摘要
TGF-β诱导的因子同源盒2（TGIF2）是一种转录调节因子，在调节发育和决定细胞命运方面起着至关重要的作用。TGIF家族蛋白的异常表达已在几种癌症中观察到，包括卵巢癌，食道癌和结肠直肠癌。在这里，我们报道TGIF2介导EGFR–RAS–ERK信号传导途径，以增强肺腺癌（LUAD）细胞的干性，从而促进LUAD的发展和转移。我们发现高TGIF2表达与LUAD患者的肿瘤生长，淋巴结转移和生存密切相关。带有TGIF2沉默的H1299异种移植物的小鼠肿瘤较小，肺转移较少。重要的是，沉默TGIF2会降低A549和H1299细胞中的癌症干细胞（CSC）样特性。此外，OCT4启动子促进其表达。在LUAD细胞和体内LUAD小鼠模型中，我们都发现EGFR-RAS-ERK信号转导了TGIF2磷酸化并增加了其稳定性，这对TGIF2促进的LUAD干细胞很重要，因为磷酸化缺陷的TGIF2突变体失去了这些功能。因此，我们的研究表明，重要的因子TGIF2将EGFR信号转导至LUAD细胞的CSC特性，可将其用作LUAD治疗的有效靶标。
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有类型肺癌的85％。1 NSCLC通常被诊断为晚期，导致5年生存率不足15％。2肿瘤内异质性被认为是当前抗癌疗法疗效有限的主要原因之一。3已充分证明，癌症干细胞（CSC），能够引发新的肿瘤的赘生性细胞的亚群，4，5是瘤内异质性的主要原因。6值得注意的是，CSC表型与上皮激活密切相关-间充质转换（EMT）的程序，7，8，9，其是肿瘤转移过程中的一个重要步骤。尽管已经深入研究了CSC维持的机制，但调控NSCLC中CSC的关键基因（尤其是由异常的EGFR激活引起的基因）仍然难以捉摸。
TGF-β诱导的因子同源盒2（TGIF2）是同源域蛋白的三氨基酸环延伸（TALE）超家族的成员，其在许多关键的发育程序（包括细胞增殖和分化）的调节中起着重要作用。TGIF2通过与TGF-β/ BMP途径相互作用或直接与DNA结合而充当转录抑制因子。10，11日前，TGIF2已被报道能增强基因表达。在黑色素瘤中，TGIF2直接上调FUT8（岩藻糖基转移酶8）的转录以诱导转移，从而导致黑色素瘤的侵袭行为。12此外，TGIF2可以与CDH1结合启动子并激活结肠癌细胞上皮状态中的CDH1表达。13此外，最近报道TGIF2是将肝细胞逐步重编程为胰腺祖细胞状态的关键发育调节剂。14在此过程中，TGIF2的强制表达比上调的胰腺祖细胞基因能够产生更多的上调基因，提示TGIF2可能同时充当转录激活因子和阻遏因子。TGIF2介导的转录调控的这些特征与其他TALE同源蛋白一致，显示出上下文相关的活性。据报道，TGIF2蛋白在包括卵巢癌和结肠直肠癌在内的几种癌症中被上调。15，16然而，TGIF2在NSCLC中的作用仍未得到充分探索。
表皮生长因子（EGF）在调节细胞生长，增殖和分化中起重要作用。它也与癌症干和EMT有关。17，18通过EGF受体（EGFR）的活化EGF能刺激多种生物学反应，和激活的EGFR磷酸化和活化的一些重要信号传导途径。19 RAS / RAF / MAPK被认为是EGF / EGFR的传统下游效应子之一。EGFR / RAS / ERK信号传导通常在癌症中异常激活，导致细胞增殖，恶性转化和耐药性。20，21，22此外，该途径可以直接磷酸化许多转录因子，包括ETS-1，c-JUN和c-MYC。据报道TGIF2被EGF / RAS / ERK信号转导磷酸化。8然而，由该途径触发的TGIF2的功能仍不清楚。
在本研究中，我们研究了TGIF2在体外和体内促进肺腺癌（LUAD）进程中的功能和机制。我们证明由EGFR / RAS / ERK信号转导的TGIF2磷酸化促进OCT4表达，从而导致LUAD细胞的干性和转移增加。TGIF2作为桥接EGFR信号至LUAD细胞干的关键调节因子的鉴定为EGFR诱导的LUAD转移和耐药性提供了新见解，表明TGIF2可能是LUAD的潜在治疗靶标。
据报道，在卵巢癌和大肠癌中TGIF2水平升高。15，16亚东王等人。也报道了使用基于细胞的体外系统，TGIF在肺癌发生中的高表达。23为了探讨人类患者TGIF2水平与LUAD进展之间的真正相关性，我们首先通过免疫组织化学（IHC）检查了60例人类NSCLC标本和9例正常肺样品中TGIF2蛋白水平。TGIF2在NSCLC样品中的表达明显高于正常组织（图1a，b）。在具有较高病理等级的NSCLC患者中观察到较高的TGIF2水平（表1）。与鳞状细胞癌相比（n = 24）和大细胞未分化癌（n = 12），肺腺癌（n = 24）显示出更高的TGIF2表达（P <0.001）（图1a，b）。
