摘要
复杂的微环境支持胰腺导管腺癌（PDAC），其对化学抗性的物理作用可以通过超声（US）治疗来克服。这项研究旨在调查US诱导的惯性空化与化学疗法通过微环境破坏改变肿瘤细胞活力的能力。为此，我们使用了部分模仿肿瘤及其微环境的3D共培养PDAC模型。通过使用磁性纳米穿梭法获得了结合自KPC转基因小鼠的DT66066细胞和鼠类胚胎成纤维细胞（iMEF）的共培养球体。球体暴露于具有增加的惯性空化指数的US。研究的条件包括对照，吉西他滨，美国空化和美国空化+吉西他滨。通过减少刃天青和流式细胞仪评估球体的生存能力。3D共培养球体模型结合了活化的成纤维细胞并产生了1型胶原蛋白，从而通过其微环境提供了肿瘤的部分缩影。主要发现是：（a）与KPC（无成纤维细胞）球体相比，吉普他滨（5μM）在存在KPC / iMEFs球体时细胞毒性明显降低；（b）与单独使用吉西他滨相比，美国诱发的惯性空化结合吉西他滨显着降低了球体的生存能力；（c）空化和化学疗法都影响KPC细胞的活力，但不影响成纤维细胞的活力，这证实了后者对肿瘤细胞的保护作用。当KPC和iMEF的共培养球体暴露于美国空化作用时，吉西他滨的毒性会增强。
胰腺导管腺癌（PDAC）是最可怕的恶性肿瘤之一，死亡率高且预后差。PDAC的发病率迅速增加，预计将在未来十年内成为西方世界癌症死亡的第二大诱因1，而总体5年生存率不到5％最近并未显着提高。目前PDAC的治疗包括积极的化学疗法和手术切除，但由于该疾病的早期局部和转移性扩散，仅20％的患者被认为适合尝试根治性切除2。化学疗法是局部晚期和转移性病例的护理标准3但是最近有证据表明，肿瘤微环境是PDAC患者化学耐药的主要手段。胰腺星状细胞（PSC），也称为癌相关的成纤维细胞（CAF），是微环境中最重要的宿主细胞之一。它们很大程度上参与了在PDAC 4中几乎经常观察到的强烈的去增生反应，因此在化学抗性中起着重要作用，因为化学治疗剂虽然在体外对PDAC细胞有效，但被隔离在体内或不允许其渗透到基质和组织中。达到恶性细胞5。在肿瘤微环境中，低氧和低血管化也阻碍了化学毒性，而免疫检查点抑制剂可能无法有效地靶向，部分原因是相同的。因此，迫切需要在PDAC中开发创新治疗方法，这表明基质破坏或重塑是改善PDAC预后的最有前途的方法，而不是更有效的抗癌药物。实现该目标的一种方法是使用能够显着改变基质特性（例如其内部凝聚力和弹性，间隙压力，氧合等）的物理试剂。多细胞肿瘤球体模型已成为病理生理学和抗肿瘤研究的强大工具6。三维肿瘤球状体已通过获得三维架构使肿瘤细胞行为的更精确的表征7，8，9。这些培养模型对于评估新的治疗方法非常有用且相关。
用于药物和基因递送的治疗性高强度超声（US）10是一种这样的方法。美国引起的空化是一种非热机械现象，其“惯性”或暂时形式可能通过促进分子通过细胞膜的渗透和/或诱导微环境破坏而产生，以增加化学疗法的治疗效果11。我们的研究小组先前曾报道过超声惯性空化在PDAC 12单细胞球体模型中诱导肿瘤生长减少的功效。在这项研究的进一步步骤中，我们想确定当基质细胞的某些关键成分支持肿瘤细胞时，空化是否具有改变肿瘤活力和化学抗性的能力。为此，我们开发了一个3D模型，该模型由肿瘤细胞和具有微环境的模仿胰腺癌的活化成纤维细胞组成。
在KPC鼠腺癌+鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）共培养的球体（KPCF球体）生长的第3天，免疫荧光成像显示m-cherry和GFP表达分别在KPC和成纤维细胞中共定位。根据观察到的不同部分，球体的结构组织是异质的。图 1说明了球体中两种细胞类型的随机分布。在肿瘤细胞和成纤维细胞之间没有球形内区域化的模式。3D共培养的肿瘤球体在培养3天之内的最宽横截面达到300 µm（SD = 2.4）的平均面积。
