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质粒DNA的制备

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发表时间:2019-05-10 11:17作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

质粒DNA的制备

【基本原理】

质粒(plasmid)是一种染色体外、具有双链闭环结构的DNA分子。质粒具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。目前,质粒已广泛地用作基因工程中目的基因的运载工具─载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA 也是一种分子生物学最基本的方法。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA为小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。质粒DNA提取方法有以下几种:碱变性法、溴乙啶-氯化铯密度梯度法、DNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层法及酸酚法。普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是,利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱变性条件下(pH 12.6),染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA

【器材】

1.5ml   Eppendorf 管、微量加样器、培养皿、台式高速离心机、高压灭菌锅

【试剂】所有的试剂均需高压灭菌(有机溶剂除外)

1.溶液I

50mmol /L   葡萄糖,25mmol/L   Tris -ClpH8.0),10mmol/L EDTApH8.0

2.溶液II

0.2mol/L   NaOH,1%SDS,

3.溶液III                 

5mol/L   乙酸钾 60ml,3mol/L   冰乙酸 11.5ml,ddH2O   28.5mlpH 5.2

4RNase A

10mg/ml

5TE缓冲液:

1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-ClpH8.0

6Tris-ClpH8.0)饱和苯酚


7.氯仿/异戊醇(v/v):

24/1

870%:乙醇


9LB/Amp

LB/氨苄青霉素(50μg/ml

【操作步骤】

1.从选择性培养平板上取出一个菌落,移至含有2ml LB/Amp培养基的试管中。在37℃条件下振荡培养12-16h

2.将1.5ml培养物移至1.5 ml Eppendorf管中,4000 rpm离心8min

3.弃上清,将细菌沉淀悬浮在100μl预冷的溶液I中,并加入2.5μl RNase A10mg/ml)。

4.加200μl新配制的溶液II, 盖紧管口。快速颠倒离心管5次使内容物混合、放置冰上5min

5.加150μl预冷的溶液III,盖紧管口。将管颠倒5-8次,冰上放置20min

6.离心(1000rpm45min),将上清转移到另一离心管中。

7.加等体积苯/氯仿/异戊醇,振荡混匀,离心同上。

8.将水相移至另一离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min

910 000rpm 4℃离心10min

10.弃上清,加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀,离心弃上清,在空气中使质粒DNA干燥10min

11.将质粒DNA溶于20μlddH2O中,4℃保存。


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