RA和SpA关节组织中差异表达基因的研究
我们首先优化了RNA捕获步骤，包括滑膜组织的组织渗透条件(附图)。S1a-C)。此后，我们将ST技术应用于滑膜组织切片(补充图)。S1C).
我们获得了大约900万个独特的转录本的位置信息，共捕获了6240个空间条形码点。3例中有2例RA切片大于SpA标本。RA组每个组织切片唯一定位基因数均高于SpA组(14500±815和12300±1550)。https://www.spatialresearch.org/resources-published-datasets/).
在第一种分析中，来自每个部分的空间数据被汇集成一个大数据集，包括来自所有组织切片的数据(每个病人三个)(图)。1A)。在这里，我们发现了796个在RA和SpA中的差异表达基因，使用的是log2倍变化>2和p-数值<0.01(https://www.spatialresearch.org/resources-published-datasets/和补充图。S4)。前20位差异表达基因(Degs)，按p-值，包括在RA组织中参与适应性免疫反应的上调基因，而在SpA组织中，编码更一般免疫介质的基因被上调(图1)。1B).
图1在分析整个组织切片时，比较RA和SpA中最高差异表达的基因，并与形态学上感兴趣的区域的预选进行比较。(A)一个例子，H&E染色的RA组织切片和斑点是局部转录体被捕捉到黑色。(B)在大量数据中有20个差异表达基因(Degs)的热图(没有预选聚类)，并按最低的顺序排列。p-价值观(自上而下)。颜色标记表示log 2的归一化表达值，只选择大于2倍的基因，其归一化表达值差异较大。每列代表一个区段，每个病人使用三个区段。所有区段都被视为散装，红色代表RA，蓝色代表SpA。同一活检组织切片聚在一起，水疗样本与RA标本明显不同。(C)用层次聚类法对同一组织切片和带注释的淋巴细胞浸润区进行红色标记，并进行无偏分析，显示哪些斑点属于不同的簇(用不同的颜色表示)。对于这个组织部分，黑色簇(第5组)代表与组织学注释(红色区域)联系最紧密的簇。(D))预选簇中前20个差异表达基因(Degs)的热图，重叠带注释的浸润，并按最低的顺序排列。p-价值观(自上而下)。颜色标记表示log 2的归一化表达值，只选择大于2倍的基因，其归一化表达值差异较大。每个列代表每个组织切片中的一个选定的簇，每个病人使用三个部分，红色代表RA切片，蓝色代表SpA。在体分析和浸润分析中，箭头都有差异表达的基因。
总之，这两种疾病都表现出明显的分子特征，RA与T细胞和TNF有较强的联系，而SpA组织则更多地表现为与软骨损伤和修复系统有关的过程。这些数据进一步支持了类风湿关节炎异位淋巴样结构(ELS)的证据和SpA的高和异常基因表达谱(图1)。1B).
单个核细胞浸润的差异基因表达谱
其次，对各组织切片的空间基因表达数据进行层次聚类。同时，在H&E染色的基础上，对单个核细胞的浸润进行了组织学注释，如图所示。1C...为了研究分子特征，我们选择了与浸润区相关的基因簇。我们假设通过比较RA和SpA在相似的形态学区域上的簇，可以获得更高分辨率的关键差异表达基因，从而驱动各自的炎症状态。使用这种方法，我们发现660个与浸润区相关的差异表达基因(https://www.spatialresearch.org/resources-published-datasets/和补充图。S5)。20个差异表达的基因在热图中显示出来(如图所示)。1D)，其中四个，CXCL 9，LTB，CXCL 13和CD3E，在大量的分析中也能看到，因此在RA组织中与SpA相比，在全球和局部都有过高的表达。RA单个核聚合体中的许多高表达基因包括CXCL 13, LTB，SP1和CD 37已知与生发中心和异位淋巴样结构有关，这些基因在SpA中缺失(图1)。1D)30,31...对于SpA来说，更高的表达PRG 4，这是由滑膜成纤维细胞和浅层软骨细胞产生，似乎也参与调节滑膜细胞增殖，以及编码分解和软骨降解标志的基因。32...此外，基因的上调TPPP3和FosB指示正在进行的细胞增殖、分化和转化。在所有以对数2倍为界的DEG中变化>2和p-值<0.01，体积分析和浸润分析均显示187。
我们还研究了基因簇，与浸润区域以外的区域相关，不包括脱细胞纤维区(补充图)。S6)。如前面所述，对这些区域进行了差异基因表达分析(DEA)。我们观察了RA和SpA在这些地区的不同特征。然而，与浸润分析相比，这些基因不完全相同，但仍与相似的功能相关。
差异表达基因的通路分析