生长第3天时KPCF球状体的免疫荧光成像。KPC和iMEF分别表达了mCherry（红色）和Green Fluorescent Protein（绿色荧光蛋白）（GFP），用于两种成分的清晰免疫荧光分界。
在通过HE和Masson's Trichrome进行标准染色后，第10天的组织学分析（即清除纳米颗粒后允许石蜡包埋和切片）表明存在成纤维细胞合成的胶原蛋白，蓝色可见。球体的外围的特征在于结缔组织显示出与上皮层相似的排列。尽管球状体的中心由生长10天后的大多数死细胞组成，但两种类型的细胞在球状体外围仍清晰可辨。该组织学切片如图2所示。 阐明了人类PDAC肿瘤切片与共培养的球状模型及其坏死中心之间的相似性，存在从中心到外围增加的细胞生存力梯度，癌细胞和产生胶原的活化成纤维细胞的错综复杂的排列，形成了肿瘤微环境。
孵育10天后，KPCF椭球的组织学切片（5微米）。用HE（苏木精曙红）和Masson's Trichrome染色。胶原纤维呈蓝色。淡黑色的沉积物对应于残留的磁性纳米颗粒。
吉西他滨在共培养和单型KPC球体模型中均降低了生存能力（图 3）。与单独使用KPC细胞相比，在存在KPC + iMEF的情况下，孵育24小时后低剂量吉西他滨的细胞毒性显着降低。由于两组均包含不同数量的细胞，因此该分析评估了Gem组与他们自己的对照组之间的生存率。宝石处理后的活力比在KPCF中显着优于KPC球体（p <0.01）。
与对照相比，用Gem处理的KPCF和KPC球体之间的生存力比率。在小剂量（5μM）吉西他滨孵育24小时后测量生存力：比较KPCF（KPC +成纤维细胞）与 KPC（单型）球体模型（每种情况下n = 6个球体）。
在不同的空化方案（CI或空化指数）下，将KPCF球状体暴露于5μM宝石或超声空化下，得出以下存活率：（a）仅5μMGem与 CI 14 + 5μMGem：91.2％（SD = 5.7）分别为 68.6％（SD = 4.0）（p = 0.0050）（图 4a）；（b）单独的5μM宝石与 CI 20 + 5μM宝石：90.8％（SD = 3.5）对 74.7％（SD = 5.5）（p = 0.0051）（图 4b）; （c）5μMGem单独vs CI 26 + 5μMGem：83.8％（SD = 2.9）vs 68.3％（SD = 2.5）（p = 0.0051）（图 4c）。将各组的测量值与细分为100％生存力的对照组进行比较。
各种治疗条件后的KPCF活力：Gem / US / US + Gem。（a）美国CI 14治疗后KPCF的生存力是否与宝石暴露相结合。每个条件下N = 6个球体。（b）美国CI 20处理后KPCF的生存能力是否合并了宝石暴露。每个条件下N = 6个球体。（c）美国CI 26处理后KPCF的生存力是否与宝石暴露相结合。每个条件下N = 6个球体。
使用细胞仪分析球状胰蛋白酶处理后的治疗后生存力分析表明，只有KPC细胞受到各种处理的影响（图 5和示例图 6））。在生长的第3天，对照组中仍存在51.1％（SD = 4.9）的KPC细胞和53.4％（SD = 5.4）的成纤维细胞。暴露于5μM宝石或US CI 20会导致KPC活力显着降低（p = 0.028），但不影响成纤维细胞（p = 0.885）。与对照组（p = 0.028）相比，提交给US CI 20空化作用的KPC细胞仅产生32.9％的活力（SD = 4.7）。与对照组相比，吉西他滨的生存力为16.4％（SD = 1.8）（p = 0.028）；与对照组（p = 0.028）相比，US CI 20 +吉西他滨产生了9.5％的生存力（SD = 3）。同时，iMEF的生存能力没有受到显着影响。
