甲型流感病毒感染基质（M1）蛋白期间的细胞死亡调控：病毒控制细胞存活途径的模型

在早期感染期间，病毒激活细胞应激反应蛋白(如热休克蛋白(HSP))来对抗细胞凋亡，但后来，它们通过调节这些蛋白质来刺激细胞凋亡，从而有效地传播病毒。HSP 70被认为是通过调节病毒的进入、转录、核易位和病毒子的形成而产生的。通过与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)结合，破坏凋亡小体的形成，发挥其抗凋亡作用。在此，我们发现甲型流感病毒可以通过病毒蛋白M1(基质1)调节Hsp 70的抗凋亡功能。M1本身并不诱导细胞凋亡，但增强了凋亡诱导剂的作用。m1小干扰RNA抑制病毒感染或M1蛋白过表达后病毒诱导的细胞凋亡。M1与Hsp 70结合，导致Hsp 70与Apaf-1的相互作用减少。在无细胞系统中，m1蛋白介导细胞色素诱导的促天冬氨酸酶-9(proaspase-9)活化。c/脱氧三磷酸腺苷。一项涉及缺失突变体的研究证实了Hsp 70的C-端底物结合结构域(EEVD)和M1的128-165氨基酸对这一关联的作用。未与HSP 70共沉淀的M1突变体未能诱导细胞凋亡。总之，这项研究证实了M1蛋白在流感病毒感染中的促凋亡作用。

细胞凋亡或程序性细胞死亡是一个遗传和生物化学定义的过程，它与包括细菌或病毒感染在内的各种疾病的发病机制密切相关。1, 2, 3在感染过程中，细胞死亡是通过激活宿主细胞防御机制，通过去除感染细胞来限制病毒的传播而引起的。同时，病毒感染或其他生理应激也会激活应激反应，以促进细胞存活。例如，激活抗凋亡蛋白如NF-κb，磷脂酰肌醇3-激酶/RAC丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和热休克蛋白(HSP)在复制的早期阶段被观察到，以延缓凋亡直到其生命周期结束。4, 5, 6相反，在感染的后期，病毒利用凋亡机制进行有效的传播和传播，通过激活启动凋亡或阻断抗凋亡通路的信号。

HSP主要作为细胞伴侣，维持蛋白质的折叠和复性。7病毒没有自己的伴侣蛋白，因此它们依赖细胞伴侣来正确折叠它们的蛋白质。在Hsp 40、Hsp 70或Hsp 90的复制过程中，病毒对Hsp 40、Hsp 70或Hsp 90有大量阳性要求。8, 9, 10相反，HSP的诱导也与各种RNA病毒的抑制有关，包括轮状病毒和流感病毒。11在生理应激期间，除了伴侣活性外，HSP还具有多种生物学功能，如抑制蛋白质聚集、增加蛋白质解聚和通过干预主要的凋亡相互作用来调节细胞凋亡。12, 13, 14, 15然而，HSP的这些应激反应功能可能并不总是与其伴侣活动有关.许多HSP，尤其是HSP 70参与了细胞凋亡的调控。13, 14, 15例如，在应激下，当hsp 70水平较高时，它通过与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)结合，发挥其抗凋亡作用，从而阻止凋亡小体的形成和caspase-9的形成。14, 15

甲型流感病毒，一种包膜的RNA病毒正粘病毒科，拥有一个由8个负感觉RNA组成的基因组。流感病毒已被证明能诱导HSP，其中Hsp 90直接与聚合酶Basic 1(PB1)蛋白相互作用并调节病毒感染，16而Hsp 70已被证明能抑制流感病毒的复制。17流感病毒的非结构蛋白1(Ns1)蛋白也被证明能抑制hsp 70前mRNAs的切割，形成成熟的mRNAs。18此外，与大多数真核细胞病毒一样，流感病毒也会同时诱导细胞凋亡。离体和在体内。19, 20为了对抗感染早期的细胞凋亡，病毒编码的NS1蛋白被证明可以调节抗凋亡蛋白。21然而，在感染后期，聚合酶碱性1(pb1-f2)蛋白片段2易位于线粒体膜，导致膜电位去极化，释放细胞色素。c(共青团)c)和激活caspase-9介导的内源性凋亡途径。22,23RNA病毒感染过程中，干扰素-调节因子-3介导的Bax活化也激活了线粒体凋亡途径。24

甲型流感病毒M1是一种磷酸化的252氨基酸(AA)，是一种主要的结构蛋白，它与核蛋白核心紧密相连，与膜膜和穗糖蛋白细胞质尾相互作用。25M1蛋白与热休克同源蛋白70(HSC 70)直接结合.26因为hsp 70是hsc 70的结构同源体，并且也被证明可以调节caspase-9的激活，13, 14, 15, 27, 28推测M1可能与HSP 70相互作用。因此，在本研究中，我们通过共沉淀实验分析了M1和HSP 70蛋白之间可能的相互作用。利用缺失突变体鉴定了Hsp 70和M1中负责这种相互作用的结构域。研究证实M1蛋白与HSP 70的结合破坏了Hsp70-Apaf-1复合物，导致功能凋亡小体的形成和caspase-9的激活。总之，研究结果强调了病毒编码蛋白在调节细胞蛋白质中的重要作用，从而为细胞防御机制的开发提供了有益的帮助。