一个使用人非小细胞肺癌组织微阵列（包括24肺腺癌，24鳞状细胞癌，12大细胞未分化癌，和9个正常肺样品，每个具有三个重复）TGIF2蛋白质表达的免疫组织化学分析。比例尺：50μm。b根据染色评分分析不同NSCLC组织中TGIF2的表达。x轴下方列出了样本数量和每组的平均值。c TCGA的59例正常组织和515例LUAD原发性肿瘤中TGIF2的转录水平（P <0.001 [未配对t检验]）。d TGIF2与GSE32863中匹配的正常肺组织相比较，LUAD中的mRNA表达（n = 36；P <0.001 [配对t检验]）。È TGIF2表达在正常肺细胞系（BEAS-2B）与作为检查通过qRT-PCR NSCLC细胞系（A549，H1299，H460）（柱状图，上图）和蛋白质印迹（下图）进行比较。数据显示为平均值±SD。** P <0.01，*** P <0.001。f Kaplan–Meier曲线显示2437例不同TGIF2基因表达水平的LUAD患者的生存率（[log-rank test]，HR，危险比）。
接下来，我们在TCGA数据库中的两个队列中探索了TGIF2的mRNA水平，该数据库包含515个人LUAD样品和59个正常样品，以及来自Gene Expression Omnibus（即GSE32863）的LUAD数据集，其中包含36个LUAD样品和配对的相邻正常肺样品。一致地，LUAD显示TGIF2的表达明显较高（图1c，d）。此外，与正常肺细胞系BEAS-2B相比，LUAD细胞系A549和H1299中还观察到TGIF2表达增加（图1e））。我们还分析了TGIF2水平与肺癌患者先前从2437名LUAD患者中获得的微阵列数据集之间的相关性（RFS）。我们发现，LUAD患者的高TGIF2表达与不良的临床预后相关（P <0.001，图1f）。综上，这些结果表明TGIF2在促进LUAD进程中的作用。
作为TALE蛋白的成员，TALE蛋白在许多发育过程中都起着至关重要的作用，据报道24 TGIF2能够将肝细胞重编程为胰腺祖细胞，14提示TGIF2在调节干和分化中的作用。为了测试TGIF2是否调节LUAD癌细胞的干性，我们首先检查了TGIF2在CSC样细胞中的表达。在通过FACS分离的A549和H1299的CSC样侧群中，我们观察到TGIF2的表达升高（图2a）。一致地，可能形成球形的CSC样细胞也显示TGIF2表达增加（图2b）。）。为了进一步探讨TGIF2是否可以驱动LUAD癌细胞的干性，我们建立了TGIF2沉默的稳定H1299和A549细胞（图S1a）。沉默TGIF2会显着降低OCT4，SOX2和NANOG的表达，这是驱动干性的关键转录因子，H1299和A549细胞中的这种转录因子为25（图2c），这可以通过异位表达shRNA耐药的TGIF2来挽救。S1b和图2d）。我们还观察到，沉默了TGIF2的H1299和A549细胞的侧群减少了，代表了CSC样细胞群（图2e），一旦TGIF2表达被拯救，侧群就显着增加了（图2f）。）。使H1299和A549细胞中的TGIF2沉默也可能极大地削弱其球形成能力（图2g），这也可以通过异位表达的TGIF2来挽救（图2h）。据报道，LUAD CSC样细胞高表达CD133和CD44。26，27我们发现，撞倒TGIF2显著降低了CD133 + CD44 +亚群，这可以通过异位表达TGIF2以及被拯救为（图2I）。
一个 TGIF2的Western印迹分析，对- TGIF2，和ABCG2表达在非侧群（非SP）和H1299的侧群（SP）和A549细胞。b qRT-PCR分析H1299和A549细胞的贴壁细胞或球体中OCT4，SOX2，NANOG和TGIF2 mRNA的表达。数据显示为平均值±SD。** P <0.01，*** P <0.001。c在TGIF2沉默的稳定H1299和A549细胞中对OCT4，SOX2，NANOG，TGIF2和p-TGIF2进行蛋白质印迹分析。d在所示的稳定H1299细胞中对OCT4，SOX2，NANOG，TGIF2和p-TGIF2进行蛋白质印迹。ËTGIF2沉默的H1299和A549细胞中侧群的流式细胞仪分析。数据显示为平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。