难治性慢性GVHD(CGVHD)是异基因造血干细胞移植(SCT)后的重要并发症，预后不良。骨髓间充质干细胞参与组织修复和调节免疫反应。离体和体内...2005年4月至2008年10月，对19例难治性cGVHD患者进行了骨髓间充质干细胞治疗。骨髓间充质干细胞的中位剂量为0.6×10。6每公斤体重细胞。19例患者中14例(73.7%)对骨髓间充质干细胞反应良好，取得CR(n=4)或公共关系(n=10)。14例存活患者中，5例患者的免疫抑制剂可减少到起始剂量的50%以下，5例患者可停止使用免疫抑制剂。MSC给药与免疫抑制治疗停药的中位持续时间为324天(范围为200~550天)。无患者在MSC输注过程中或注射后即刻发生不良反应。2年生存率为77.7%.临床改善伴随着CD5+CD 19+/CD5−CD 19+B细胞和CD8+CD 28−/CD8+CD 28+T细胞比例的增加。总之，骨髓间充质干细胞的输血离体无论供体是谁，都可能是一种安全有效的抢救方法，治疗对类固醇耐药的cGVHD患者。

慢性GVHD(CGVHD)是影响异基因造血干细胞移植成功的主要因素之一，不仅对患者的生存有重要影响，而且对无癌患者的生活质量也有重要的影响。半数接受同种异体HLA移植的患者，存活时间超过100天，可能需要长期免疫抑制治疗，治疗范围广泛的cGVHD，通常超过2年。1, 2, 3超过三分之一的cGVHD患者对一线治疗没有反应，这通常涉及皮质类固醇和钙调神经磷酸酶抑制剂的结合。4对于这些患者，没有标准的二线治疗或抢救治疗，结果很差。5, 6, 7, 8, 9, 10, 11骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种多功能、非造血干细胞，可分化为多种来源，已被用于修复受损组织。12, 13, 14, 15, 16, 17近年来，骨髓间充质干细胞也表现出独特的免疫调节特性。离体，包括抑制异丙银和丝裂原刺激后的T细胞增殖，以及防止细胞毒性T细胞的活性。18, 19骨髓间充质干细胞用于预防急性GVHD20对于类固醇难治性急性GVHD患者，21, 22, 23, 24但只有一项研究报道了骨髓间充质干细胞在难治性cGVHD患者中的暂时作用。22

在本研究中，我们研究了来源于HLA-完全相同的兄弟姐妹或HLA-异种第三方供体的骨髓间充质干细胞对19例难治性cGVHD患者的挽救治疗效果。

病人特征和定义

在2005年4月至2008年10月期间，19名患者接受了离体骨髓来源的骨髓间充质干细胞对难治性cGVHD的同情治疗(表1)。纳入本研究的患者需要有以下证据：(1)cGVHD的临床表现在标准免疫抑制治疗中没有改善，包括激素和钙调神经磷酸酶抑制剂，或与其他免疫抑制剂联合治疗1个月后；(2)cGVHD的表现显示，在至少2周的标准免疫抑制治疗或类固醇或其他免疫抑制剂逐渐减少后，cGVHD的表现有进展。该项研究已获广东省总医院伦理委员会批准。所有患者和MSC捐赠者都提供了书面知情同意。

移植程序

所有患者均经氟达拉滨联合改良BU/CY预处理方案(FABC预处理方案)治疗后接受HLA相同的PBSCs治疗，其中包括阿糖胞苷2.0g/m。2在−9天，静脉滴注BU3.2mg/kg。在−8~第−6天，−5和−4天CY 60 mg/kg/d，联合氟达拉宾30 mg/m。2连续三天，在−6天至第4天，以及Me-ccnu(1-(2-氯乙基)-3-(4-乙基硝基苯基环己基4)-1-亚硝基脲)250 mg/m2在−3天，所有患者均接受CsA联合短疗程的霉酚酸酯和四剂MTX进行预防。CsA剂量为2.0mg/kg/d，静脉滴注。从移植前第9天起至肠功能正常，此时患者按1：2.5的比例转为口服CsA。霉酚酸酯剂量从移植前第9天至移植前第1天，每12h口服0.5g。MTX剂量为15 mg/m。2一.V.在+1天(移植后1天)，然后10毫克/米2一.V.移植后+3、+6、+11天。接受治疗的病人卡氏肺孢子虫甲氧苄啶/磺胺甲恶唑预防，阿昔洛韦或同等物抗病毒预防，青霉素或同等物预防抗菌药物。