美国CI 20处理和宝石暴露后KPCF球体的生存能力。细胞仪分析。基于4个重复实验的分析，每种条件下合并了6个球体。
评估通过各种处理后从解离的KPCF球状体中KPC细胞的BV 510-A测量的生存能力的细胞仪分析示例。
在这项研究中，我们开发了KPCF 3D共培养模型，该模型可提供PDAC肿瘤的微型表示并显示恶性微环境的相关特征。发现该模型具有高度可复制性和易于处理的特性，并适合于使用HIFU和US空化等物理因子进行实验。该模型具有一些固有的局限性，流式细胞仪分析表明生长3天后，KPCF球体中几乎50％的PDAC细胞自然死亡。可以通过在第3天最大的横截面平均300 µm（SD = 2.4）的大尺寸椭球体以及体外血管的固有特征来解释这种观察结果球形。除了没有血管形成之外，KPCF球体的物理特性可能与PDAC肿瘤的物理特性不同，并且缺少其他重要的细胞群体，特别是那些由炎症浸润和肿瘤淋巴细胞组成的细胞群体，是这种模型的另一个局限。但是，支持人类PDAC发育的基质细胞被认为是本质上与癌症相关的成纤维细胞，其源自间充质干细胞或胰腺星状细胞，它们产生胶原蛋白和透明质酸基ECM，并带有各种特定的表面蛋白（a-SMA，FSP -1，FAP-A，PDGFR-b，SPARC ...），其激活/抑制可导致要么肿瘤抑制或促进，特别是通过ECM刚度的调制13，14，15。也有人提出，由相对固定的凝胶-流体相引起的基质内较高的组织间隙压力可引起血管萎缩和灌注不足，这是胰腺癌治疗耐药的主要机制 16。我们的模型与真正的PDAC的不同之处在于，它没有任何血管形成，并且细胞间运输肯定比临床环境复杂得多。然而，它具有PDAC的至少3个关键特征，使其在细胞上水平上可以逼真的近似：活化的成纤维细胞的存在，ECM的产生以及由于无血管结构和密集的细胞间排列而产生的较高的组织间压。
我们的实验表明，如iMEFs加KPC细胞的存在，与单独的KPC细胞相比，低剂量5μM的吉西他滨的细胞毒性显着降低，如细胞活力分析所示。因此，KPCF模型中活化的成纤维细胞或成肌纤维细胞的存在似乎在充当基质相关化学耐药性的替代物。与单独使用吉西他滨的模型相比，美国诱发的与吉西他滨相关的空化增强了活力的显着降低，这支持了我们的假设，即空化可以帮助克服基质相关的化学耐药性。实质上，尽管在吉西他滨和空化实验下，关于KPC和KPCF球体的差异生存力的实验之间的条件并不完全相同，有人提出，当球体中存在iMEF时，空化可显着帮助克服吉西他滨的药效下降。此外，Gem和US处理仅降低KPCF球体中KPC细胞的活力，而不降低成纤维细胞的活力，这与预期的对恶性细胞的毒性要远高于对微环境的细胞的毒性相符。但是，对应于增加的美国强度（CI 14/20/26）的空化指数的增加似乎并未影响球体的生存能力。确实，在US CI 14/20/26加Gem后KPCF生存力的平均值分别为68.6％，74.7％和68.3％，但统计汇总的比较将是不正确的，因为这些值未遵循完全相同的分布。产生这种“开-关”气穴效应的原因，是否可以通过进一步的实验证实这一点，还有待解释，因为人们可能已经预料到了剂量效应的相关性。更好地了解惯性空化触发的阈值将很有用，并且非线性影响以及可能由于化验管内的湍流和不希望的球体运动而破坏细胞膜（尽管有细而深的凝胶模制槽）调查。然而，我们的发现支持了我们的主要假设，即惯性空化破坏球体的非恶性成分（即成纤维细胞和ECM）并随后增强药物细胞毒性的能力。非线性效应以及由于湍流和化验管内的不期望球状运动（尽管凝胶模制槽较深和较深）造成的细胞膜损伤的可能的cell灭仍需要进一步研究。然而，我们的发现支持了我们的主要假设，即惯性空化破坏球体的非恶性成分（即成纤维细胞和ECM）并随后增强药物细胞毒性的能力。非线性效应以及由于湍流和化验管内的不期望球状运动（尽管凝胶模制槽较深和较深）造成的细胞膜损伤的可能的cell灭仍需要进一步研究。然而，我们的发现支持了我们的主要假设，即惯性空化破坏球体的非恶性成分（即成纤维细胞和ECM）并随后增强药物细胞毒性的能力。
