人工抗原提呈细胞(AAPCs)作为肿瘤免疫治疗药物在临床上的生产和广泛应用，受到了鉴定免疫原性肿瘤抗原和产生含有这些多肽的重组患者特异性主要组织相容性复合物(MHC)的限制。为了克服这些限制，在本研究中，我们测试了肽-MHCs是否可以直接从细胞裂解物中捕获，包括利用亲和珠从癌细胞中捕获，并用于启动T细胞反应。理论上，这些含有未知肽-mhc库的亲和珠可以与多种抗原特异性T细胞相互作用，促进抗癌反应。事实上，我们发现我们可以成功地从细胞裂解物中提取肽mhc，使用这种技术产生的aapc能够诱导抗原特异性的细胞毒性效应T细胞反应，从而导致离体和体内肿瘤细胞杀伤。总之，我们在这里提出了一种新的技术来产生特定于病人的aAPC，这种技术有可能在癌症疫苗领域产生革命性的变化，并在几天内以最低的成本向患者提供疫苗。

树突状细胞(DC)作为专业抗原提呈细胞，协调免疫的各个方面。1...DCS通过提出来自抗原(自我、肿瘤新抗原、外来抗原等)的肽表位来刺激和训练适应性免疫系统中的其他免疫细胞，如T细胞。在膜结合和分泌(细胞因子)形式上提供共刺激信号。1,2...这三个信号训练T细胞识别、破坏或容忍携带这些抗原的细胞。因此，毫不奇怪，DC是免疫治疗的主要目标。利用树突状细胞治疗癌症有两种主要策略。3...其中之一需要从血液和复合物中分离出患者的单核细胞。离体使用细胞因子和佐剂鸡尾酒进行分化和成熟为DC的操作，并与选定的抗原/细胞裂解物进行搏动，然后再注入病人体内。另一种方法是用抗体作为载体将抗原传递给DC。体内...然而，这两种方法的成功率都是有限的，主要是因为dc的功能高度依赖于肿瘤环境，往往是时间抑制性的。2,3.

人工抗原提呈细胞(Aasc)可能是活的dc的一种可行的替代品，因为它们不会对环境的线索作出反应。4,5,6,7,8,9,10,11...然而，研究人员将已知的、基因工程的和表达的肽MHC结合在珠子上以刺激T细胞反应，这一方法仅限于定义和选择MHC/肽复合物，这一事实限制了当今aAPC的发展。需要预先鉴定免疫原性肿瘤抗原和离体相应的患者特异性mhc-i单倍型的合成限制了aapc在临床上的广泛应用。12,13.

在这里，我们提出了另一种方法来生成基于AAPC的癌症疫苗，它不需要识别和离体肽-MHCs的生产。这是一个一步的过程，允许直接从病人来源的肿瘤细胞裂解物中捕获肽MHCs来生成aAPC。我们提出的实验证据，肽-MHC-I库的正常或肿瘤细胞可以成功地从细胞裂解物，利用亲和珠。使用这种技术产生的aAPC能够诱导抗原特异性的细胞毒性效应T细胞反应，从而导致离体和体内肿瘤细胞杀伤。综上所述，我们新的aAPC生产策略显示了革命性的基于AAPC的癌症免疫治疗的潜力.

小鼠

不是-我是2级的−/−CD8 TCR转基因小鼠OVA257–264(B6.129S6-Rag2tm1Fwa TG(TcraTcrb)1100 Mjb)在H-2kb和WT C57BL/6小鼠上购自Taconic生物科学(Rensselaer，NY)。实验以8~26周龄雌性和雄性小鼠为实验对象.小鼠被安置在微隔离笼中，喂食蒸压食品和酸化水。贝勒机构照料和使用委员会批准了所有的小鼠协议。所有实验均按照相关指导原则和规定进行。

细胞株

B16-OVA(表达截短OVA和GFP的B16F10 Tova GFP)和父母B16F10是Michael Gerner博士和Andrew Oberst(华盛顿大学)的礼物。HEK 293 T细胞系从ATCC(Manassas，VA)购买。细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(吉布科，格兰德岛，NY)中添加10%的FBS、1%的谷氨酸和1%的丙酮酸钠。