HSC捐助者

所有捐献者均为HLA-相同的兄弟姐妹。hla分型采用基因组低分辨率DNA分型(PCR序列特异性引物).

GVHD的诊断与分级

cGVHD的诊断、器官评分和全球评估依据的是美国国立卫生研究院(NIH)对cGVHD的一致标准。25根据已发表的分类，确定cGVHD的发病形式。26

MSC用药前的治疗

除1例外，所有患者在接受MSCs治疗前6周以上至少有两次免疫抑制治疗无效。表2)。从cGVHD诊断到MSC注射的中位时间为35.6周(范围为6.4~246.1)。1例(UPN 124732)发生中度cGVHD，用钙调神经磷酸酶抑制剂和类固醇治疗，6个月后复发。此患者仅接受MSC灌注治疗cGVHD复发。

硕士筹备和管理

骨髓来源的骨髓间充质干细胞在局部麻醉下从HLA配型供体或HLA相异的第三方供体中抽吸(20 ML).这项研究得到了广东省总医院机构审查委员会的批准，所有捐献者都提供了书面知情同意。人骨髓间充质干细胞的分离和培养，如先前所述，经过轻微的修改。27, 28用人MSC培养液(含低糖Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(L-DMEM；HyClone、Logan、UT、USA)和10%胎牛血清(FBS；HyClone)稀释20 mL BM：1：1；800离心后g将单个核细胞从界面上收集20 min，以5000细胞/cm的浓度在人MSC生长培养基中进行洗涤和再悬浮。2...3天后，用新鲜培养基替代废培养基，去除非贴壁细胞。贴壁细胞每3天进一步培养一次。当细胞融合率为70~80%时，用胰蛋白酶-EDTA分离细胞，按1：3的比例传代。多个供体制备，第二代或第三代骨髓间充质干细胞进行个体实验。所有这些样品都已被测试其分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的能力。流式细胞术用FACSort进行分析，用CellQuest软件进行分析(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)。扩增后的细胞表达CD 29、CD 44、CD 73、CD 90、CD 105和CD 166，而不表达CD 11a、CD 34或CD 45。在合适的诱导培养基中，可诱导其分化为成骨、成脂和成软骨细胞。图1)。骨髓间充质干细胞输注前对病原体和污染物(如细菌、真菌、病毒、支原体和内毒素)进行阴性筛选。

人骨髓间充质干细胞的鉴定与分化(a第3代人骨髓间充质干细胞的相差显微镜。b茜素红S染色诱导分化的人骨髓间充质干细胞。(c)脂肪源性分化的人骨髓间充质干细胞油红O染色。(d甲苯胺蓝染色诱导分化的人骨髓间充质干细胞。(e)人骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞表面AGS的流式细胞仪分析。BAR=200μm.

全尺寸图像

计划的MSC剂量方案为1.0×106/kg体重，但在按计划及时培养足够的骨髓间充质干细胞时存在一定的困难。结果，MSC剂量中位数为0.6×10。6/公斤体重(0.23-1.42×10)6/千克每体重)。取培养的骨髓间充质干细胞，经腹腔注射。输注超过30分钟。MSC管理的中位数为2(范围，1-5).第一次和第二次MSC应用之间的中位持续时间为188天(范围为13-944天)。

