VNTRⅢ的T1D保护作用的一个假设机制是胸腺表达增加可能导致发育过程中胰岛素原反应T细胞的缺失。为了直接验证这一假设，我们分析了VNTR I/I或VNTR III/人外周血淋巴细胞对HLAⅡ类胰岛素原复合物的识别作用。 x (在哪里 x =I或III)基因型。CD4+CD 25-24例白种人VNTR I/I和21例VNTRⅢ/患者外周血T淋巴细胞 x 符合HLA-DRB 1的受试者 * 0401在PI(76~90)存在下与自体抗原提呈细胞共同培养， 22 使抗原特异性细胞得以扩增，并与可溶性DRB 1共同孵育。 * 0401-PI(76-90)配合物与藻红蛋白荧光色素结合。在45个HLA-DRB 1中 * 0401-阳性者分析，其中6人为DRB 1纯合子。 * 0401，12还有DRB 1 * 0301和剩下的27个有其他的DRB 1 * 等位基因。PI 73-90表位在人和人HLA-DR4/CD4双转基因小鼠中均具有免疫优势。 23 在VNTR I/I患者中，79%(19/24)有四聚体阳性T细胞，而29%(6/21)的VNTR III阳性。 x 科目( P <0.0010; 表1 )。如图所示 图1a ，四聚体阳性率在各组间的总体分布差异有非常显着性( P <0.0004) and, with two exceptions, all the VNTR III/x subjects were at or near background levels of tetramer detection.
表1 PI的发生 76–90 四聚体阳性 a T1D患者和非T1D患者的细胞 图1 关系 惯导 -VNTR基因型和CD4 T细胞的检测，它们与PI76-90四聚体结合。具有VNTRⅠ类等位基因的人外周血T细胞水平较高，可识别可溶性DRB 1。 * 0401-PI76-90四聚体与具有Ⅲ类保护等位基因的人比较 (A) ...用PI76-909s修饰的四聚体对同一T细胞样本进行分析，两组间无差异，表明两组T细胞中均存在低亲和力pI反应T细胞。 (B) ...此外，当使用另一种t1d自身抗原gad 555-567或异源抗原HA 306-318时，两组受试者之间的四聚体阳性率没有差异，表明了vntr协会的胰岛素原特异性。 (c，d) . ***P 采用Mann-WhitneyU检验，计算四聚体反应性T细胞水平的差异。实心水平线代表手段。虚线显示负对照四聚体的结合率为0.5%。 $ 惯导 -VNTR III/ x 哪里 x =I或III.HLA-DRB 1的分型 * 应用序列特异性引物和探针结合实时PCR技术对04种亚型进行检测. 27 共45个HLA-DRB 1 * 对0401例阳性者进行了分析，其中6例为DRB 1纯合子。 * 0401，12还有DRB 1 * 另外，0301和其余27个国家还有其他一些DRB 1。 * 等位基因。T1D患者 惯导 -VNTR I/I以及 惯导 -VNTR I/III基因型与自身抗体阳性者(36.3±10.4vs42±12.8)和健康对照组(40.4±14.5vs50.5±14.6)相比，年龄相近(分别为25.8±8.9岁和26.2±11.6岁)，病程分别为3.4±1.9岁和5.5±1.5岁。根据−23A/T单核苷酸多态性(Snp)的基因型进行基因分型。 惯导 启动子。 14 , 28 从肝素化血中分离外周血单个核细胞和CD4+CD 25−T细胞。第一步用CD4+T细胞分离试剂盒从所有非CD4细胞中分离CD4+T细胞(Miltenyi Biotec，Auburn，CA，USA)。在第二步，CD 25+T细胞通过抗CD 25微球被耗尽.刺激CD4+CD 25−T细胞 离体 在48孔组织培养板中用PI肽、血凝素(HA)肽(10μg ml)预处理非CD4+细胞，培养12~14天。 −1 )或者没有多肽。在第6、8和10天，重组人白细胞介素2(10 IU毫升) −1 ，Chiron公司，爱默里维尔，加利福尼亚州，美国)被添加到文化。