H-2kb/OVA表达

将H-2kb序列亚克隆到cetHS-puro质粒中.结果表明，CTAG序列与H-2kb序列的C-端融合.通过PCR和测序(数据未显示)确定该结构的成功发生。转染前一天，将HEK293T细胞接种于10 cm组织培养盘中。第二天，细胞汇合率达到70%-80%。此时，用含有25μM氯喹的9 mL DMEM培养基代替培养液，转染KB-CTAG和OVA质粒的细胞(pcDNA3-OVA；Addgene，质粒#64599)。在450μL H中加入5μg的kb-ctg和5μg ova表达质粒。2O在1.5mL Eppendorf管中，依次加入500μL2×HBSS。50μL_2M CaCl2然后加入溶液，使管子形成漩涡状，并在冰上停留15分钟。质粒被轻轻地添加到细胞培养的顶端。单次转染用10μg的KB-CTAG质粒。转染后第2天，用温热DMEM培养基冲洗两次，培养1天。

AAPC生产

KB-CTAG和OVA表达293 T细胞(或表达B16F10细胞的KB-CTAG)在含有蛋白酶抑制剂(完全超)的裂解缓冲液(1%CHAP，25 mm Tris pH7.5，150 mmNaCl)中溶解。TM药片；罗氏，曼海姆，德国)。在4℃下松解1h。用12，000 rpm离心20分钟获得上清。将澄清后的裂解液与CTAG基质(CaptureSelectC-Tag亲和矩阵、热科学、Waltham、MA)混合，在4℃下，在缓慢旋转的表面上孵育1小时。然后用无菌PBS对基体进行广泛清洗(500 rpm/20秒旋转以恢复基体)。KB：SIINFEKL pMHCI复合物(或KB)的成功提取是通过检测KB和/或与H-2kb结合的SIINFEKL的抗体来确定的。

离体T细胞活化

OT-ⅠRag1的次级淋巴器官−/−小鼠通过细胞过滤器被粉碎，红细胞用ACK溶解。洗涤后，按照厂家的指示，用细胞微量紫(CellTrace™Violet cell增殖试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)标记细胞。将细胞接种于24孔板中，每孔均含400万个细胞，加入2mL培养基中。对照组和实验组(20μL基质，一孔)加入细胞培养6天。每隔一天，一半的培养基被新鲜培养基取代。

流式细胞术

染色如先前所述14...细胞内细胞因子染色采用BD生物科学细胞固定/Cytoperm试剂盒(BD生物科学，圣何塞，CA)，按照制造商的指示进行。样本用LSRFortessa流式细胞仪(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)进行分析。抗IFNγ(XMG 1.2)、颗粒酶B(QA 16A02)、与SIINFEKL(25-D1.16)、CD3ε(145-2C11)、CD 44(IM7)、CD 90.1(OX-7)和CD8a(3-6.7)结合抗体。抗KB抗体(Y-3)来源于BioXcell(西黎巴嫩，NH)，与AlexaFluor™647抗体标记试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)结合。数据用Flowjo软件(TreeStar；Ashland，OR)进行分析。所有显示细胞的流式细胞术图均采用可固定活性染料eFluor 780(eBioscience，San Diego，CA)和单重态事件对活细胞进行预处理。

OT-I-T细胞过继转移到荷瘤小鼠体内的实验研究

8~12周龄雌性和雄性WT C57BL/6小鼠皮下接种10只。6B16-OVA细胞。肿瘤可见时(第7天)，每只小鼠尾静脉注射4×10。6T细胞刺激离体与SIINFEKL，控制或KB/OVA装甲运兵车5天。以OT-I雌性小鼠为T细胞来源。在指定的时间点用卡尺测量肿瘤，根据以下公式计算肿瘤体积：体积=(W)2*L)/2，其中W为宽度，L为长度。根据批准的动物协议，肿瘤大小达到1，000毫米的小鼠3或者动物表现出明显的体重下降，缺乏梳理和喂食等痛苦被安乐死。

统计分析

使用GraphPad Prism7.0软件(Graphpad，La Jolla，CA)进行统计分析。图图中列出了用来确定意义的统计方法。a p值<0.05被认为具有统计学意义。