M1增强cyt介导的caspase活化c

A 549人肺上皮细胞瞬时转染m1小干扰RNA(SiRNA)(60 Nmol)或待处理24h后感染APR 8株(A/波多黎各/8/34)。以合成底物四肽Leu-Glu-His-Asp与7-氨基-4-甲基香豆素(LeHD-AMC)结合，检测caspase-9活性。在m1-siRNA处理和PR8病毒感染的细胞中，caspase-9酶活性在感染后14小时(H.P.I.)显著下降(≈为18倍)。与仅受病毒感染的细胞相比(图1a)。同时，m1-siRNA处理细胞(24.6荧光单位)中caspase-3的活性也比仅受病毒感染的细胞降低了8倍。图1b)。免疫印迹进一步证实caspase-9(p37/p35)和caspase-3(p20/p17)的裂解产物在PR8病毒感染细胞中较高水平，而M1-siRNA和病毒感染细胞(m1-siRNA)和病毒感染细胞(m1-sirna)和病毒感染细胞(m1-siRNA-和病毒感染细胞)则不存在。图1c)。有效下调M1m1-siRNA基因经免疫印迹分析证实。图1d)。提示M1蛋白在甲型流感病毒诱导的细胞凋亡中起重要作用。在甲型流感病毒复制过程中激活caspase-9是很重要的，因为在Caspase-9和caspase-3抑制剂Z-lehd-FMK的存在下(N-benzyloxycarbonyl-LEHD-methyl-fluoromethylketone衍生物)和Z-DEVD-FMK(benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone)，病毒复制在A 549细胞中明显降低(数据未显示)。

M1在A/PR8流感病毒感染过程中参与线粒体介导的caspase激活。(a和b)A 549细胞转染对照siRNA或M1siRNA(60 Nmol)和24h后感染1 m.o.i。流感病毒A/PR8的多重感染。用酶解法测定了Caspase-9和Caspase-3的活性.结果代表了三个独立的实验。值表示一个实验的平均值±S.D值，并进行了三次测量。(c用免疫印迹法检测Caspase的表达。指出Zymogen和卵裂产物。(d)用免疫印迹法检测PR8感染细胞和m1 siRNA处理的PR8感染细胞在一定时间内m1的表达。

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虽然这一结果提示M1蛋白在病毒诱导的细胞凋亡中起着重要作用，但尚不清楚M1蛋白本身是否是一种凋亡因子，是否与其他流感病毒蛋白协同发挥作用。此外，m1-siRNA可能间接导致病毒复制减少，从而影响caspase-9的激活.为了克服这个问题，M1在pcDNA6(PCD-M1)中克隆基因，并在293 T细胞中瞬时表达。作为阴性对照，瞬时转染空载体(PcDNA6)。转染48h后，用stauroporine(1)处理细胞。μ用荧光法和免疫印迹法检测caspase-9的活性。在对照组和pcd-m1转染细胞中，stauroporine处理均导致caspase-9和caspase-3的激活和断裂。图2a和b)。然而，pdd-m1表达细胞在处理后2 h就有4倍高的活性。图2a和b)。当细胞提取物免疫插槽时，m1表达细胞中caspase-9、caspase-7和caspase-3的裂解率明显高于对照组(P<0.05)。图2c)。同样，在stauroporine处理后，pdp-ribose聚合酶(papp-ribose)聚合酶(PARP)的裂解片段(85 KDa)在pcd-m1转染细胞中早于空载体对照组(6h)观察到。图2c)。这些结果共同证实了M1蛋白的促凋亡作用。

M1介导Stauro业碱诱导293 T细胞caspase的早期激活。(a和b将293 T细胞瞬时转染空对照载体(pdd-m1)，对照组未处理36h，转染细胞用stauroporine(1)处理。μm，6小时)。对对照组293 T细胞的细胞裂解液中caspase-9和caspase-3的实际酶活性进行了荧光定量测定，并与DEVD-AFC的切割时间进行了比较，结果表明，Stauroporine处理的293 T细胞中有caspase-9和caspase-3的活性。结果代表了三个独立的实验。值表示一个实验的平均值±S.D值，并进行了三次测量。(c用全细胞裂解物对caspase-9、caspase-7、caspase-3和PARP进行免疫印迹。β-肌动蛋白作为内部负荷控制

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m1与hsp 70蛋白结合，破坏hsp 70-apaf-1的相互作用。

为了分析HSP 70与M1之间的相互作用，将PR8感染后的全细胞裂解物用抗Hsp 70多克隆抗体免疫沉淀，再用M1抗体免疫印迹。如图所示图3a，用内源性HSP 70免疫沉淀M1蛋白。此外，M1抗体的相互免疫共沉淀和hsp 70抗体的免疫印迹也证实了这一协同作用。图3a，3号线)。