关于在我们的模型以及活组织中由空化引起的生物损伤的机制，可能提出了惯性空化的不同属性：增加的细胞膜通透性，细胞膜的破坏增加了通过声穿孔或超声特异性热的药物摄入效果。此外，考虑到仅美国申请就能降低KPCF球体生存力这一事实，可能会发生除声孔形成之外的其他机制。除其他外，还可以涉及反应性羟基物质（ROS）的合成，因为已知惯性空化引起的微气泡内部的水蒸气热解会生成ROS 17。尽管仍然难以理解超声诱导的空化在多大程度上是由声穿孔，自由基产生，超声特异性热效应或所有这些因素的特定组合所产生的，但重要的是要注意本文描述的超声应用的原理与先前报道的方法有很大不同。在广泛描述的方法中，直径为1–10μm的微气泡可以以造影剂或声波敏感的纳米载体的形式提供给声场，并在受到中等负压（例如，在1 MHz超声场内为−0.1 MPa）。但是，通过施加更大幅度和更长脉冲的负压（例如，在我们的研究中分别高达-3.5 MPa和2.5 ms），也可以在没有外部气泡的情况下触发空化。在这种情况下，介质中的气体浓度越高，最容易发生气蚀。将所得微泡溶解在组织和水蒸汽的气体的形成18，19，20。例如，声穿孔法作为增强药物输送的方法通常需要较低的超声强度，但不太可能对细胞外基质产生任何显着改变21，以及使用微泡或可替代的起泡颗粒，以增强空化依赖于新血管网络的存在传达气泡更靠近肿瘤的结构，其密度通常在PDAC非常低的或不存在的22，23。最近报道了用吉西他滨和市售的基于微气泡的造影剂联合低强度诊断性US激发治疗的PDAC患者的有趣临床结果，其中十分之五的患者显示肿瘤大小减小，并且中位生存期异常长17.6个月，而历史对照组为8.9个月24。然而，这项不受控制的研究的规模小和方法学局限性不足以说服静脉注射的微泡可以在正确的位置和正确的时刻触发空化并增强化学细胞毒性。通过使用相对较高的US强度（尽管低于临床体外碎石术的强度）和设备的集中几何形状，可以在不需要外部提供气泡的情况下产生惯性空化，而无需考虑血管的密度，我们证明了US可以破坏血管肿瘤微环境，并以比其他方法更适合PDAC治疗的方式增强药物传递。
据我们所知，这项研究是在模拟肿瘤微环境的PDAC 3D共培养球体模型PDAC的3D共培养球体模型中，首次评估了US诱导的与化学疗法相关的气蚀的有效性。在PDAC的发展过程中，激活的PSC负责细胞外基质（ECM）产生与降解之间的不平衡，从而导致产生强纤维化基质25。在过去的十年中，许多在体外的癌症3D模型已经发展到探讨肿瘤的行为和其微环境的关系，26，27。球形3D体系结构能够模仿ECM组织和缺氧性肿瘤区域28。已经描述了许多关于球体培养的协议，这些协议通常涉及大量的制造程序和耗时的分析6。磁性三维细胞培养悬浮通过允许迅速生产健壮和相关的球状体球状体革命性模型29，30，31。PDAC共培养球体模型似乎与评估新途径和创新疗法有关，因为它可以在一定程度上模拟微环境和化学耐药性。该模型可确保出色的重现性，并且操作简便且安全，不会丢失或破坏样品。仍然，关于纳米穿梭培养的可能毒性必须提到潜在的局限性。Souza GR 等。31已证明磁性纳米颗粒不影响细胞增殖和代谢。此外，我们以前的工作表明，在吉西他滨暴露12下，纳米穿梭对细胞活力，增殖或细胞化学敏感性均无影响。在这项研究中，以前的单层成纤维细胞培养物显示，与无纳米梭培养的成纤维细胞相比，无纳米梭培养的成活率降低了14％（p = 0.0014 ）。