在整群分析中，RA和SpA均有100个差异表达基因(虽然水平差异显著)，而670个基因仅在RA中表达，26个基因仅在SpA中表达。除了100个共有的基因外，RA和SpA基因列表中还有许多功能重叠的基因(如图所示)。2A)。基因本体论(GO)分析进一步表明，RA和SpA体分析中的共有基因与免疫功能相关的生物学过程(免疫应答的正调节、淋巴细胞活化、淋巴和非淋巴样细胞间的免疫调节相互作用以及细胞因子产生的调节)有关。2B)。此外，更多与适应性免疫反应有关的术语，如免疫突触的形成、淋巴细胞迁移和抗原受体介导的信号通路的调节等，在RA数据中被发现明显丰富。相反，SpA数据集丰富了细胞外基质组织、NABA核心Matrisome和通过质膜细胞粘附分子的嗜异细胞-细胞粘附等术语，反映了与细胞外基质相关的过程。
图2共同和独特的路径，突出在受影响的关节组织从RA和SpA。(A)Circos图显示来自硅中基于差异表达基因的批量分析。内圆圈的每一个片段代表一个基因列表，而每一个谱线都来自于一个基因。颜色深橙色覆盖基因出现在RA和SpA基因列表中，而浅黄色代表独特的基因。紫色线连接RA和SpA基因列表中共享的基因。蓝线将不同的基因联系在一起，它们属于同一个本体论术语。大量的连接紫色线以及一个长长的深橙色片段，因此意味着RA和SpA基因列表中存在广泛的重叠。(B)热图显示根据差异表达基因进行的元海景分析的前20条路径，排序如下p-价值。(C)与浸润相关的簇群的Circos图显示，较高的分辨率导致疾病中浸润基因之间具有较强的相似性，疾病内部具有较高的异质性。(D)热图显示了分析选定簇的前20条路径。聚类选择是基于与浸润性的关联。选择聚类所获得的较高分辨率揭示了与体分析不同的路径。箭头的路径重叠于体分析和浸润分析。
更具体地说，对大量数据的ipa分析表明，Th1和Th2激活途径以及调节信号在这两种疾病中都很突出(补充表)。沙一)。在RA中，独特的顶级典型通路包括T辅助细胞的ICOS-iCOSL信号、活化的T淋巴细胞和萎缩性T淋巴细胞中IL-2的表达、T辅助细胞的CD 28信号、T淋巴细胞的T细胞受体信号和PKCθ信号，反映了T细胞在RA发病中的重要作用。在SpA中，发现了多种典型途径，如肝自然杀伤细胞的杀瘤功能、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞在RA中的作用、动脉粥样硬化信号传导、基底细胞癌信号传导、肺泡介导的内吞信号和谷胱甘肽生物合成等，提示水疗过程中存在非免疫致病机制。上游调节因子分析也证实了RA和SpA分子机制的差异。在RA中，上游调整器包括IL-12、IL-21、IL-2、Ser体2和CD40LG，而SpA的上游调控器是：TGFβ1、IFNG、MAP3K14、SIRT 1和Alpha catenin(补充表)。S2，补充图。S7A).
在浸润分析中，RA和SpA均有112个差异表达基因(虽然水平差异显著)，而445个基因仅在RA中表达，103个基因仅在SpA中表达。除了112个共有的基因外，在RA和SpA基因列表中还有许多功能重叠的基因(如图所示)。2C)。RA与SpA浸润之间的功能重叠大于RA与SPA基因表之间的重叠。基因本体论(GO)分析进一步表明，浸润区的RA和SpA共有基因与淋巴细胞活化、白细胞迁移和调节细胞因子生成等生物学过程有关。二维空间)。在RA浸润区，丰富了与适应性免疫系统相关的T细胞选择、细胞对γ干扰素的反应、α-βT细胞活化的正调控和INFg产生的正调控等基因亚组。在SpA渗透数据集中，发现了与Naba核心Matrisome相关的基因的富集，类似于在批量分析中得到的结果。
此外，应用iPA进行的路径分析表明，T辅助细胞中的CD 28信号和辅助T细胞中的ICOS-iCOSL信号在浸润区的两种疾病中均表现为显著(补充表)S3)。在RA中，独特的顶级典型途径包括调节活化T淋巴细胞和萎缩性T淋巴细胞中IL-2的表达、Th1和Th2激活途径、T细胞受体信号转导、T淋巴细胞pkCθ信号转导、钙诱导T淋巴细胞凋亡和反映T细胞反应致病作用的OX 40信号通路。在SpA浸润区，存在以下独特的典型途径：RA中成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的作用、轴突引导信号、病毒通过细胞内途径进入、白细胞外渗信号、Cdc 42信号、巨噬细胞中CCR 5信号、NFAT在调节免疫应答和肝纤维化/肝星状细胞活化中的作用，再次显示了SPA中甚至在浸润区的非免疫致病机制的意义。
此外，在上游顶级监管机构中，在RA和SpA(补充表)中都发现了IFNG。S4，补充图。S7B)。RA浸润的上游调节因子为IL-2、CD3、NFKB 1和CD40LG.SPA浸润中独特的上游调节因子是TGF-B 1、Chuk、NOTCH 1、IRS 1、SIRT 1和GATA。
还对渗透区以外的区域进行了使用IPA和Metasscape的路径分析，见补充表S5和S6和补充图。S8.
