质粒DNA的制备
【基本原理】
质粒（plasmid）是一种染色体外、具有双链闭环结构的DNA分子。质粒具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛地用作基因工程中目的基因的运载工具─载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA 也是一种分子生物学最基本的方法。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA为小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。质粒DNA提取方法有以下几种：碱变性法、溴乙啶-氯化铯密度梯度法、DNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层法及酸酚法。普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是，利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱变性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
【器材】
1.5ml Eppendorf 管、微量加样器、培养皿、台式高速离心机、高压灭菌锅
【试剂】所有的试剂均需高压灭菌（有机溶剂除外）
1．溶液I | 50mmol /L 葡萄糖，25mmol/L Tris -Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0） |
| 2．溶液II | 0.2mol/L NaOH，1%SDS， |
| 3．溶液III | 5mol/L 乙酸钾 60ml，3mol/L 冰乙酸 11.5ml，ddH2O 28.5mlpH 5.2 |
4．RNase A： | 10mg/ml |
5．TE缓冲液： | 1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0） |
6．Tris-Cl（pH8.0）饱和苯酚 | |
7．氯仿/异戊醇（v/v）： | 24/1 |
8．70%：乙醇 | |
9．LB/Amp： | LB/氨苄青霉素（50μg/ml） |
【操作步骤】
1．从选择性培养平板上取出一个菌落，移至含有2ml LB/Amp培养基的试管中。在37℃条件下振荡培养12-16h。
2．将1.5ml培养物移至1.5 ml Eppendorf管中，4000 rpm离心8min。
3．弃上清，将细菌沉淀悬浮在100μl预冷的溶液I中，并加入2.5μl RNase A（10mg/ml）。
4．加200μl新配制的溶液II, 盖紧管口。快速颠倒离心管5次使内容物混合、放置冰上5min。
5．加150μl预冷的溶液III，盖紧管口。将管颠倒5-8次，冰上放置20min。
6．离心（1000rpm，4℃，5min），将上清转移到另一离心管中。
7．加等体积苯/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心同上。
8．将水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min。
9．10 000rpm 4℃离心10min。
10．弃上清，加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，离心弃上清，在空气中使质粒DNA干燥10min。
11．将质粒DNA溶于20μl，ddH2O中，4℃保存。
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