在PR8感染期间，M1结合破坏了Hsp 70与Apaf-1的结合，在没有其他病毒蛋白的情况下也是如此。(a用抗Hsp 70抗体从PR8感染A 549提取物中免疫沉淀(IP)，检测抗M1抗体(RAN 2)的相关蛋白。在使用抗M1抗体的互惠免疫共沉淀中，HSP 70与M1(RAY 3)共沉淀.(b分析了Hsp 70与Apaf-1在8~26 H.P.I感染PR8过程中的相关性。用抗HSP 70抗体免疫沉淀，然后用抗Apaf-1抗体免疫印迹.同时，在stauroporine处理的细胞中评估hsp 70-apaf-1的联合作用(1)。μm)。在流感感染过程中，Hsp 70与Apaf-1之间的联系被破坏，而Apaf-1与Hsp 70免疫沉淀在Stauroporine诱导的细胞凋亡中被破坏。(c将m1-siRNA(50 Nmol)转染A 549细胞，在PR8感染前未处理36h。14例H.P.I.后，用Apaf-1抗体进行免疫沉淀，以确定与Hsp 70的M1结合是否破坏了Apaf-1与Hsp 70的结合。结果表明，在PR8感染过程中，当M1被siRNA下调时，Apaf-1-Hsp 70结合不受影响。(d293 T细胞被模拟转染或转染pdd-m1结构，然后继续处理36h，然后再加入stauroporine(1)。μm，6h。细胞裂解液用抗Hsp 70抗体免疫沉淀，用抗M1抗体免疫。同时，用免疫共沉淀Hsp 70分析了Hsp 70与Apaf-1的关系，并对Apaf-1进行了探讨。与对照组相比，PCD-M1转染细胞的Apaf-1与Hsp 70的相关性降低.免疫球蛋白G作为负荷对照。(e)进一步免疫沉淀和检测hsp 70，以探讨apaf-1在pdd-m1转染细胞中的作用。

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先前的研究表明，Hsp 70与Apaf-1直接结合，从而抑制其寡聚和促天冬氨酸酶-9的合成。14, 15为了了解M1与Hsp 70的相互作用是否影响Apaf-1-Hsp 70的相互作用，细胞要么用葡萄球菌素处理，要么感染PR8株(8、14、20和26h)，或者置之不理。用抗Hsp 70抗体免疫沉淀全细胞提取物，再用Apaf-1抗体免疫印迹。在未处理的和未处理的Staurospine细胞中，apaf-1与hsp 70共沉淀，而在PR8病毒感染的细胞中观察到弱的或无共沉淀的免疫共沉淀。图3b)。结果证实了Hsp70-Apaf-1相互作用在流感病毒感染过程中的抑制作用.为探讨甲型流感病毒感染细胞中Hsp70-Apaf-1的解离是否是M1蛋白所致，在m1-siRNA存在下进行了实验。未转染或m1-siRNA转染细胞用PR8株感染14h，用Apaf-1抗体免疫沉淀细胞提取物。用hsp 70抗体免疫印迹显示hsp 70与apaf-1在m1 siRNA处理细胞中的免疫共沉淀显著增加。图3c)，与缺乏m1-siRNA的不良关联相比较(图3c提示在流感病毒感染过程中，M1-Hsp 70相互作用可能导致Hsp 70与Apaf-1的关联减少。此外，为了证实M1是否直接或间接抑制Hsp70-Apaf-1相互作用作为多蛋白复合物的一部分，在PCD-M1或pcDNA-6转染的293 T细胞中进行了免疫共沉淀实验。36h后，用Stauroporine(1)处理细胞。μ(M)用抗Hsp 70抗体免疫全细胞裂解物，用抗M1和抗Apaf-1抗体免疫。在m1-高表达细胞中，hsp 70和m1共免疫共沉淀。图3)证实先前的结果(图3a)，而在对照组细胞中，与hsp 70共沉淀的apaf-1免疫共沉淀水平显著升高(图3)。在apaf-1抗体的相互免疫沉淀中，hsp 70与apaf-1共沉淀在m1表达细胞和对照细胞中。图3e而在m1表达细胞中，apaf-1和hsp 70的相互作用显著减少(>3.0倍)。图3e证实M1蛋白可直接与Hsp 70结合，从而使Hsp70-Apaf-1复合物在没有甲型流感病毒感染的情况下减少。

M1抑制HSP 70介导的细胞周期蛋白的下调c-诱导caspase-9活化

m1抑制hsp 70、cyt抗凋亡作用的机制探讨c-诱导caspase活化离体使用Jurkat细胞无细胞提取物的系统。29利用Jurkat细胞提取物，证明这些细胞具有低水平的基础Hsp 70表达。13加入Cytc三磷酸脱氧腺苷(DATP)诱导caspase-9和caspase-3的激活，这是由与7-氨基-4-三氟甲基香豆素(DEVD)结合的caspase-amc和Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)结合的结果。图4a和b)。纯化Hsp 70(3.58)μ(M)蛋白质与细胞周期蛋白(Cyt)一起添加。cdATP对caspase活性有显著抑制作用(图4a和b)。然而，当重组m1蛋白(10)μ(g/ml)与纯化的hsp 70、cyt同时加入。c/dATP诱导的caspase活化恢复(图4a和b)。同样，37 kDa(caspase-9)和19/17-kDa(caspase-3)片段仅在cyt中被发现。c/dATP和in M1/Hsp 70/cytc/dATP处理，但不包括hsp 70/cytc用免疫印迹法评价dATP处理的细胞提取物(图4c)。这些结果表明M1相互作用抑制了Hsp 70介导的对病毒感染过程中内在通路的抑制作用。