（f）在所示的稳定的H1299细胞株中侧群的流式细胞仪分析。数据显示为平均值±SD。*** P ＜0.001。g TGIF2沉默的H1299和A549细胞的球形形成能力。比例尺：50μm。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.01。h所示稳定H1299细胞株的球形成能力。比例尺：50μm。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.001。i CD133的流式细胞仪分析在指定的H1299衍生的稳定细胞株中+ CD44 +双阳性细胞。数据显示为平均值±SD。*** P ＜0.01。
为了深入了解TGIF2在体内促进LUAD细胞干性的重要性，我们使用H1299细胞进行了异种移植实验。沉默TGIF2可以显着降低肿瘤的生长，这可以通过抗shRNA的TGIF2的异位表达得以挽救（图3a，b）。此外，在沉默了TGIF2的肿瘤细胞中观察到OCT4和SOX2的水平降低，这也可以通过异位表达的TGIF2来挽救（图3c，d）。此外，我们观察到，较少的TGIF2沉默的H1299细胞转移至肺部并引发继发性肿瘤，这被异位表达的TGIF2所逆转（图3e）。此外，有限稀释的异种移植检测显示10 5与对照细胞相比，异种移植到NOD / SCID小鼠中的TGIF2沉默的H1299细胞的成瘤率显着降低（图3f），这也可以通过增加TGIF2水平来恢复（图3f）。综上所述，这些结果表明TGIF2在维持LUAD细胞的CSC样特征和促进体内转移中的作用。
解剖通过皮下接种指示的H1299细胞株形成的肿瘤异种移植物并捕获图像。b在指定的时间点测量肿瘤体积。c通过western blot检测OCT4，SOX2和TGIF2在肿瘤组织裂解物中的表达。d在所示异种移植肿瘤切片中进行TGIF2，OCT4和SOX2的IHC染色（比例尺：50μm，左图）和定量（n = 4，右图）。数据显示为平均值±SD。** P <0.01，*** P <0.001。È H＆E染色来分析从所指示的小鼠肺转移（比例尺：250μm时，左图），并且转移进行定量（n = 4，右侧面板）。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.01。f通过有限稀释测定法（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）分析了由所示H1299稳定细胞株形成的肿瘤中的肿瘤存在和致瘤细胞频率。皮下肿瘤收获的28 个天的后接枝（Ñ = 10）。CI，置信区间。
在60个人类NSCLC样品中，我们发现IHC确定了TGIF2和OCT4的水平之间具有良好的正相关性（图4a，b）。另外，沉默TGIF2不仅显着降低了H1299细胞中OCT4，SOX2和NANOG的蛋白质水平（图2c），而且降低了这些基因的mRNA水平（图4c）。），表明TGIF2可能通过调节这些基因的转录来促进LUAD的CSC样特征。为了了解TGIF2如何调控这些基因的转录，我们首先搜索了基因转录调控数据库（GTRD），这些数据库是许多染色质免疫沉淀和深度DNA测序（ChIP-Seq）结果的集合，以寻找这些基因上的TGIF2结合位点。我们仅发现TGIF2可能与OCT4启动子的–6096〜–4632区结合，在Cistrome Data Browser数据库中显示了高水平的H3K27Ac，表明该区有活性转录（图4d）。为了进一步证实这些结果，我们进行了ChIP-qPCR分析以扫描人OCT4基因从-6 kb到TGIF2结合位点的转录起始位点（+1）（图4e）。一致地，在OCT4启动子的-6kb至-5kb的区域内发现了TGIF2结合位点（图4e）。TGIF2能够促进萤光素酶报道基因的-6 kb〜+1区驱动表达，但不能促进-5 kb〜+1区驱动表达（图4f），进一步表明TGIF2可以增强OCT4的转录。通过结合在其启动子的-6 kb至-5 kb区域中。此外，我们发现沉默TGIF2导致报告基因表达降低（图4g），证实TGIF2充当人OCT4启动子的正向调节剂。