对反应和监测的评价

由于缺乏统一的评估标准和这种疾病的各种疾病表现，对cGVHD治疗反应的评估是相当困难的。在这项试验研究中，我们使用nih共识标准对cgvhd进行器官评分和全球评估。25以及评估反应的措施。29第一次MSC给药后3个月对患者进行评分，评分范围包括皮肤、口腔黏膜、肝脏、胃肠系统、眼睛、肌肉、关节和肺。选择这些领域是为了使评价尽可能客观。每次随访时，收集用于获取症状信息的病人调查表和医生调查表。详细的症状清单和体检结果被记录下来，这两种形式被用来确认反应。在出现差异的情况下，使用客观数据，例如生物标志和实验室结果来澄清歧义。每个病人的反应在3个月和他或她的最后评估时评估。应用器官反应和整体反应评价MSC治疗难治性cGVHD的疗效。

器官反应评估

根据NIH提出的cGVHD器官评分标准，29每个器官的评分为0(无)到3(最差)。答复定义与目前的研究一致：5, 7, 11, 16CR被定义为除不可逆损伤(如严重硬皮病和sicca角结膜炎)外的所有临床表现。cGVHD对某些器官造成的损害是不能逆转或治愈的，29, 30如慢性干眼，食管狭窄，毛细支气管炎闭塞，或晚期皮肤硬化或挛缩。为了客观地评价一种新的抢救治疗难治性cGVHD的疗效，我们将硬皮病和角膜结膜炎的‘不可逆转’损伤排除在CR之外，以避免反应评估的偏倚。良PR是指临床表现和实验室数据减少75%以上，或在4分量表上改善超过1分，但没有达到CR；PR 10被定义为在受累器官中至少有一个点的改善，或临床表现和实验室数据减少50%以上，但小于75%。小量PR(MPR)的定义是：在一个器官或临床症状评分上改善不足一分，实验室数据减少25%以上，但低于50%。进展性疾病(PD)被定义为在任何领域恶化至少25%，或恶化超过一个点，而在治疗或类固醇锥度。没有反应(NR)被定义为在受影响的器官中没有改善或恶化。评估MSC输注后cGVHD的各器官表现为有意义的反应(CR、GPR和PR)、进展或NR。最初好转但随后恶化的患者被认为是疾病复发的表现。

对总体反应的评估

患者按照NIH共识标准cGVHD进行评估，29在第一次评估(MSC输注后2周至3个月)和最终随访时，对评分进行重新评估(无，轻度，中度或重度)。总的反应定义为：CR指的是cGVHD在所有受累器官的所有临床表现的解决，不包括不可逆转的损伤，或所有器官的评分为零。PR被定义为至少有一个点或至少50%的临床表现改善，但没有CR，并且在任何领域都没有恶化。无反应(NR)定义为所有受累器官无改善或恶化。在反应评估前因GVHD而早期死亡的患者也被认为是NR。混合反应(MR)被定义为至少一个器官的改善，另一个器官的恶化或新参与的表现的出现。有改善但后来恶化的病人也被认为是PD患者。有效率包括CR和PR，未见反应为NR和PD。OS率从造血干细胞移植(SCT)之日起计算至死亡之日或最后一次随访。

流式细胞术分析

流式细胞术对装有15 mW风冷氩激光器的FACScan(Becton Dickinson)(BDIS)进行了流式细胞术。数据采集和分析由CellQuest(Becton Dickinson)研究软件进行。

统计分析

用Kaplan-Meier法用对数秩检验(Mantel-Cox)估计OS和差异的显着性.用双侧Wilcoxon符号秩检验比较淋巴细胞亚群比例.P-数值<0.05被认为有统计学意义。用SPSS软件包(SPSS13.0，Inc.，芝加哥，美国)进行分析。