为了更好地检测T1D中的低亲和力CD4+自身反应性T细胞，用含有氨基酸替代的激动剂肽研制了HLAⅡ类四聚体试剂，提高了四聚体与抗原特异性调节T细胞的结合。杨 等人 4 最近报道了在PI(76-90)肽中p9位赖氨酸与丝氨酸的替代作用，以稳定与DRB 1的结合。 * 0401在可溶性四聚体中，导致胰岛素原阳性CD4 T细胞群的检测增强.当使用这种‘9S’四聚体分析同一T细胞样本时，在VNTR I/I和VNTR III/x受试者中检测到较高水平的四聚体阳性细胞( 图1b )，各组间差异无显着性(P>0.05)。因此，在这两个群体中都存在低亲和力T细胞，与基因型无关，而具有较高亲和力的CD4 T细胞能够识别天然胰岛素原肽的存在则是存在的。 惯导 基因控制。
用另一种T1D自身抗原GAD 65进行平行四聚体检测。 24 或者来自流感病毒血凝素的抗原。 25 如图所示 图1c和d ，这些抗原的四聚体阳性率在被分类的人群中没有发现差异。 移民局- VNTR基因型，提示胰岛素原免疫应答的特异性。
这些检测的淋巴细胞样本来自T1D受试者、自身抗体阳性、非糖尿病“高危”受试者和非自身免疫对照者的混合样本。 移民局- 用胰岛素原四聚体检测T细胞的vntr基因控制在所有三组中都是相似的。 表1 ...换句话说， 移民局- VNTR和外周胰岛素原四聚体结合T细胞仅以基因型为基础，与疾病状态无关。总体而言，将VNTR I/I和VNTR III/ x 研究对象中，与非糖尿病组相比，t1d组也有较高的四聚体阳性率的趋势，与先前存在的情况一致。 体内 糖尿病人群自身反应性细胞的扩增 补充图S1 )。或者， 离体 该试验的培养条件可能允许这些自反应群体优先扩展。
由于用修饰的‘9s’肽进行的四聚体结合研究使我们能够检测低亲和力的PI(76-90)结合T细胞，我们使用了HLA-DRB 1。 * 0401-9s四聚体用于流式细胞术筛选胰岛素原特异性CD4 T细胞 移民局- VNTR I/I科目。由于抗原特异性T细胞频率低，细胞恢复受到限制，但在4例(2例对照组和2例T1D)中，我们纯化了足够的四聚体阳性细胞进行转录阵列分析。 图2 显示用于细胞分选的流式细胞仪图谱：流感血凝素阳性T细胞的平行四聚体分选和以同一样本为对照的平行转录阵列。
图2 T1D和对照组CD4 T细胞的流式细胞仪分析用于RNA提取和随后的转录阵列，显示四聚体与PI 76-90 9S修饰的四聚体结合。平行HA306-319四聚体阳性结合(外来控制抗原)和一个无关的对照四聚体，外表面蛋白A(OspA)163-175.右上象限的数目代表培养14天后CD4+CD 25−T细胞亚群中四聚体阳性细胞的百分比。主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类四聚体是通过构建表达载体和产生可溶性生物素化HLA-DRB 1而产生的。 * 0401分子，如其他地方所述。 25 Hla分子经洗涤剂促进交换负载多肽，透析去除未结合组分。用藻红蛋白标记的链霉亲和素孵育得到四聚体。PI76-90免疫显性表位 PLALEGSLQK Rg)， 22 PI76-909s替代肽(SLQ) PLALEGSLQS 第9(9p)位K88对S的取代增强了其结合亲和力和激动性， 4 , 22 和两个不相关的控制肽，甲型流感血凝素HA 306-318(KYVKQNTLKLA) 25 作为阳性对照，OspA 163-175(KSYVLEGTLTAEK)作为阴性对照，分别加载到HLA-DR4分子中，组装成四聚体。培养12~14d后，用四聚体染色进行流式细胞术分析。 29
在84份细胞因子和候选免疫标记的转录本中，6份清晰地区分了正常人和T1D人的胰岛素原四聚体阳性细胞。 图3 )。其中四个标记物与活化诱导的细胞死亡介导的外周耐受密切相关：FASLG(Fas配体(TNF超家族，成员6))、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)和TNFSF 11(TNF(配体)超家族，成员11)。这些标记物在正常人和T1D患者中都被观察到，但仅在对胰岛素原应答的正常人中。胰岛素原激活的T1D T细胞不能上调这些转录本，可能表明对这种外周耐受途径有功能性的抵抗。