非小细胞肺癌组织阵列上TGIF2和OCT4 的 IHC染色。比例尺：50μm。b Spearman对人NSCLC组织中OCT4和TGIF2表达的相关性分析。c通过qRT-PCR分析指定细胞中SOX2，NANOG和OCT4的mRNA水平。数据显示为平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。d来自Cistrome数据浏览器数据库的ChIP-Seq数据，以显示人OCT4基因座上的TGIF2结合位点和H3K27Ac 。e OCT4的启动子区顶部显示了由6个扩增子扫描的基因。在H1299细胞中指定区域的OCT4启动子的TGIF2 ChIP-qPCR 。小鼠IgG用作阴性对照。数据显示为平均值±SD。*** P ＜0.001。f双荧光素酶测定法，以鉴定用编码所示序列的质粒转染的H1299细胞中OCT4启动子中的TGIF2结合位点。数据显示为平均值±SD。*** P ＜0.001。g双荧光素酶测定法显示OCT4启动子活性。通过将含有OCT4 -6169至+1区域的萤光素酶报告基因构建体共转染来检测人OCT4启动子的活性。H1299细胞中具有shCtrl或shTGIF2＃2的启动子。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.01。
Jonghwan Kim等。证明了小鼠Tgif1直接与Oct4启动子结合以抑制小鼠胚胎发育过程中Oct4的表达。28为了阐明TGIF1的潜在作用，我们在人肺癌细胞H1299中过度表达了TGIF1，并且未观察到内源OCT4的表达（图S2a）和由OCT4启动子驱动的萤光素酶报告基因的任何变化。S2b），表明在人类肺癌细胞中，TGIF1无法调节OCT4，这可能是由于小鼠Oct4之间的保守性较低启动子和人OCT4启动子。因此，我们将小鼠Oct4启动子中Tgif1结合位点的序列（-1459至+585）与人OCT4启动子的序列进行了比对，发现这两个启动子之间的相似性非常低。这些结果揭示了TGIF2在调节人OCT4中的特定作用。
此外，我们发现沉默TGIF2会导致TGIF1的表达下降（图S2c，d），这排除了OCT4表达下降的可能是由于转录阻遏物TGIF1的补偿。
EGFR的异常激活通过激活下游RAS-ERK和其他途径来驱动包括肺癌在内的多种肿瘤类型的肿瘤发生。29 TGIF2被RAS-ERK途径磷酸化。10我们首先证实，EGF能够在H1299细胞中诱导TGIF2磷酸化（图5a），这可以被EGFR抑制剂吉非替尼和MEK抑制剂PD98095（图5b）抑制，这表明EGFR-RAS-ERK信号转导可以诱导LUAD细胞中TGIF2磷酸化。一致地，我们发现作为TGIF2靶基因的OCT4的表达被EGF增强（图5c，d），这也可以被EGFR或MEK抑制剂抑制（图5e和图5）。S3a）。此外，我们检测了EGF对TGIF2沉默细胞中OCT4表达的影响。我们的结果表明，TGIF2沉默降低了EGF诱导的OCT4表达（图5f）。
一个 Western印迹分析示出TGIF2的与EGF的5分钟的指定剂量处理的H1299细胞的磷酸化。b在存在吉非替尼（左图）或PD98059（右图）的情况下，H1299细胞中EGF诱导的TGIF2磷酸化的蛋白质印迹分析。c Western印迹显示H1299细胞中EGF诱导的TGIF2磷酸化的时间过程和OCT4水平。d通过Western印迹分析OCT4在不同剂量EGF处理48 h的H1299细胞中的表达。È在H1299细胞OCT4表达的Western印迹分析在吉非替尼或PD98059的存在或不存在用EGF刺激。F在存在或不存在EGF的情况下，TGIF2敲除和对照H1299细胞中OCT4表达的蛋白质印迹分析。g体内小鼠异种移植实验的示意图。给小鼠静脉内注射过量表达TGIF2 WT的H1299-萤火虫荧光素酶（H1299-Fluc）细胞或空载体作为对照。12天后，每天给小鼠口服50mg吉非替尼/ kg，持续30天。h，i在指定的天数（h）进行肺转移的生物发光成像，并通过生物发光强度（i）量化肿瘤大小。数据表示为平均值±SD（n = 4，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001）。Ĵ通过IHC染色检测在肺肿瘤TGIF2和OCT4表达的影响。比例尺：50μm。ķ TGIF2的域结构，以显示在H1299细胞过度TGIF2两个MAPK位点（上图）和对TGIF2和对TGIF2 western印迹的位置WT，TGIF2 DD，或TGIF2 AA（下图）。l在存在或不存在吉非替尼的情况下，在所示稳定的H1299细胞中对OCT4，TGIF2，p-TGIF2，p-ERK和ERK表达进行Western印迹分析。