另一个需要注意的问题是胶原，组织学分析已在球状生长的第10天证明了胶原的存在。纳米穿梭管中氧化铁的存在，排除了在美国和化疗接触时进行较早的组织学评估，并需要延迟组织学分析。因此尚不确定仅生长3天后是否可检测到胶原蛋白和ECM的产生。最后，美国申请和Gem仅被管理了一次。考虑连续治疗可能会增加球体生存力的协同功效。
尽管有其固有的局限性，但本研究中使用的KPCF 3D共培养模型考虑了微环境的关键要素，为体外研究提供了可靠且可重现的PDAC近似值。与单独使用吉西他滨相比，与吉西他滨相关的超声诱导的惯性空化与细胞活力显着降低有关，并且已成为克服iMEF产生的化学敏感性障碍的决定性因素。
PDAC的KPC（Kras（G12D）; p53（R172H）; Pdx1-Cre）模型是一种基因工程小鼠模型，该模型整合了胰腺细胞32中突变的KrasG12D和p53R172H等位基因的条件表达。将KPC细胞系在含10％胎牛血清，补充1％青霉素，1％环丙沙星的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养，并在37°C的5％CO 2中培养。
在与KPC细胞相同的条件下培养通过shp53转导而分离并永生的鼠胚成纤维细胞（iMEF）。KPC和iMEF都是通过INSERM U1037（法国图卢兹的Oncopole）的慷慨捐助获得的。KPC和iMEF分别表达了mCherry（红色）和Green Fluorescent Protein（绿色荧光蛋白）（GFP），用于两种成分的清晰免疫荧光分界。所有实验均按照法国指南和法规进行，并获得了科钦研究所科学委员会的批准。使用Noel P. 等人先前描述的磁悬浮技术创建球体。29。这种磁性3D生物打印方案允许快速且可重现地生产球状体，并在随后的操作和US暴露期间促进了处理。在两种细胞系中均使用了由聚L-赖氨酸，氧化铁和金纳米颗粒组成的纳米梭（NS），以0.15 mg / mL的浓度标记胰腺肿瘤细胞和成纤维细胞。在先前的研究12中，我们显示了在吉西他滨暴露后，NS均不影响细胞活力，增殖或化学敏感性。成纤维细胞进行预处理，在50纳克/毫升TGF-β（肿瘤生长因子β）（PeproTech®，USA）中的溶液，以获得成肌纤维细胞表型，促进促结缔组织增生性反应共培养前24小时33，34。将KPC和iMEF细胞分别以10,000个细胞/孔和20,000个细胞/孔共接种，并使用具有细胞排斥表面的24孔板（GreinerBio-One®，德国）在800μL培养基中生长为3D球体。在进行任何其他处理之前的3天内，球体都保持不变（图 7）。
共培养方案/肿瘤球的形成/治疗方案设计。
使用共聚焦显微镜Spinning DiskLeica®DM6000（德国Leica®）获取来自球状体的荧光显微镜图像。分别使用MetaMorph®软件（美国，MolecularDevices®）和ImageJ®软件（美国，NIH，ImageJ®软件）来采集和分析图像。
在5微米厚的石蜡切片上用4％多聚甲醛固定球体后进行组织学分析。如前所述，球体内的纳米粒子清除生长8天后接近完全30。生长10天后进行组织学分析。球体切片用标准苏木精和曙红以及Masson Trichrome染色以检测胶原蛋白。
