组织化学分析。

免疫组织化学

用抗GBS抗体(1：20)染色，小鼠试剂盒(载体实验室)，结合链霉亲和素-HRP和生物素化抗鼠IgG，在脑切片中检测GBS。用与AlexaFluor 488结合的抗小鼠二级抗体对脑组织切片进行染色，检测GBS。血管用抗层粘连蛋白(1：50)标记，细胞核用to-Pro标记，用共聚焦显微镜观察。用抗FITC生物素结合物(1：400)观察FITC-白蛋白在小鼠脑内的外渗，并与AlexaFluor 488结合显示。