接下来，我们检查了在H1299异种移植小鼠模型中TGIF2在促进LUAD进展中的作用是否受EGF / EGFR信号传导控制（图5g）。如体内通过荧光素酶测定所监测的，被广泛使用的抗肿瘤药物吉非替尼对EGF / EGFR信号的抑制极大地抑制了TGIF2 WT促进的H1299异种移植的转移（图5h，i），这通过计算肿瘤负荷进一步得到证实。通过HE染色显示（图S3b，c）。在异种移植肿瘤的LUAD细胞中，吉非替尼还抑制了TGIF2诱导的OCT4表达（图5j和图S3d）。
为了进一步研究TGIF2在EGF / EGFR信号下游的重要作用，我们生成了一个模仿磷酸化的TGIF2突变体（即T182D和T186D，或简称TGIF2 DD，图5k）。在TGIF2 DD转染的H1299细胞中，与对照细胞相比，吉非替尼未能降低OCT4表达（图5l），强烈暗示了吉非替尼对LUAD细胞的CSC样性质的影响是TGIF2依赖性的。
为了进一步了解EGFR–RAS–ERK对TGIF2的磷酸化对于EGFR促进的癌细胞干细胞是否重要，我们接下来比较了野生型TGIF2（TGIF2 WT）和磷酸化缺陷的TGIF2突变体（即T182A和T186A，或简称TGIF2 AA，图5k）促进LUAD细胞的干性。首先，我们发现与TGIF2 WT相比，EGF不再能够诱导TGIF2 AA的磷酸化（图6a）。如图6b所示，TGIF2 WT的异位表达促进了H1299细胞中球的形成，而TGIF2 AA却没有。一致地，TGIF2 AA与TGIF2 WT相比，H1299细胞的侧群没有增加（图6c）。在异种移植小鼠LUAD模型中，与空载体转染的细胞相比，异位表达的TGIF2 AA不像TGIF2 WT那样促进肿瘤的生长（图6d）。此外，TGIF2 AA -overexpressing肿瘤组织没有显示出增加的OCT4水平，同时TGIF2 WT -overexpressing肿瘤那样（图6E，F）。此外，有限稀释的异种移植测定法表明用TGIF2 WT转染的肿瘤细胞与空载体或TGIF2 AA转染的细胞相比，NOD / SCID小鼠的肿瘤启动能力显着提高（图6g）。因此，我们的结果表明，TGIF2的磷酸化对于促进LUAD细胞的CSC样特性是必需的。
一个为Flag标记TGIF2 Western印迹WT和TGIF2 AA在H1299细胞用EGF处理5分钟。b球TGIF2的形成能力WT -和TGIF2 AA -overexpressing H1299细胞。比例尺：50μm。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.01。c流式细胞术分析异位表达TGIF2 WT或TGIF2 AA的 H1299细胞侧群。数据显示为平均值±SD。** P ＜0.01。d皮下接种通过TGIF2形成肿瘤异种移植物WT -或TGIF2 AA在移植后第28天收集过量表达的H1299细胞，并在指定的日子确定肿瘤体积。 每组n＝ 5只小鼠。e，f TGIF2和OCT4在所示的肿瘤异种移植物中被IHC染色（e，比例尺：50μm），并对阳性染色的细胞进行定量（f）。数据显示为平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。克在TGIF2肿瘤的存在和致瘤细胞频率WT - ，TGIF2 AA -或载体转染的肿瘤细胞用有限稀释法进行分析。H在10μM环己酰亚胺（CHX）存在下不同时间段的H1299细胞中TGIF2水平的蛋白质印迹分析（上图）。量化TGIF2水平，并在不同时间点将其标准化为β-肌动蛋白水平，以计算未磷酸化和磷酸化的TGIF2的半衰期（下图）。我未磷酸化和磷酸化的TGIF2在有或没有50ng / ml的EGF处理5分钟H1299细胞中的亚细胞定位通过细胞分级和蛋白质印迹检测。j拟议的模型说明了TGIF2下游EGF / EGFR信号传导在促进LUAD干和转移中的作用。EGF激活的EGFR通过激活RAS / ERK信号传导使TGIF2磷酸化，从而增强TGIF2的稳定性，从而增强OCT4转录，导致癌症干和转移增加。但是，磷酸化TGIF2的无活性突变或药理抑制作用（吉非替尼）会降低TGIF2的稳定性，并消除p-TGIF2增加的茎干。
接下来，我们探讨了TGIF2的磷酸化如何促进LUAD细胞的干性。据报道TGIF的半衰期非常短。30我们检查了TGIF2在H1299细胞中的半衰期，并证实了它的短半衰期约为2小时（图6h）。有趣的是，相比之下，磷酸化的TGIF2的半衰期更长，为5小时（图6h）。EGF可以诱导H1299细胞核中更多的磷酸化TGIF2积累（图6i），从而促进OCT4的表达。