M1抑制HSP 70介导的caspase在无细胞系统中的激活。(a和b)用细胞色素孵育Jurkat T细胞的胞浆提取物c(10μm)和dATP(1毫米)，是否有重组人HSP 70(3.58)μM)和或重组m1(10)μg/ml)。用荧光定量法测定了Caspase-9和Caspase-3的切割活性。结果代表了三个独立的实验。值表示一个实验的平均值±S.D值，并进行了三次测量。(c)用免疫印迹法检测细胞色素对Caspase的切割作用。c(10μm)和dATP(1毫米)，是否存在重组Hsp 70(3.58)μM)和重组M1(10)μg/ml)

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PR8病毒感染细胞Hsp 70 mRNA和蛋白水平的调控

如果Hsp 70能抑制病毒感染后细胞的凋亡，那么病毒就可能诱导Hsp 70的表达，从而成功地完成其生命周期。在PR8病毒感染的不同时间点，采用实时PCR方法检测细胞核和细胞质中Hsp 70 mRNA的表达水平。核内Hsp 70 mRNA表达显著增加(20 hP.I.>30倍)。观察到(图5aHsp70mRNA在细胞质中呈稳定但轻微的下降(≈为1.5倍)。图5a)。同时，在8-26 H.P.I期间，热休克因子-1转录本稳定地增加了两倍。(图5b)。作为甲型流感病毒复制的衡量标准，M1基因分析。重大归纳M1感染后观察到转录量(20~150倍)随感染时间的延长而增加。图5c).

Hsp 70在病毒表达过程中的表达调控。(a)用TRIzol试剂从PR8感染A 549细胞的细胞核和细胞质组分中提取RNA。实时PCRHSP 70用SYBR绿色试剂进行基因检测。核内Hsp 70 mRNA水平在14~20 H.P.I时增加25~35倍。在细胞质中，PR8感染(8-26 H.P.I.)后，Hsp 70转录本下降1.5~2倍。(b)同时，HSF 1转录本在整个病毒感染过程中增加了1.8~2.2倍。(cm1 mRNA水平在14~26 H.P.I时增加了80~140倍。(d用免疫印迹法检测PR8感染过程中HSP 70蛋白的表达。在8~20 H.P.I.时显著增加(3-3.5倍)，26 H.P.I时出现下调。

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病毒感染细胞后HSP 70蛋白水平的升高已被广泛观察到。17, 30与细胞核内hsp 70转录本的显著增加不同，8-20 H.P.I.后，hsp 70蛋白仅增加了2.5至3.5倍，随后下调(图5d)，这与上一次报告是一致的。17, 18在感染后期，观察到基础表达水平(数据未显示)。

M1与Hsp 70的SBD结合

Hsp 70的C端区有一个调控的EEVD基序，已被证明是其活性的关键。缺失(Hsp 70Δ)或用丙氨酸残基取代4个C端AA(Hsp70AAAA)破坏了其分子内调控和分子间相互作用。31pfLAG-CMV 6-M1与PCD-Hsp 70或Hsp 70突变体(PCD-Hsp70ΔEEVD或PCD-Hsp70AAAA)共转染293 T细胞。用抗国旗抗体免疫沉淀全细胞提取物后，只有天然的hsp 70共沉淀。图6a，2号线)。突变体Hsp70AAAA和Hsp 70Δ在细胞环境中不能与M1结合。图6a)。为了证实在无细胞条件下蛋白质的直接相互作用，将天然的HSP 70、Hsp70AAAA和Hsp 70ΔEEVD蛋白固定在镍珠上，然后与M1蛋白或模拟对照组共同孵育。用抗M1抗体免疫印迹显示M1与天然Hsp 70相关，但与Hsp70AAAA或HSP 70Δevd蛋白无关。图6b)。这些结果证实了Hsp 70底物结合区(SBD)的C端EEVD结构域对其与M1的相互作用至关重要。

HSP 70的EEVD基序与M1的128-165AA结合。(apfLAG-cmv 6-m1共转染293 T细胞pdd-hsp 70、pcd-hsp 70 aaa或pcd-hsp 70Δeevd，以评价evd基序在培养293 T细胞中的作用。体内绑定。用抗国旗抗体进行免疫沉淀，以降低标志M1蛋白的表达.免疫印迹显示只有天然Hsp 70与M1一起沉淀，而与突变体无关。(b)EEVD基序在M1结合中的重要作用离体结合试验纯化hsp 70、hsp 70aaa或hsp 70Δevd蛋白(10)μ(G)预固定在Ni上。+2在4°C的HBS缓冲液中，用重组m1蛋白(5)孵育微球。μg)，洗涤后用抗M1抗体免疫蛋白。只有天然Hsp 70与M1蛋白直接结合。(c)本研究中使用的M1缺失突变体的示意图。删除的氨基酸用虚线表示。(d转染空载体(对照)的293 T细胞，或含有野生型m1 cDNA或面板中描述的突变体的载体后，hsp 70的免疫检测。c(左面板)。免疫印迹法证实野生型和突变型M1蛋白在293 T细胞中的表达

