摘要
因子VII（FVII）活化蛋白酶（FSAP）是循环的丝氨酸蛋白酶。基于马尔堡一世（MI）（Gly221Glu，胰凝乳蛋白酶编号系统）多态性的人类遗传研究将FSAP纳入许多疾病的发病机理。在这里，我们描述了在使用中表达的重组蛋白的220循环所造成的Gly221Glu取代的分子和功能的变化大肠杆菌。野生型（WT）FSAP的丝氨酸蛋白酶结构域（SPD）显示出自动催化激活，而MI同工型显示出对生色底物S-2288，因子VII，组织因子途径抑制剂以及非常低的自身催化激活和蛋白水解活性。尿激酶原。在激活位置（Arg15Gln）引入嗜热菌素裂解位点导致WT-和MI-SPD均被裂解，并且产生的WT-SPD而不是MI-SPD活跃。将Gly221位置突变为Asp，Gln和Leu导致活性丧失，而Ala取代则部分具有活性。这些结果表明，MI-SPD中活性位点受到干扰，或者底物无法接近活性位点。关于金属离子的调节，钙比钠更能增加WT-SPD的酶促活性。从而，
因子VII（FVII）激活蛋白酶（FSAP）是在肝细胞中产生的一种循环丝氨酸蛋白酶。最初的基因产物被分泌为无活性酶原，称为pro-FASP 1。全长蛋白包括三个表皮生长因子（EGF）结构域，其后是与肝细胞生长因子激活剂（HGFA）中发现的SPD域同源的kringle域和C端丝氨酸蛋白酶域（SPD）2。 XIIa以及组织和尿激酶纤溶酶原激活物（tPA和uPA）（图 1A）。Pro-FSAP与带正电荷或带负电荷的模板分子相互作用，并发生构象变化，导致自催化活化3。推测在轻链中的SPD和重链4之间的Arg15-Ile16位上的FSAP前体的切割暴露出新的N-末端（Ile16），该N-末端与Asp194形成盐桥，如在其他成员中胰凝乳蛋白酶家族5（胰凝乳蛋白酶编号系统）。基于与其他凝血因子的同源性，已经提出6，FSAP具有结合Ca 2+的70环和结合Na +的220环/ 180环7。
FSAP的示意图结构和表达的蛋白质。（A）FSAP具有3个EGF结构域，一个kringle结构域，其后是催化丝氨酸蛋白酶结构域（SPD）。（B）在本研究中表达的不同构建体的示意图结构。箭头指示激活位点（313）的位置和MI多态性（534）的位置，以及它们在胰凝乳蛋白酶编号系统中的位置。
大约5％的高加索人口是FSAP基因中称为Marburg I（MI）SNP的单核苷酸多态性（SNP）的携带者，该基因导致蛋白酶结构域8中的单个氨基酸（Gly221Glu）交换。氨基酸改变位于220环中，靠近活性位点的S1口袋。从人类血浆中分离出来的MI-FSAP对野生型uPA，因子VII（FVII），组织因子途径抑制剂（TFPI）和激肽原9等多种底物的水解活性比WT相对要低5倍。发现MI-SNP与颈动脉狭窄10，肝纤维化11，甲状腺癌12和中风13的晚期并发症有关。当在疾病模型系统中测试时，FSAP -/-小鼠患有更严重的肝纤维化14，中风15，新内膜形成16，并受到保护以抵抗血栓形成17。因此，有必要了解为什么MI-FSAP具有较低的酶活性，以及这如何导致病理生理后果。
重组FSAP在哺乳动物细胞中产生由三组日期18，19，20。WT-FSAP的过表达通过凋亡诱导细胞死亡，从而限制了表达。通过引入使FSAP 18失活的点突变可以克服这个问题。Hasumi和他的同事们采用了类似的策略来生产用于催化结合研究的无催化活性的Ser195Ala突变体20，而Mertens和他的同事们通过在激活位点（Arg15Gln）引入突变使其对自激活具有抵抗力，从而解决了这个问题。Arg15Gln突变体保持蛋白水解性失活，直到被外源添加的嗜热菌蛋白酶19裂解为止。。他们认为，Gly221Glu多态性干扰了酶原形式向催化活性蛋白酶7的转变。嗜热菌蛋白酶是常见的锌依赖性蛋白酶，其在随后是疏水残基的位置裂解。嗜热菌蛋白酶的问题在于，它可能会在100多个不同的位置裂解FSAP，从而在下游实验中引入潜在的假象。因此，需要建立用于重组活性FSAP的稳健的表达系统。
在这里，我们描述了一种在大肠杆菌中表达 FSAP的丝氨酸蛋白酶结构域（SPD）并针对自然和生色底物进行野生型（WT）-SPD和MI-SPD同工型的生化表征的新策略，并研究了它们的调控通过抑制剂和金属离子。在MI位置引入了其他突变，以了解丧失活性的原因。进行活性位点配体的结合和同源性建模以表征这些同工型。