总而言之，我们的研究证明了TGIF2在介导EGF / EGFR–RAS–ERK信号诱导的LUAD干细胞中的关键作用，这可能是预防LUAD的有用靶标。
在这项研究中，我们发现由EGFR / RAS / ERK信号触发的TGIF2磷酸化增强了TGIF2的稳定性，从而促进了OCT4转录，从而导致LUAD细胞的干性和转移增加（图6j）。
TGIF2已被鉴定为募集HDAC来抑制TGF-β反应性转录激活的转录抑制因子。8我们的研究表明，TGIF2 以HDAC独立的方式促进了OCT4转录。重要的是，由于EGFR / RAS / ERK信号激活而导致的TGIF2磷酸化提高了其稳定性并增强了LUAD的CSC特性。磷酸化缺陷的TGIF2突变体失去了在H1299细胞中促进OCT4表达和肿瘤发生的活性。先前已经报道了OCT4在肿瘤发生中和作为预后标志物的重要性。31 OCT4在肺癌来源的CD133 +细胞中维持CSC样特性。32此外，OCT4与肺癌的不良预后显着相关。33在本研究中，TGCL2和OCT4的表达与NSCLC患者相关，这证实了TGIF2通过上调OCT4的表达来促进LUAD干。
此外，TGIF2通常由充当微RNA，的目标参与癌症34，35，36，37，38和少数研究已经调查TGIF2在癌症中的机制。在结肠癌中，据报道TGIF2与PKM2相互作用，将HDAC3募集到E-钙粘蛋白启动子，在EGF刺激下导致EMT。在LUAD中，我们在这里显示了EGF诱导的TGIF2磷酸化促进了OCT4转录并增强了癌细胞的干性。LUAD中的TGIF2是否可以抑制E-cadherin并在EGF刺激后诱导EMT过程仍然不清楚。根据我们的发现，我们建议TGIF2可以增强OCT4的转录调节癌症干。重要的是，TGIF2可能与其他辅助因子协同作用以在LUAD中发挥其转录功能，这与其他TALE同源蛋白具有上下文相关作用是一致的。39
在肺腺癌中，EGFR突变是“驱动程序”突变之一，导致PI3K / AKT和RAS / MEK / ERK通路的持续激活。40在本研究中，我们发现由EGFR / RAS / ERK信号触发的TGIF2磷酸化在LUAD进展中起着重要作用，这表明p-TGIF2作为驱动肺癌发展的EGFR / ERK信号响应因子。此外，由EGFR突变引起的EGFR / ERK信号的持续激活可能是LUAD患者TGIF2水平较高的原因之一。吉非替尼，作为针对EGFR的抗癌治疗药物之一，可以抑制肿瘤的生长。41在这里，我们发现吉非替尼治疗可在体外和体内抑制肿瘤转移并降低TGIF2磷酸化。此外，与对照细胞中的表达相比，吉非替尼未能降低TGIF2 DD转染的H1299细胞中OCT4的表达，强烈暗示了吉非替尼对LUAD细胞CSC样特性的影响是TGIF2依赖性的。但是，在临床治疗中总是会出现耐药性[ 42]，这意味着应立即开发其他目标药物。我们的发现表明靶向TGIF2磷酸化可能是LUAD治疗的潜在策略。
总之，我们证明了TGIF2在LUAD中高表达，并在EGFR / RAS / ERK信号传导的下游上调OCT4表达，从而促进癌细胞的干性和LUAD细胞的转移。我们的发现表明，磷酸化对于TGIF2维持CSC特性并促进LUAD细胞的转移是必需的，而阻断TGIF2磷酸化可能是LUAD治疗的有效策略。
将A549，H1299和H460人肺癌细胞保存在RIPM-1640培养基中，该培养基含有10％胎牛血清（FBS），100 U / mL青霉素和0.1 mg / mL链霉素。在SingleQuot®补充剂盒中，将BEAS-2B细胞与生长因子，细胞因子和补充剂（BR，Lonza，瑞士）一起保存在支气管上皮生长培养基（BEGM）（Solarbio，北京，中国）中。将细胞在含5％CO 2的潮湿气氛中保持在37°C 。最近，所有细胞系都通过Microread Inc.（中国北京）的细胞形态学和短串联重复分析进行了鉴定。
为了激活EGFR / ERK信号，将H1299细胞饥饿过夜，并与人重组EGF（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）孵育0-48小时，或用0-100 ng / mL EGF处理5分钟或48小时。 。为了抑制EGFR / ERK信号传导，将细胞与10μM吉非替尼（MedChem Express，新泽西州，美国）或20μMPD98059（MedChem Express，新泽西州，美国）预孵育1 h，然后暴露于50 ng / ml EGF 5分钟或48小时。