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m1的c-端基序与hsp 70相互作用，导致caspase-9活化。

Hsp 70的C端区参与了M1的结合，因此，为了鉴定与此结合有关的M1蛋白的区域，我们构建了M1的缺失突变体。图6c)基于上一份报告。26293 T细胞瞬时转染空载体或PFLAG-M1或M1突变体(图6d)。共沉淀实验表明，缺失突变体Δ128-165和Δ128-201与hsp 70没有结合，而突变体Δ101-127、Δ101-150和Δ166-201与hsp 70的结合效率与野生型m1(图6d)。所有未免疫沉淀hsp 70的m1突变体也丧失了诱导Stauroporine介导的caspase-9和caspase-3激活的能力。表1)。将纯化的M1、M1Δ101-127和M1Δ128-165蛋白固定在镍微球上，与HSP 70孵育。结果表明，与野生型m1蛋白和突变体m1Δ101-127蛋白不同，突变体m1Δ128-165蛋白不与hsp 70蛋白结合。图7a)。此外，在hsp 70免疫缺陷Jurkat细胞提取物中，apaf-1与hsp 70蛋白共沉淀在突变体m1Δ128-165的存在下，而野生型m1则破坏了这种结合(图7b)。此外，在突变体Δ128-165蛋白的存在下，在补加cyt的无细胞提取物中没有发现caspase-9的激活。c/dATP和HSP 70(图7c)。这些结果共同证实了M1蛋白C-末端区(AA 128-165)在Hsp 70结合和诱导凋亡中的作用。

氨基酸128-165负责与hsp 70直接结合，防止apaf-1结合，并协助细胞色素诱导caspase-9的加工。c/ATP。(a)His标记的m1或m1Δ128-165(10μ(G)固定在Ni上+2在4°C的HBS中过夜，然后用重组Hsp 70洗涤并孵育(10)μ(G)4°C作用4h，免疫印迹法检测Hsp 70。野生型HSP 70与原生M1相关，而与M1Δ128-165无关。(bJurkat细胞提取物在未加入重组Hsp 70和M1或M1Δ128-165蛋白的基础上进行免疫沉淀。当原生M1存在时，HSP 70与Apaf-1无关联，但在M1不存在或M1Δ128-165蛋白存在时，HSP 70与Apaf-1无关联。(c)重组m1的加入增强了dATP或ATP和细胞色素诱导的proaspase-9的加工。c在野生型hsp 70存在的Jurkat细胞提取物中，当m1Δ128-165蛋白存在时，caspase-9的激活受到抑制。

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病毒利用现有的细胞机制来调节自己的基因表达。病毒基因根据病毒生命周期不同阶段的需求进行翻译。例如，在流感病毒感染期间，核蛋白和ns1蛋白的合成在感染早期是有利的，而哈, 纳, PB1-F2和M1基因延迟了。32NS1已被证明能在早期阶段防止细胞凋亡和干扰素的诱导，21而pb1-f2破坏线粒体功能，导致细胞周期的释放。c细胞凋亡促进病毒后代在感染后期的有效传播。22, 23同时，caspase-9的激活与M1的表达在14 H.P.I时也有一定的相关性。(图1c和d)。m1的促凋亡作用被证实，因为病毒诱导caspase-9和caspase-3的激活在m1-siRNA的存在下受到抑制，而在表达m1蛋白的细胞中，stauroporine等凋亡诱导剂诱导的细胞凋亡显著增加。图2).

HSP伴侣蛋白在病毒进入、复制、转录、病毒组装、翻译调控、转化以及感染过程中主要是蛋白质折叠和成熟等方面的功能作用得到了充分的证实。10,33增加了HSP 70病毒感染过程中的基因也有报道。30在本研究中，我们观察到细胞核内hsp 70 mRNA呈时间依赖性增加(25-40倍)，而细胞质中则无明显的时间依赖性增加(25-40倍)。图5a)。可以推测ns1蛋白抑制前mRNAs向细胞质转运的能力。18可能导致Hsp 70转录本在细胞核内积聚。此外，在8~20 H.P.I.时，仅观察到HSP 70蛋白的2.5~3.5倍的上调，随后在随后的时间点出现下降(图5d)，这与上一次报告是一致的。17尽管细胞质中的转录本水平较低，但细胞内HSP 70蛋白的水平增加但稳定，这可能是由于Hsp 70蛋白和转录本在细胞应激期间的稳定性增加，从而维持细胞内稳态。34, 35然而，病毒感染后细胞内hsp 70蛋白的水平也受到严格的调节，因为热诱导细胞中病毒的产生受到抑制。10