临床特征

19例难治性cGVHD患者在原代免疫抑制治疗的基础上接受MSC输注。除1名病人外，所有患者均在第一次MSC输血前6周以上接受免疫抑制治疗，包括CSA或FK 506(n17)，类固醇(n=18)，MMF(n=5)，MTX(n6)，青霉胺(n=3，硫唑嘌呤(n=2)，沙利度胺(n=2)和布地奈德(n=1)。以下是cGVHD患者的特征。表1...16例患者在逐渐减少免疫抑制剂期间进展，2例在开始治疗2个月后无反应，1例在停止免疫抑制治疗6个月后复发。11例重新开始，5例为渐进型，3例为静止型cGVHD。移植后平均160天(73~352天)诊断为cGVHD.按NIH分级，重度14例(73.7%)，中度5例(26.3%)。18例(94.7%)皮肤受累的患者中，3例有严重的硬化特征，所有部位的皮肤评分均为3分，同时至少有一个关节或溃疡的活动范围缩小。其余的有扁平苔藓样特征，足皮和黄斑小叶改变，涉及其大部分体表。17例cGVHD患者中14例为巩膜角结膜炎(Schirmer试验<5mm/5 min)。其中2例视力严重受损，因眼部症状不能工作。16例患者中6例(84.2%)口服cGVHD。主要症状和体征为溃疡或黏液炎、苔藓、角化性斑块、口干、假膜和黏液囊肿。11例(57.9%)肝cGVHD患者血清丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素升高。胃肠道(GI)受累患者(n恶心、呕吐、腹痛8例，占53%。一个是腹泻，一个是食管狭窄。其他的cGVHD是肌肉和关节的(n血小板减少症(n=2)和肺(n=1)。19例cGVHD患者中有5例有组织学资料。骨髓间充质干细胞给药期间或后即刻均未观察到与输液有关的毒性。

对治疗的初步反应

根据不同的患者，在第一次MSC输血后2周至3个月进行初步评估。第一次注射MSC后，8例(42.1%)显效。11例无反应。第一次MSC灌注至有意义改善的中位时间为29天(1~100天)。皮肤是涉及最多的器官。nCR/PR率为50%。3例重度硬皮病患者中有2例第一次注射MSC后出现小PRs。难治性口腔粘膜cGVHD患者也有反应(n=15，93.8%)，胃肠道(n=9，90%)，肝脏(n=7，63.6%)和眼睛(n=2，11.1%)。第一次随访时，肌肉或关节、肺或血小板受累的患者均未见有意义的反应。

对治疗的总体反应

第一次给MSC后，11例因NR(n=9)或合并(n=2)。第一次至第二次输液的中位时间为188天(范围为13-944天)。资料摘要载於表2...中位随访时间为697天(范围81-1294)后，14例患者(73.7%)出现总有效率(CR)。n=4；PR，n=10)。第一次MSC输血至最佳疗效的中位持续时间为233天(81-761天)。皮肤累积有效率为78%。n14，CR=4，GPR=1，PR=9)。在3例硬皮病患者中，1例有PR，1例有轻微PR，其余1例对MSC注射没有反应。眼的累积反应率为44.4%。n3例结膜炎患者取得CR。角膜结膜炎14例，临床症状改善5例(35.7%)，Schirmer试验无改善。口腔粘膜也有累积反应(n=16，100%)，肝脏(n=10，90.9%)和胃肠道(n=9，90%)。在3例中度关节僵硬或肌炎患者中，有2例在7个月后出现延迟PR。2例血小板减少患者在多次输注MSC后第223和366天出现延迟反应。患者(UPN 206111)肺受累对MSC治疗无反应，于MSC注射后81天死于侵袭性真菌感染。其余3例患者在MSC输注后出现肺cGVHD，虽然早期受累病变有所改善，但仍出现混合反应。

生存与免疫抑制疗法

在本研究中，有5例(26.3%)患者在第一次注射MSC后死亡。中位生存期183天(范围61~805天)。死亡原因是侵袭性真菌感染(n=2)，原发性恶性疾病复发(n=2)和闭塞性毛细支气管炎(n后者与cGVHD有关。到目前为止，还没有一个存活的病人在669天的中位随访时间(226~1294天)内经历过恶性疾病的复发。应用骨髓间充质干细胞治疗难治性cGVHD患者的2年生存率为77.7%，无难治性cGVHD者为68.8%(14/14)。P=0.547)。两组患者年龄、性别、原发疾病、治疗及初发cGVHD分级相同(数据未显示)。但难治性组和非难治性组cGVHD诊断终止免疫抑制剂的中位时间分别为611天(337~1112天)和427天(295~764天)。非难治性组中，58.8%的患者能在427天的中位时间停止使用免疫抑制剂，CR稳定时间超过375天。