一步aAPC背后的概念

APC作为肿瘤免疫治疗药物的产生和广泛应用受到免疫原性肿瘤抗原鉴定和携带这些多肽的重组人HLAs的影响。为了克服这些限制，我们测试了肽MHCs是否可以直接从细胞裂解物中捕获，包括利用亲和珠从癌细胞中捕获。理论上，这些含有未知肽-mhc库的亲和珠可以与广泛的抗原特异性T细胞相互作用，并促进抗癌反应。图中描述了产生一步aAPC的概念和策略.1/图形摘要。为了验证概念实验，我们设计了一个系统，在该系统中，我们可以控制和确定AAPC生成的每一步。作为第一步，我们用编码C标记小鼠H-2kb(MHC-I)和OVA的质粒转染人胚胎肾细胞(HEK293T)。2A)。用Y-3抗体(识别H-2kb)检测小鼠细胞表面H-2kb的表达，利用识别与H-2kb结合的SIINFEKL(显性，OVA-衍生CD8表位)的抗体，形成OVA衍生肽MHC复合物。我们观察到H2kb的高效表达和SIINFEKL肽在MHC-I分子上的负载(数据未显示)。KB-CTAG质粒转染细胞内未见SIINFEKL染色(数据未显示)。在证实OVA衍生肽在MHC-Ⅰ背景下的表达后，我们用针对H-2kb的C标记基序的亲和矩阵对细胞进行裂解和纯化。与SIINFEKL络合的MHC-I和MHC-I的捕获是用上述抗体进行的.我们发现，亲和珠有效捕获MHC-I和MHC-I负载SIINFEKL(图1)。2A)。因此，这些数据表明，针对mhc-i的亲和珠可能是一种简单的方法来产生特定于病人的aAPCs。

图形摘要一步AAPC生成的图形表示。肿瘤细胞裂解物与捕获癌细胞肽-MHC-I的亲和珠共同孵育.然后，这些珠子被用来激活肿瘤抗原特异性T细胞克隆，最终杀死肿瘤细胞。

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装载KB：SIINFEKL的APC可以激发OT-I T细胞.(a实验流程：将KB-CTAG(褐色)编码质粒单独转染293 T细胞，或与OVA(红色)编码质粒联合转染293 T细胞。培养两天后，细胞被溶解，MHC-被靶向CTAG基序的亲和珠捕获。用流式细胞术检测与SIINFEKL结合的MHC-I的捕获情况，用抗体识别与KB结合的SIINFEKL。三个实验中有一个是有代表性的。(B))OT-I细胞被刺激离体用SIINFEKL肽，KB/OVA APCs，对照APC或KB/OVA APC在Y3抗体存在下，两天后拍照(右)。箭头指向刺激诱导的一些被激活的OT-I细胞团簇.三个实验中有一个是有代表性的。三个样本/组，除了发挥阳性对照作用的SIINFEKL。(c)在单独的实验中，OVA APC或KB/OVA APC刺激OT-I细胞2天，流式细胞仪检测活化(CD 44)和增殖(CTV稀释)。三个实验中有一个是有代表性的，n=3.未配对t检验.*p<0.001。

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装载KB：SIINFEKL的aAPC可作为OT-i T细胞的主要参数

利用亲和矩阵成功地产生aAPC，促使我们测试所生成的aAPC是否能激活抗原特异性CD8 T细胞。为此，我们产生了上述APC，并与天真的OT-I细胞共同培养。OT-I细胞识别在H-2kb背景下出现的SIINFEKL肽.SIINFEKL肽(2μg/mL)刺激为阳性对照(脉冲)等人，2006年)。这个体外携带KB的APC培养OT-I T细胞(KB/OVA)，但不控制AAPC(KB)，导致细胞团簇形成(图一)。2B)。将Y-3抗体与H-2kb的肽槽结合，从而干扰TCR的结合，减少了OT-I簇的形成。2B)。为证实OT-I细胞的活化和增殖，将CTV标记的OT-I细胞与对照组或KB/OVA APC共培养，用流式细胞仪进行分析。KB/OVA APC与对照AAPC不同，在第2天诱导CD 44显著升高，并稀释增殖染料(图2)。2C)。使用相同技术产生的APC，但另一个细胞系(B16F10)提供了类似的结果(数据未显示)。这些数据表明，我们的aAPC能够产生抗原特异性T细胞反应.