共焦美国设备类似于我们先前的研究12，并由Chettab 等描述。使用35并使其适合球体，以便以可控和可再现的方式传递惯性空化（图 8）。超声发射装置由两个直径为50 mm的压电陶瓷聚焦换能器组成，其曲率为50 mm，其工作频率为F = 1.1 MHz，其正交排列可实现精确的束聚焦（聚焦体积2×2×2 mm 3）。波形发生器（PXI 5412 National Instruments，德克萨斯州奥斯汀）产生激励信号，并使用200 W功率放大器（LA200H，Kalmus，Bothell，WA）放大信号，产生2750个正弦周期脉冲，PRF为100 Hz（重复周期10毫秒）和25％的占空比（脉冲持续时间2.5毫秒），因此基本上产生了惯性气蚀方案。在Eppendorf管内，焦点处的峰值负压在0.4到3.5 MPa的范围内变化（相关的声强范围为5–408 W.cm -2，减小到1.3–102 W.cm -2距离焦点1毫米）。将换能器浸入抑制气蚀的流体Ablasonic™（法国EDAP-TMS）中，从而防止在超声处理的样品外部发生声气蚀。放在水箱中的室内水听器记录了聚焦区域的声空化辐射。轻轻地抓住单个球状体，并将其转移到专为美国聚焦而设计的改良Eppendorf管（Eppendorf®，德国）中，以使球状体在整个手术过程中始终位于焦点内。在20秒内将受控的空化作用施加到每个单个球体上。不同的样品被暴露于递增的空化指数（CI），即CI 14，CI 20和CI 26，对应于不断增加的超声强度。
改进的Eppendorf®管中的球形位置。
化学疗法包括将单个球状体与吉西他滨（Gem）（吉西他滨Mylan，法国迈兰医疗公司，法国，40 mg / ml）与100 mM的二甲基亚砜储备液一起孵育。将宝石以5μM的浓度在培养基中于37°C施用4 h。
最初的经验旨在评估成纤维细胞如何影响球状微肿瘤对化学疗法的反应。将来自KPC和iMEFs共培养的多细胞球体（称为KPCF球体）与仅来自KPC细胞培养物的单型球体（称为KPC球体）进行了比较。KPCF椭球由每孔10 4个 KPC细胞和2.10 4个 iMEF组成，而KPC椭球仅由10 4个每孔KPC细胞。在生长的第3天，用Gem处理了6个KPCF和KPC球体，并与6个未处理的KPCF和KPC球体作了对照。对于美国实验，将单个球体从其培养板转移到改良的Eppendorf®管中，以用于美国应用。然后将球体返回其初始培养基，并在24小时内孵育。所有实验均重复三次。
代谢活性细胞对刃天青的减少是用于评估生存力的方法（用10％的Uptiblue®溶液测量）。然后，在530-560 nm激发波长和590 nm发射波长下，使用分光荧光法（Fusion ?， Packard Bioscience，美国）测量荧光强度。所有实验均重复三次。在Fortessa®流式细胞仪（BD®，Becton，Dickinson and Company，USA）上针对两种类型的细胞独立进行了活力测定的流式细胞仪分析。选择US CI 20进行美国处理过的球体的流式细胞术实验：处理后，在测定管中收集六个球体，并使用1 ml胰蛋白酶溶液（0.25％Trysin-EDTA，Gibco®，Thermofisher science）解离。然后用BV-510活力标记物标记细胞。FSC和SSC，分别在530和650 nm处提供绿色和红色荧光信号，并对每个细胞评估BV-510标记。每个试管总共记录了10,000个事件。每个条件下对六个解离的KPCF球体进行了四次所有实验。在固定的仪器设置下进行测量。使用软件（LLC，美国）分析结果。
为了进行统计分析，考虑了研究条件的数量（超过2个），进行了ANOVA测试。曼-惠特尼检验用于细胞计数结果。在GraphpadPrism®软件（GraphPad Software，Inc.，美国加利福尼亚州拉荷亚）上进行统计分析。ap值<0.05认为结果具有统计学意义。
|
|