根据以前的报告和我们的结果，我们注意到四个观察，即(1)流感病毒在感染后细胞中诱导包括HSP 70在内的应激蛋白30 (图5a和d(2)在应激条件下，Hsp 70被上调时，通过与Apaf-1结合，抑制细胞凋亡，从而抑制凋亡小体的形成和caspase-9的合成，但Hsp 70的基础水平在功能凋亡小体的组装过程中起着重要的作用。13, 14, 15(3)在甲型流感病毒感染过程中，m1蛋白调节caspase-9和cyt的活化。c-介导的内在途径(图1a-c, 补充图S1)和(4)M1蛋白与Hsp 70的同源基因Hsc70结合。26因此，我们推测M1可能与HSP 70结合，调节其抗凋亡功能，从而增强caspase-9的活性。免疫共沉淀实验表明，m1蛋白通过病毒感染或表达载体与hsp 70结合。图3, 补充图S2)。在M1蛋白存在下，Hsp70-Apaf-1相互作用显著减少.与caspase激活结果一致(图1a-c)，在m1-siRNA存在下，hsp 70-apaf-1结合恢复(图3c)。在无细胞系统中，纯化的m1蛋白在hsp 70、cyt存在的情况下恢复caspase-9的活化。c和dATP(图4a-c进一步证实Hsp 70与M1直接相互作用是抑制Hsp 70抗凋亡作用的重要机制。这些结果与以往报道一致，即在高浓度时，Hsp 70具有抗凋亡作用，其原因可能是Hsp 70/Apaf-1分子质量较高的聚集物的形成，也可能是由于凋亡小体构象的改变，从而阻止了caspase-9的形成。13, 14, 15根据我们的研究结果，可以推测病毒编码蛋白M1能猝灭病毒感染引起的细胞内过量的HSP 70，从而形成Apaf-1介导的凋亡小体，诱导细胞凋亡。细胞凋亡是病毒正确传播的必要条件，甲型流感病毒也是如此，例如在Caspase-9和Caspase-3抑制剂的存在下，病毒复制和感染受到抑制(数据未显示)，这与以前的报道是一致的。36在pr8诱导的细胞凋亡过程中，apaf-1-hsp 70的结合水平仍然较低，因为生理水平的hsp 70对apaf-1和cyt是必需的。c-介导的功能性凋亡小体形成。14

的删除突变体HSP 70基因(图6a和b)证实了Hsp 70 C端酸性区与M1相互作用的意义，该区域只能与全长Hsp 70蛋白结合，而与Hsp70AAAA或Hsp70EEVD不结合。Hsp 70的极端C-末端调节型EEVD基序是其ATP酶活性和底物结合所必需的，在Hsp 70家族中高度保守。31

M1蛋白的RNA结合域(AA 76-103)并不是必需的，而AA 102-201是M1-HSC 70结合的必需结构域。26以此为参照，构建了跨AA 101-201区的M1缺失突变体。此外，还利用Limbo软件对M1上的Hsp 70结合位点进行了预测。http://limbo.vub.ac.be/)，一种识别蛋白质中伴侣结合位点的算法。该算法利用Hsp 70细菌同系物(DnaK)与纤维素固定化肽结合的数据，以及基于序列或位置特异性评分矩阵的数据。37Hsp 70的结合基序由一个疏水核心4~5个残基组成，这些残基主要富集于亮氨酸、异亮氨酸、缬草碱、苯丙氨酸、酪氨酸和两个两侧碱基残基，补充了整个带负电的DnaK表面。38预测了4个最可能的DnaK结合基序，除AA 128-134外，其余3个被我们的缺失突变实验排除在外。如图所示图6d128-201和128-165的M1突变体不能免疫沉淀Hsp 70。阻止m1-hsp 70相互作用的突变体未能激活caspase-9(图7c)，进一步提示这种相互作用是M1在感染过程中的凋亡效应所必需的。此外，由于hsp 70与apaf-1的细胞caspase募集域(CARD)结合，15它在M1蛋白的AA 128-165区与卡片基序之间有一个或多个共同的功能域。真核线性基序http://elm.eu.org/)程序预测了两个共同的域-结合基元的出现。叉头相关结构域1-结合基序跨越137-143 AA和PSD-95，DLG，ZO-1/2结构域3(PSD-95，DLG，ZO-1/2结构域3)-结合基序跨越151-154 aa，表明Apaf-1和M1都是Hsp 70的结合伙伴。

除caspase-9外，Hsp 70还参与其他凋亡信号级联的干预，如Caspase-8、c-Jun N-末端激酶(JNK/SAPK)和凋亡信号调节激酶1的激活。39由于caspase-8在A型流感感染过程中被激活，其干预可阻止BH3相互作用的结构域死亡激动剂(Bid)被切割成TBID(截断BH3-相互作用的结构域死亡激动剂)，从而抑制内源性途径的扩增。补充参考资料)。然而，在caspase-8抑制剂存在的情况下，PR8感染仍然激活caspase-9，表明它与caspase-8的激活无关。补充图S3)。因此，虽然本研究的结果集中于M1介导的caspase-9的激活，这是由于Hsp70-Apaf-1相互作用减少并导致凋亡的激活，但M1抑制Hsp 70的抗凋亡活性可能与其整体的凋亡功能有关。此外，在m1-siRNA存在下，JNK/SAPK的Bid断裂和磷酸化被抑制。补充图S4)。总之，研究结果证实了病毒编码蛋白在病毒感染期间调节多种宿主应激反应途径中的重要作用。