为了稳定敲除LUAD细胞中的TGIF2，我们将对照或TGIF2靶向shRNA模板插入了pLV-H1-EF1a-Puro载体（Biosettia，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）（分别名为shCtrl，shTGIF2＃1和shTGIF2＃2）。 。序列在补充表S1中给出。为了在哺乳动物细胞中稳定表达TGIF2或TGIF2突变体和TGIF1，可使用人全长TGIF2 WT基因，磷酸化缺陷型TGIF2 AA突变体（即T182A和T186A）基因，模仿磷酸化的TGIF2 DD突变体（即T182D和T182D T186D）基因和人全长TGIF1基因克隆到pLV-EF1a-MCS-IRES-Bsd载体（Biosettia，San Diego，CA，USA）中。43为了挽救TGIF2沉默细胞中的TGIF2表达，制备了shTGIF2＃2抗性TGIF2，并将其亚克隆到BamHI和MluI位点之间的pLV-EF1a-MCS-IRES-Bsd载体中。补充表S2中描述了用于修饰TGIF2 cDNA的引物。
为了建立稳定的细胞株，用表达shTGIF2的慢病毒感染A549和H1299细胞，然后使用2μg/ mL嘌呤霉素进行克隆选择，以建立TGIF2沉默的稳定H1299和A549细胞。感染了慢病毒携带PLV-EF1A-FLAG-TGIF2 TGIF2沉默稳定H1299（shTGIF2＃2）细胞RESIS接着选择与10μg/ mL的杀稻瘟素建立shRNA的耐TGIF2 -IRES-BSD（shTGIF2＃2 + TGIF2 RESIS） 细胞。感染了慢病毒携带PLV-EF1α-FLAG-TGIF2 H1299细胞WT -IRES-BSD或PLV-EF1α-FLAG-TGIF2 DD -IRES-BSD或PLV-EF1α-FLAG-TGIF2 AA -IRES-BSD质粒以产生TGIF2 WT -，TGIF2 DD-和TGIF2 AA-过表达细胞。44
按照先前的方案进行qRT-PCR。45在本测定中使用的引物在补充表S3中列出。
通过蛋白质印迹检测到的蛋白质表达是根据先前建立的方案进行的。46在补充测定表S4中列出了此测定法中使用的一抗。所有蛋白质印迹结果均作为来自三个独立实验的代表性图像提供。
收获细胞，并分离细胞质和细胞核部分，并用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂盒（美国马萨诸塞州，Thermo Fisher Scientific Inc.）提取。通过蛋白质印迹检测TGIF2蛋白。47
用于分析NSCLC中TGIF2和OCT4表达的组织微阵列购自Alenabio Inc.（目录号LC2081，山西，中国）。患者的临床病理信息在补充表S5中示出。根据先前建立的方案对表达水平进行评分。46
将在玻片或肿瘤组织切片上生长的细胞固定在4％多聚甲醛中，并在4°C下用一抗标记过夜，然后在室温下与适当的荧光二抗孵育1小时。细胞核用DAPI染色，并使用Leica DM4000直立显微镜或共聚焦荧光显微镜（Nikon）捕获图像。
将细胞以1×10 6个细胞/ mL 的密度悬浮，然后与7μg/ mL（对于A549）或2μg/ mL（对于H1299）Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）一起孵育在37°C下放置60分钟。维拉帕米（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）用作阴性对照。通过流式细胞仪（FACSCalibur，BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）分析样品，并使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.，Ashland，OR，USA）进行分析。