AAPC活化T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用离体和体内

为了研究AAPC启动的T细胞的细胞毒性作用，我们设计了一个离体用B16F10细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。OT-ⅠT细胞首先由KB/OVA APC或对照AAPC启动6天。离体(无花果)3A)。细胞毒性表型(IFN、γ和颗粒酶B)均经流式细胞术证实。3B)。表达OVA和GFP的B16F10细胞(下称B16-OVA)与其亲本B16F10细胞(B16WT)混合，以1：1的比例与CTV标记。3A)。接种后1天，将启动的OT-ⅠT细胞直接加入B16细胞培养，效应细胞与肿瘤细胞的比例为2：1，肽刺激的OT-I细胞为阳性对照。加入T细胞后第1天用流式细胞仪(FACS)测定细胞计数。肽刺激T细胞和AAPC刺激T细胞对表达OVA的肿瘤细胞均有有效杀伤作用，但使亲代WT肿瘤细胞保持完整(图1)。3C)。为了进一步了解AAPC刺激的T细胞的杀伤能力，我们将OT-I T细胞静脉注射到携带B16-OVA肿瘤的WT小鼠体内。4A)。肽和AAPC刺激的OT-I细胞均能显著减缓肿瘤的生长。4B)和提高存活率(图1。4C)。总之，我们的数据表明，这种新的AAPC能够诱导细胞毒性T细胞，并有可能被用作免疫治疗。

AAPC激活的OT-ⅠT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用离体. (A)实验流程用SIINFEKL、对照组或KB/OVA APC刺激OT-I细胞6天。(B))在实验前，用流式细胞仪证实了OT-ⅠT细胞的细胞毒性表型。未配对t检验，**p<0.01，*p<0.001。(cOT-I细胞与B16-OVA(靶细胞；绿色)和B16WT(对照细胞；蓝色)混合培养一天。用流式细胞仪(左)测定靶细胞的杀伤率，并以相对百分率(右)表示。其中一个有代表性的实验，n=3.绿色派片上的单向方差分析，*p<0.0001.

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AAPC激活的OT-ⅠT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用体内. (a)实验流程用SIINFEKL、对照组或KB/OVA APC刺激OT-I细胞5天。以确定体内将AAPC刺激的OT-I细胞、OT-I细胞转移到B16-OVA荷瘤小鼠体内，并观察其对肿瘤生长的影响。b)(双向方差分析；图基试验*p<0.001)，并监测生存情况(c)(长秩，Mantel-Cox检验，*p<0.05)。将两个实验的数据结合起来。n=6-8只/组。

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用肿瘤细胞产生的aAPC能够激活荷瘤小鼠的T细胞。

模型抗原OVA的成功，鼓励我们探索用未知的肿瘤抗原产生的APC是否可以用来刺激从荷瘤小鼠中分离出来的T细胞。为了解决这个问题，我们首先用C标记的H-2kb转染B16F10细胞，并分离得到上述肽-MHC-。这个实验背后的科学合理性是，这些MHC-I分子将被负载肿瘤抗原，然后我们可以利用亲和珠捕获B16F10细胞的肽-MHC-I序列(图1)。5A)。流式细胞术证实成功捕获了经C标记的H2kb转染的B16F10细胞的H-2Kb。5B)。其次，从B16F10荷瘤小鼠脾细胞中分离出脾细胞，用实验和对照的方法刺激其脾细胞。我们观察到，与对照组相比，我们的实验aAPC激活了更多的CD8 T细胞来产生干扰素γ(如图所示)。5C)。因此，数据支持产生特定于病人的aAPC是合理的。

用B16F10细胞活化荷瘤小鼠的T细胞产生aAPC。(a)数字数据的实验流程(b、c))。将KB-CTAG质粒转染B16F10细胞。两天后，细胞被溶解，MHC-I库用亲和珠捕获。流式细胞仪证实成功捕获了MHC-IS。b)。然后用APC刺激从荷瘤小鼠脾脏中分离出的T细胞，持续6天。流式细胞仪(FCM)证实，以产生干扰素γ为特征的CD8 T细胞具有细胞毒性表型。c)。除了未受激的n=1.未配对t检验外，其余两个实验中有一个是有代表性的，n=3.*p<0.01。