病毒、细胞和病毒感染

在MEM、Ham‘s F12、DMEM和RPMI 1640培养基中，分别添加10%热灭活胎牛血清(2mm)，培养人肺泡上皮细胞(A 549)、293 T细胞和Jurkat细胞。L-谷氨酰胺、2毫米丙酮酸钠和1×PSF(青霉素、链霉素和漏斗酮)，37℃，5%CO2...感染时，用磷酸缓冲液(Pbs)冲洗细胞，在指示的m.i处用PR8感染细胞。在含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS/BA中，1mm MgCl2，0.9毫米CaCl2青霉素、链霉素0.1mg/ml和青霉素100 U/ml，37°C下接种45 min，A 549或MDCK细胞分别在0.2%BSA和抗生素的培养基中孵育。用菌斑法测定细胞上清液中感染病毒的数量。40

矢量构造

利用具有以下限制性位点的引物构建了载体：

抗体、试剂和抑制剂

抗M1(SC-69824，SC-17589)和Cyt抗体c(SC-13560)是从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国)。β-Actin(551527)、Apaf-1(611365)、caspase-8(551244)和bax(610983)特异性抗体来自BD生物科学(美国圣地亚哥)。Caspase-9(9501，9502)，Caspase-7(9491，9491)，Caspase-3(9662，9664)，PARP(9541，9542)，Bid(2002)和FLAG(DYKDDDDK，2368)的抗体来自于细胞信号技术公司(Danvers，MA，美国)。HSP 70抗体来源于美国上等州(Billerica，MA)(NBPI-49250)和BD生物科学(554243)。所有抗体均在1：1000稀释时使用，抗m1和抗-1除外。β-肌动蛋白，1：500使用。(西格玛，圣路易斯，美国；S 5921)在1。μ米/毫升，而马-心脏囊肿c(Sigma，C 7752)在10μ在1mm/ml时使用ATP(nb，p0756S)或dATP(N0440S)，在80使用z-IETD-fmk(bd，550380)。μm/ml。

质粒和siRNA转染

293 T细胞、A 549细胞和Jurkat细胞均按制造商的指示转染Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)或SiPort-NeoFX(Ambion，奥斯汀，TX，USA)。自定义合成siRNA(5‘-CTCCATTGCCTGA-3’)M1来自Dharmacon(美国CO，Lafayette)。对照siRNA来自齐根(德国希尔登)(全星阴性对照，1027280)。

westernblot分析

用TOTEX缓冲液(pH7.9，0.35M NaCl，20%甘油，1%NP-40，1mMMgCl)提取总蛋白。2、0.5毫米EDTA、0.1毫米EGTA、50毫米NaF及0.3毫米Navo3含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的混合物。免疫印迹用特异性抗体进行，用ECL Westernblotting检测试剂盒(米利波，Billerica，MA，美国)进行可视化。

细胞分馏

制备无细胞核和线粒体的胞浆提取物。简单地说，细胞用冰凉pbs(pH 7.2)洗涤，然后用低渗萃取缓冲液(HEb：50 mm管道pH 7.4，50 mm kCl，5 mm EGTA，2mm MgCl)洗涤。2、1mm二硫苏糖醇和0.1mm苯甲基磺酰氟(PMSF)离心。球团被重新悬浮在胚轴中，并在一台道斯均化器中溶解。该细胞裂解液在16000×离心条件下离心30 min。g在4℃下，立即检测澄清上清液，或将其保存在−80°C.用冰冷缓冲液A(250 mm蔗糖，20 mm HEPES，10 mm KCl，1.5mm MgCl)再悬浮细胞制备线粒体组分。21 mm EDTA，1mm EGTA，1mm DTT，17 mg/ml PMSF，8mg/ml抑肽酶，2mg/ml亮肽(pH7.4)，在波特-托马斯匀浆器中进行匀浆。原子核以10分钟750的速度被球团化。g旋转。上清液为10000×g在A缓冲液中再悬浮25 min，在10000×离心条件下离心。g25分钟。将线粒体微丸重新悬浮，置于含7 M尿素、2 M硫脲、4%CHAPS、120 mm二硫苏糖醇(DTT)、2%两性电解质(pH 3-10)和40 mm Tris-HCl的缓冲液中30 min。

免疫共沉淀

用冰凉的PBS洗涤细胞，然后在含有10 mm Tris(pH8.0)、170 mm NaCl、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂的溶液中溶解30 min。用离心法去除细胞碎片，在4°C下用抗FLAG或M1或Apaf-1和抗Hsp 70抗体孵育，再用蛋白A-Sepharose孵育4h，用1 ml洗涤缓冲液(200 mm Tris，pH8.0，100 mm NaCl和0.5%NP-40)冲洗4次。用SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白，用12%SDS-PAGE凝胶分别用抗Hsp 70和M1或Apaf-1抗体免疫印迹。