收集细胞并冲洗以除去血清，然后在无血清RIPM-1640培养基中解离成单细胞悬液，该培养基补充了20 ng / mL EGF，20 ng / mL人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和2％B27补充剂（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。随后在超低附着24孔板中以每孔1000个细胞的密度培养细胞。在7天（对于A549细胞）或9天（对于H1299细胞）之后，对球体（确定为> 20个细胞/球体）进行计数。
用藻红蛋白缀合的小鼠抗人CD133（BD Biosciences）和异硫氰酸荧光素缀合的小鼠抗人CD44（BD Biosciences）对肿瘤细胞进行染色，以进行流式细胞术分析。包括未染色的细胞作为对照。将一微升抗体添加到100μL细胞悬液中（1×10 6细胞/ mL），并将混合物在4°C下孵育1小时。在流式细胞仪上采集数据，并使用FlowJo软件进行分析。
荧光素酶活性是使用Dual-Luciferase Reporter分析系统（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）测定的。的启动子区（-6169 〜 1和-5129 〜 所述的+ 1）OCT4基因通过PCR扩增，并克隆到pGL3-基本矢量到萤火虫创建的pGL3-OCT4萤光素酶报道质粒。该测定中使用的引物列于补充表S2中。对于报告基因测定，将H1299细胞瞬时转染pGL3-OCT4报告质粒和Flag-TGIF2 WT或空载体作为对照。对于所有样品，将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性，以产生相对的荧光素酶活性。
根据制造商的规程，使用EZ-Zyme染色质制备试剂盒（Millipore，Billerica，MA，美国）进行ChIP。抗TGIF2抗体用于沉淀与TGIF2交联的DNA，抗小鼠IgG也用作阴性对照。进行qPCR以检测OCT4启动子区域的DNA片段。所用的引物在补充表S6中列出。
所有体内小鼠实验均经南开大学伦理委员会批准。在6-8周龄NOD / SCID雄性小鼠随机分配到各组（Ñ ≥4）。将细胞皮下注射到每只小鼠中。用卡尺测量肿瘤大小（mm 3），并通过下式计算：体积（mm 3）＝（宽度2（mm 2）×长度（mm））/ 2。测量肿瘤大小的个体对治疗不了解。将原发肿瘤组织和肺固定在福尔马林中，石蜡包埋，然后切片以进一步分析。皮下肿瘤由1×10形成6 H1299细胞中表达shTGIF2＃2，＃shTGIF2 2 +载体，shTGIF2＃2 + TGIF2 RESIS或在植入后45天分别解剖空载体。
对于有限稀释移植，将1×10 6，5 ×10 5，1 ×10 5或5×10 4细胞皮下注射到NOD / SCID雄性小鼠中，并且在植入后28天，收获肿瘤组织。
对于吉非替尼治疗，通过尾静脉向NOD / SCID小鼠注射经TGIF2 WT或空载体稳定转染的1×10 6 H1299-萤火虫荧光素酶（H1299-Fluc）细胞。注射后十二天，通过胃内给药连续30天每天接受50 mg / kg吉非替尼的小鼠，并将DMSO用作对照。计算肿瘤体积，并捕获生物发光图像。
使用2015版的在线工具（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung）进行生存分析。选择肺腺癌患者（n = 2437）进行总体生存分析。对数排名是自动计算的。在UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）上分析了LUAD中原发性肿瘤和正常组织中48种 TGIF2转录水平。从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds（登录号：GSE32863）下载了36对肺腺癌（LUAD）和癌旁组织的基因表达谱。
使用对TCGA数据的对数秩检验创建Kaplan–Meier生存曲线，以比较TGIF2高组和TGIF2低组。使用GraphPad Prism5软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）分析所有数据。结果以平均值±SD表示，人类样品和动物模型数据除外，均以平均值±SEM表示。除非另有说明，否则使用两尾学生t检验（两组）或单因素方差分析（超过2组）计算P值。当P <0.05 时，结果被认为具有统计学意义。
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