图3 PI特异性四聚体细胞的部分表达谱。FASLG、肿瘤坏死因子(TNF)、TNFSF 11和IL-2转录本的上调与外周耐受性有关，可区分T1D患者。 (A) 来自对照组 (B) ...在控制HA 306-318特异性细胞方面，没有观察到类似的关联。 (c，d) ...相对转录本的表达在肽刺激培养中以折叠或下调的方式计算，相对于自体非刺激培养。采用BD-FACSantage细胞分选器对流式细胞仪分离的四聚体阳性细胞进行基因表达谱分析(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞，美国)。从四聚体阳性细胞中提取总RNA，采用MAGMAX总RNA分离试剂盒(美国福斯特市应用生物系统公司)。用RT合成了第一链互补dna。 2 第一线试剂盒(SABioscients公司，公司，弗雷德里克，MD，美国)和样品镀在RT上 2 常见人类细胞因子(SABioscience)的ProfilerPCR阵列，然后在StepOne Plus或ABI 7000序列检测系统(应用生物系统公司)上进行实时PCR扩增。扩增总体积为25μl，在95°C下为15s，在60°C下为1 min。每个基因的表达是通过将表达正常化为5个管家基因来确定的。通过比较肽刺激样本和未刺激的自体样本，计算出每个受试者的相对基因表达量。
此外，T1D组中有两种标记转录子IL-10和IL-7被上调，而在正常人中则没有对胰岛素原作出反应。对胰岛素原有反应的T1D患者T细胞中IL-10转录本的存在引起了人们的兴趣，因为这让人想起以前的研究，即用胰岛素原肽刺激外周血主要与IL-10的释放有关。 22 , 26 图4 说明了混合T细胞增殖试验，其中从分类的‘9s’胰岛素原四聚体阳性群体中纯化的三个T细胞克隆被添加到自体应答者外周血单个核细胞中。在每一种情况下，无论附加抗原如何，旁观者T细胞都受到抑制。白细胞介素-10和白细胞介素-7可能与低亲和力的自身反应性群体中的细胞存活和无反应性有关，从而促进了它们对凋亡耐受机制的相对抵抗力。
图4 PI特异性T细胞发挥旁观者抑制作用。所展示的是三个具有代表性的克隆，它们特异地增殖到本地和9s pI肽(10μg ml)。 −1 )。除了应答者T细胞抑制增殖，无论抗原暴露。S.D.棒子平均代表三口复制井。PI76-90特异性T细胞克隆是从糖尿病患者的CD4+T细胞中分离出来的. 22 他们的进一步特征是 3 用野生型PI76-90肽和PI76-90 S9替代肽，用胸腺嘧啶核苷掺入法确定其PI特异性。 2 , 26 在抑制试验中，用辐照的DRB 1激活了每井20 000个克隆T细胞。 * 0401个PBMCs(每孔60000个)作为抗原提呈细胞(APC)被PI肽或单独刺激。然后将活化的细胞加入到由DRB 1的CD 25+缺失的CD4+T细胞组成的应答细胞培养中。 * 0 401供体经5μg ml激活 −1 可溶性抗CD3(UCHT 1；BD生物科学制药，圣地亚哥，美国)，5μg ml −1 可溶性抗CD 28(CD 28.2；药物原)和辐照自体APC(非CD4细胞)。每个T细胞克隆抑制应答细胞增殖的能力 3 在第5天的最后16h，胸腺嘧啶核苷掺入量。
这些研究说明了抗原对糖尿病相关自身抗原的特异性耐受性的同时和双重机制。第一，最基本的控制水平是通过删除高亲和力的自身反应性T细胞来决定中枢耐受的基因阈值。具体之间的关系 惯导 -VNTR等位基因和四聚体原胰岛素原结合CD4 T细胞的水平，直接对应于先前观察到的胸腺抗原表达水平，清楚地确定了这个发育检查点是T1D易感性的一个基本决定因素。这是第一次在人类疾病中直接显示抗原特异性自身免疫的这种重要的中枢控制，但在功能上是不完整的。利用改良的‘9S’激动剂四聚体，我们还鉴定了外周循环中低亲和力的自身反应性T细胞，这些细胞是未被中央胸腺缺失的幸存者。在我们的对照组中，非糖尿病患者的这些细胞的转录本谱显示了第二种外周耐受机制，其特征是促凋亡基因的上调。因此，中枢和外周缺失点被用来控制T细胞对胰岛素原的反应性，表现为抗原表达的遗传控制和抗原特异性反应的亲和力阈值。