定量实时PCR

总RNA是根据制造商的指示用TRIzol(Invitrogen)提取的。用TRIzol法从4°C分离的细胞核和细胞质提取液中分离出细胞核和细胞质RNA。以1-2为原料制备cdna。μ用随机引物对RNA进行上标Ⅲ逆转录酶(Invitrogen)。采用SYBR Green(应用生物系统，福斯特市，美国)进行实时PCR反应(50°C 2 min，95°C 10 min，95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 10 min)。可根据要求提供引物序列。

蛋白表达与纯化

蛋白在c41(DE3)株中的表达大肠杆菌细胞在37°C下培养至OD 600为1.0，然后用0.5或1.0mm异丙硫代氨基乙酸苷诱导，4h后进一步孵育，球状细胞在缓冲液A(8M尿素，0.1M NaH)中溶解。2阿宝40.01MTris-Cl，pH8.0)离心。用缓冲液A洗涤树脂，裂解上清液通过Ni-NTA自旋柱。用缓冲液B(8M尿素，0.1M NaH)洗涤Ni-NTA自旋柱。2阿宝4，0.01MTris-Cl，pH6.3，最后用洗脱缓冲液(8M尿素，0.1M NaH)洗脱结合蛋白。2阿宝4，0.01MTris-Cl，pH4.5)。洗脱后的蛋白经透析后被还原成天然构象。离体结合试验。透析缓冲液含尿素(8，6，4，2，1和0M)，还原谷胱甘肽5 mm，氧化谷胱甘肽0.5 mm，甘氨酸50 mm，pH 9.0，EDTA 5 mm，甘油10%，葡萄糖10%，蔗糖10%，NaCl 250 mm，MgCl 2 mm。2，50 mm HEPES-KOH(pH7.5-7.9)，0.5mm PMSF，2μg/ml抑肽酶和5μg/ml白蛋白胨。蛋白质在−80°C下保存，经肠激酶裂解(EK：底物比为1：42，温度为50 mm Tris，pH为7.6，加入1mm PMSF，95°C加热10 min，再通过Ni-NTA柱去除His标记)。

无细胞提取物的制备离体caspase活化

用离心法收集Jurkat细胞，用冰冷PBS洗涤两次.细胞颗粒在相同体积的HEB中再悬浮，在冰上孵育15 min，加入5%NP-40后，用10 s的强涡溶解。然后以15000×离心5分钟。g，胞浆上清液保存于−70°C，内源caspase-9分别加入1mmdATP/ATP和10 mMdATP/ATP激活。μ马心囊肿c(西格玛)至胞浆提取物(300)μG蛋白当量)，在37℃下孵育。加入5×SDS负载缓冲液，煮沸5 min后，反应停止。不在场人士(50人)μ(G)用免疫印迹法检测caspase的处理情况。

caspase-9和caspase-3活性测定

来自对照细胞和m1 siRNA处理细胞的细胞裂解液感染r8，pdd-m1-转染的细胞或提取物离体caspase活化试验，按上述方法制备。用ApoAlert caspase荧光检测试剂盒(Clontech，山景城，CA，美国)分别用合成底物Lehd-AMC和DEVD-AFC测定实际Caspase-9和Caspase-3的切割活性。

离体重组M1与HSP 70的关系

重组天然M1和M1突变体(∼5 μ(G)以前固定在镍上2+在4°C的HEPES缓冲盐水(HBS)中隔夜孵育，在PBS/0.3%吐温中广泛洗涤去除未结合蛋白后，将M1蛋白与Hsp 70(10)共同孵育。μ(G)或Hsp70AAAA(10μ(G)在HBS中4°C作用4h。用HBS广泛清洗珠子以去除非特异性结合蛋白。用4×样品缓冲液分离剩余蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法对Hsp 70进行分析。同样，在互惠实验中，重组Hsp 70或Hsp70AAAA或Hsp70EEVD(∼5 μ(G)预固定在Ni上。2+，其次是M1的结合和免疫印迹(10)μ(G)蛋白质。

离体重组hsp 70、m1和突变体存在下proaspase-9的活化

CYTc(10μ(G)和dATP/ATP(1mm)在Hsp 70存在或没有Hsp 70(5毫米)的情况下孵育。μg)或Hsp70AAAA(5μ(G)或HSP 70(5)μg)和M1(10μ(G)或HSP 70(5)μ(G)和M1Δ128-165(10μ(G)胞浆Jurkat细胞提取物(50)μ在37°C时，hsp 70和m1蛋白在5℃下孵育30 min，然后再加入dATP/ATP和cyt。c加法。然后，用免疫印迹法评估Procaspase-9的切割.

统计分析

数据表示为至少三个独立实验的平均±S.D。n≥3)。在所有的测试中，P0.05被认为具有统计学意义。