在最后一次随访中，存活的14名患者中有10名(CR=4，PR=7，MR=2，NR=1)在MSC输血后能够逐渐减少和/或停止免疫抑制治疗(表2)。4例CR患者和1例PR患者(UNP 102309)在第一次MSC注射后324天(范围200~550天)内停止使用免疫抑制剂，持续CR或稳定病675天(范围317~1198天)。5例PR患者在第一次MSC灌注后233天(136~345天)开始逐渐减少免疫治疗，并维持良好状态，平均稳定464天(范围90~842天)。在整个观察期间，对那些有反应的患者，强的松的剂量被成功地停止或减少到不超过0.1mg/kg。第一次注射MSC后，1例NR和1例PR患者维持基本治疗，不需进一步增加免疫抑制剂，2例MR患者每日服用类固醇0.4 mg/kg。UPN 124732患者仅接受MSC输注，无进一步免疫抑制治疗，取得CR。

不幸的是，有3例患者在MSC注射6个月后逐渐变细或停止免疫抑制治疗后肺部受累，尽管他们的口腔粘膜、皮肤、眼睛或肝功能均有改善。2例PR患者经泼尼松0.3~0.5mg/kg治疗，病情稳定。第一次MSC注射后816天，NR患者死于毛细支气管炎闭塞症，但他克莫司与四次MSC联合使用。

2例无反应，1例第81天死于侵袭性真菌病，1例存活患者(UPN 065877)皮肤、食管、眼部受累严重，接受免疫抑制剂6年以上，两次给予MSC治疗无效。

淋巴细胞亚群分析

流式细胞术检测MSC输注前后淋巴细胞亚群.治疗后NR患者T细胞、B细胞、NK细胞比例及活化程度无明显变化。反应组淋巴细胞(35.45±11.45%)比对照组(25.32±11.15)%，P<0.0001) and CD3+CD4+ T cells (45.08±13.71% vs 39.15±11.99%, P输血后3个月CD3+CD8+T细胞显著升高(45.13±16.53%vs 50.06±18.02%)。P=0.018)下降。然而，有反应的患者输注MSC后CD4+CD 25+T细胞和CD8+CD 25+T细胞的比例变化不明显(P-值分别为0.493和0.327)。CD8+CD 28+T细胞随cGVHD的改善而下降(42.42±15.33%vs 38.87±17.09%)。PCD8+CD 28−T细胞增加(58.87±15.27%vs 63.31±16.65%)。P=0.025)MSC后输注。CD5+CD 19+B细胞亚群增加(29.42±15.33%vs 40.99±17.20%)。PCD5−CD 19+B细胞减少(70.58±15.33%vs 59.01%±17.20%)。P反应组大鼠输注MSC后=0.033)。

cGVHD是一种多器官疾病，是异基因造血干细胞移植后晚期无复发死亡的主要原因.超过三分之一的cGVHD患者对包括皮质类固醇和钙调神经磷酸酶抑制剂联合治疗在内的一线治疗无效，4他们的预后往往很差。31这些病人没有标准的二线治疗或抢救治疗。最近的报道描述了各种疗法的使用情况。5, 6,7, 8, 9, 10, 11对于难治性的cGVHD，但结果显示，由于毒性作用，疗效有限，长期存活率低。骨髓间充质干细胞是一种多功能的非造血干细胞，可以分化为多种组织，13损伤组织修复12, 14, 15, 16, 17调节异基因免疫反应。18, 19, 32近年来，骨髓间充质干细胞被用于预防急性GVHD。20治疗激素难治性急性GVHD，剂量为1.0×10。6/千克每名病人的体重。21, 22, 23, 24然而，有关MSC治疗cGVHD的有效性和安全性的数据很少。只有一篇已发表的报告显示MSC对一例肝脏cGVHD的临时反应。22