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在这里，我们提出了一种新的和简单的技术，以产生病人特异性的癌症疫苗。我们带来的实验证据，可以作为生产针对癌症和自身免疫性疾病的患者特异性疫苗的基础。我们证明，亲和珠可以直接从细胞裂解物中提取肽-mhc，在几天内以最低的成本生成特定于病人的aAPC是一种可行的选择。

到目前为止，为治疗癌症而产生的APC的临床可用性受到多种因素的限制。aAPCs必须是特定的患者，首先需要患者HLA单倍型的特征和癌症新抗原的鉴定。人类白细胞抗原单倍型通过聚合酶链反应和流式细胞术相当容易确定，然而，免疫原性癌症新抗原的鉴定是一项昂贵、繁琐和费工的过程，并有许多注意事项，进一步限制了其成功率。15,16,17,18...由于大多数癌症是高度异质性的，一种占优势的新抗原可能只针对某些癌细胞，而新抗原可能是病人特有的，或者它只会与某些HLA分子结合，从而限制了它们更广泛的可用性。为了制造aAPC，必须以重组蛋白的形式产生正确的HLAs，并与相应的新抗原肽结合。重组HLA和多肽可能不会携带所有正常发生的翻译后修饰。体内这可能导致不太有效的TCR刺激。此外，HLA的全谱很难重建。为了简化aAPC的生成，我们决定把重点放在重要的事情上，而忽略识别抗原的需要。我们假设，我们可以通过直接从肿瘤裂解物中提取肽-MHCs来生成APC。事实上，我们发现我们可以成功地拉下肽-mhc，这些物质可以被用来刺激抗原特异性的抗癌效应T细胞反应。肿瘤特异性T细胞克隆在自然界中是低丰度的。19与迄今产生的大多数aAPC不同的是，这种技术通过捕获一种不同的肽-MHC-I池，可以增加靶向和激活多个肿瘤特异性T细胞克隆的机会。预计肿瘤细胞所呈现的肽库和肿瘤异质性将按比例表现在aAPC上。如果以后的研究能证明情况并非如此，我们可以使用一种改进的滴测序技术，在这种情况下，含有裂解缓冲液的脂滴将围绕一个癌细胞和一个亲和珠形成。这将确保每个AAPC将代表一个癌细胞的肽-MHC-I库.具有较高白细胞浸润的肿瘤样本可能需要纯化步骤，以丰富肿瘤衍生特征。在某些情况下，肿瘤细胞通过下调mhc-i的表面表达而逃避免疫监视。20...理论上，我们的aAPC仍然可以捕获细胞内保留的肽MHC-I库；或者作为最后的手段，用特定于患者的HLA-I异位转染肿瘤细胞可以绕过这一警告。使用这一技术产生的aAPC可能包含自我、非突变、非免疫原性肽，如果与协同刺激相结合，这些肽可能触发某些类型的自身免疫反应。然而，由于中央和周边的容忍，这是最低限度的。可能的自身免疫症状也可以通过使用不同的药物来控制。

由于缺乏识别小鼠H-2kb细胞质部分的抗体，并且由于多功能性的原因，在这些概念的证明中。离体和体内实验中，我们使用了标记特异性抗体。未来的研究应考虑抗体识别KB或目标β-2微球蛋白的细胞质部分，以从C57BL/6小鼠样本中捕获肽-MHC-I复合物。对于人类研究和人类aAPC的产生，W6/32泛HLA-I抗体可能是一个很好的候选。与HLA-I细胞质部分相互作用的病毒蛋白也是亲和纯化肽-MHC-I库和产生aAPC的可行选择。

理论上，该技术可用于实现免疫原性和耐受性免疫反应。由正常细胞或被自身抗原刺激的细胞产生的aAPC与抑制信号和细胞因子相结合，应产生抗原特异性调节性T细胞反应(预防或治疗自身免疫性疾病)。按照同样的逻辑，可以产生一种APC来治疗过敏，或者作为预防疫苗来对抗传染病。

总之，我们在这里向科学界提出了一个概念，它有可能彻底改变癌症疫苗，让任何人在几天内都能负担得起，这也给了时间非常有限的病人一个机会。当然，要完善这项技术还需要更多的研究，包括但不限于载体的特性(材料、大小、形状，体内半衰期、控释等)、共刺激分子、细胞因子和趋化因子的使用、给药途径等。