使用XCell分配单元格类型
作为进一步显示组织异质性的一种手段，为了预测样本中的免疫细胞模式，我们使用了xcell。28算法，该算法显示预定的基因图谱组合相对丰富。我们选择了6种不同的免疫细胞特征，包括CD4和CD8系的中枢和效应记忆T细胞，以及类切换B细胞和血浆细胞。由于不同患者的组织切片具有高度异质性，对每种疾病的一个样本进行了X细胞分析，两者的形态与浸润所覆盖的斑点数(Spa-A1中的106-RA-B3和109个)具有相似的淋巴细胞聚集。
在RA标本中，浸润区包括CD4和CD8 T细胞系的T细胞。在B细胞方面，血浆细胞位于附加注释的浸润区之外，而切换的B细胞则位于聚集体的边界区域。这些结果与免疫组织化学或免疫荧光法对RA组织的许多研究中已知的数据是一致的。33...在研究效应T细胞亚群和中央记忆T细胞亚群(TEM和TCM)的相对分布时，两种CD4亚群明显重叠，而CD8亚群在空间定位上是相互作用的。事实上，CD8-Tem是与切换B细胞的位置最匹配的T细胞亚群(图1)。3)。为了验证X细胞的分布，我们用IHC分别在相同的RA活检切片中对CD3+T细胞和CD 138+血浆细胞进行染色，如图所示。3B、C...可以看到，我们的蛋白质染色和RNA标记是一致的。
图3RA淋巴细胞浸润在中枢记忆CD4、CD8 T细胞和CD4效应记忆T细胞中富集。(A)其中一例RA组织切片显示H&E染色切片的注释单个核浸润，以及可视化的转录数据，以显示不同的淋巴细胞亚群的定位，由Xcell(v1.1.0)方法，并视为空间热图的右侧。各个细胞子集的值是一个浓缩分数，显示每种细胞类型与每个单个组织切片中的其他区域相比的富集程度。注：无法比较各节单元格类型的数量。因此，这个数字不考虑重要数字。(B)用IHC对CD4+TCM图像上与灰箱相对应的附近区域T细胞(CD3-阳性)的分析验证Xcell数据的有效性。(A). (C)用IHC分析法验证Xcell数据(CD 138-阳性)，该数据来自与等离子体细胞图像上的灰盒相对应的区域附近的区域(CD 138-阳性)。(A)预期的倒数T细胞和血浆细胞分布。
在SpA样本中，CD4和CD8谱系的中央记忆T细胞相对缺失于注释的淋巴细胞区，而效应记忆亚群的信号清晰，尽管只有部分的空间重叠(图1)。4)。再一次，切换的B细胞和血浆细胞在组织中以相互作用的方式分布。
图4SPA淋巴细胞浸润富集于CD4效应记忆T细胞，缺乏中央记忆T细胞信号。SPA组织切片中的一个例子，说明H&E染色切片和附加注释的淋巴细胞浸润以及转录数据的可视化，以显示Xcell(v1.1.0)方法所指定的不同淋巴细胞亚群的定位，并将其视为右侧的空间热图。各个细胞子集的值是一个浓缩分数，显示每种细胞类型与每个单个组织切片中的其他区域相比的富集程度。注：无法比较各节单元格类型的数量。因此，这个数字不考虑重要数字。
因此，我们的形态学注释很好地代表了组织中T细胞丰富的区域，Xcell分析提供了一种重要的方法来指导根据与不同分化水平的淋巴细胞相关的特征选择感兴趣的区域进行更深入的分析。