这是骨髓间充质干细胞联合免疫抑制治疗难治性cGVHD的先导研究，治疗时间超过6个月。共有14例(73.7%)患者有CR(n=4)或PR(n(10)71.4%的存活患者能在MSC输注后停止使用或逐渐减少免疫抑制剂。此外，2年生存率(77.7%)高于前几次报告.5, 31骨髓间充质干细胞对口腔粘膜、胃肠道液、肝脏和皮肤的cGVHD有较好的治疗作用。根据反应器官的不同，口腔粘膜、胃肠液和肝脏的表现在MSC治疗开始后24小时或几周内趋于改善，而眼睛和硬化病变可能需要很长时间才能达到反应。众所周知，cGVHD对某些器官的损害是不可逆的，也是不能治愈的。有趣的是，在本研究的结果中，我们发现两例重度硬皮病患者(UPN 102309和UPN 152529)有PR或轻微PR。我们还注意到，在本研究中，对于sicca角膜结膜炎(Schirmer‘s test<5mm/5 min)患者，虽然Schirmer试验没有改善，但他们的临床症状通过减少眼药水和疼痛得到改善。因此，MSC输注可改善慢性GVHD的某些“不可逆”损害。由于作出反应所需的时间较长，因此应保持耐心。本研究结果提示骨髓间充质干细胞可能对毛细支气管炎闭塞症无效，也可能发展为毛细支气管炎闭塞症。

在半数以上的患者中，单个剂量的MSC能够产生暂时或持续的反应，而一些患者需要几个剂量才能产生持久的反应。相反，尽管多次输注MSC，但少数患者未见反应或混合反应。临床上的益处可能不需要许多MSCs的持续植入，但可能是生长因子的产生或暂时的免疫抑制所致。静脉系统输注MSC根据血流量分布于不同的器官和组织。33, 34, 35因此，骨髓间充质干细胞可以分散到口腔粘膜、胃肠液和肝脏，这些组织具有丰富的血液供应，修复损伤组织，调节免疫反应。体内移植骨髓间充质干细胞在短时间内分化为非免疫抑制细胞似乎是导致某些患者出现暂时性反应的因素之一。36

为了研究其可能的机制，我们检测了淋巴细胞亚群，以评估MSCs是否参与了GVHD的改善。本研究未观察到CD4+CD 25+T细胞亚群随cGVHD的改善而有明显变化，但发现CD8+CD 28+细胞的T淋巴细胞亚群作为参与移植免疫和排斥反应的活性CTL，其调节水平下降，临床缓解，CD8+CD 28−细胞比例升高。CD8+CD 28−T细胞，即T抑制细胞，是MHCⅠ类细胞，具有抗原依赖性。37CD8+CD 28−T细胞作为调节细胞，诱导免疫耐受，抑制APC功能，进而抑制辅助性T细胞的进一步活化，抑制Ab的产生。38, 39我们还发现B1细胞(CD5+CD 19+)增加，B2细胞(CD5−CD 19+)减少。B细胞参与cGVHD的发病机制是众所周知的。然而，最近有关B1细胞功能的知识被更新，他们被发现通过产生细胞因子(如IL-10)来保护自身免疫。40CD8+CD 28−/CD8+CD 28+T细胞和CD5+CD 19+/CD5-CD19+B细胞的平衡可能参与了cGVHD的发病过程，但还需要更多的免疫学研究来证实这一推测。

综上所述，骨髓来源的骨髓间充质干细胞可能是治疗顽固性慢性GVHD患者的一种安全有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞联合全身免疫抑制剂可提高难治性cGVHD患者的生存率。在本研究中调查的少数病例可能无法提供更明确的结论，因此，需要进一步的大规模随机临床研究来将这种治疗方法与更传统的方法进行比较。此外，还需进一步研究慢性GVHD所需的输注次数、每次输注中细胞的最佳剂量、MSC治疗的机制以及细胞与其他药物的可能相互作用。