全长FSAP，不包括信号肽，（氨基酸24- 560 ）（编号系统斜体是指完整FSAP包括信号肽），SPD-FSAP（氨基酸292-560）和各种其它的突变体被克隆到PASK -IBA33plus载体（IBA-Lifesciences，哥廷根，德国），包括C端6 X His标签。SPD-FSAP除了完整的轻链蛋白酶结构域（包括链间二硫键）外，还包含来自重链C末端的22个氨基酸。另外，在His标签之前，在N末端添加Met残基，并添加Ser-Ala-Arg-Gly-Ser序列。所有突变体均通过定点诱变制备（Stratagene，拉荷亚，加利福尼亚）（图 1B））。在100 µg / ml氨苄青霉素琼脂平板上选择阳性转染的BL21-金细胞（DE3）（Agilent，Santa Clara，CA）。用300 µg / L脱水四环素诱导表达，制备了包涵体。离心洗涤包涵体，并在50 mM Tris（pH 8.0），5％（vol / vol）甘油，100 mM NaCl，1 mM 2-巯基乙醇，100μg/ ml溶菌酶和不含EDTA的蛋白酶抑制剂中进行超声处理（Roche，Mannheim，德国），并通过离心沉淀。将包涵体重悬于TNU缓冲液（100mM Tris pH 8.0、300mM NaCl，5mM 2-巯基乙醇，8M尿素）中1小时。将可溶性级分加载到预先平衡的Ni-琼脂糖柱（Qiagen，Hilden，德国）上，并用含15mM咪唑的TNU缓冲液洗涤，并用含400mM咪唑的TNU缓冲液洗脱。
通过确定生色底物S-2288的水解来监测和优化重折叠，如下所述。展开/纯化FSAP滴加到100毫摩尔Tris（pH值7.5），125毫摩尔MgCl 2，100mM的氯化钾，2mM的还原型谷胱甘肽（GSH），1mM的氧化型谷胱甘肽（GSSG），1M NDSB-201（3- （1-吡啶基）-1-丙磺酸盐），21°C下的5％甘油，每100 ml缓冲液中含20 mg蛋白质。将制剂缓慢混合48小时，然后以12,000× g离心 10分钟以清除沉淀物。使用旋转浓缩器进一步浓缩FSAP-SPD，并使用ÄKTA纯化器（GE Healthcare）在凝胶过滤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl）中的Superdex 75色谱柱（GE Healthcare，奥斯陆，挪威）上再次纯化。重组蛋白通过使用Edman方法（德国吉森大学的Guenther Lochnit）的N-末端测序来表征。凝胶过滤后，WT-SPD的制备物在储存时易于自蛋白水解，可立即用于实验中。
如先前所述21进行活性部位滴定。将该酶缓冲液交换成5 mM Tris（pH 8.0），150 mM NaCl，2 mM CaCl 2。将在甲醇中的50μM 对硝基苯基对氨基胍盐（PNPGB）用作底物，并使用18300 M -1 cm -1作为消光系数在402 nm下测量破裂。如先前所述进行FSAP活性测定22。简而言之，使用96孔微量滴定板，标准测定系统由25 mM Tris（pH 7.4），137 mM NaCl和CaCl 2组成（2 mM）和0.1％（wt / vol）Tween-20和0.25 mM发色底物S-2288（HD-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺二氯化氢）（Chromogenix，默恩达尔，瑞典） ），然后在酶标仪中于405 nm在37°C下60分钟的时间。使用Graphpad Prism软件（版本7.02）（加利福尼亚州圣地亚哥）将数据拟合到Michaelis-Menten方程。
FSAP-SPD与pro-uPA（Grünenthal，Stolberg，Germany）一起孵育，并通过添加0.2 mM的生色底物S-2444（L-焦谷氨酰基-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺二氯化物）来测量其活化（ Chromogenix）。在酶标仪中于405 nm在37°C下吸收60分钟。FVIIa凝血活性是在存在重组可溶性突变组织因子（TF）23的情况下测定的。简而言之，将FVIIa溶液与等体积的FVII缺乏血浆（Roche Diagnostics，曼海姆，德国），TF和磷脂的混合物（PTT试剂，Diagnostica Stago，Asnieres，法国）和25 mM CaCl 2混合。。在酶标仪中于37°C和405 nm处监测凝血和浊度变化。在每个孔中，总FVII / FVIIa的最终浓度设置为5 nM，TF设置为60 nM。产生的FVIIa的水平相对于WHO 1吨定量ST国际标准的FVIIa浓缩物（1国际单位/毫升的FVIIa对应于20毫微克/毫升或0.5纳米）。
将重组全长TFPI（由荷兰Maastricht的T. Hackeng提供）在HBS-BC（HEPES（25 mM）中，分别与25–200 nM WT-和MI-SPD在37°C孵育30分钟。 pH 7.4，NaCl（100 mM）补充有牛血清白蛋白（BSA）（0.5％wt / vol）和CaCl 2（3 mM）。通过将10 µl反应混合物转移到1 µl 160 µM抑肽酶中来终止反应。残余TFPI活性的测定如前所述，稍作修改24。简而言之，将90微升0.44 nM FXa（在HBS-BC + 0.1％wt / vol Tween-20中稀释的0.44 nM FXa）（稀释于HBS-BC + 0.1％wt / vol Tween-20中）添加到经抑肽酶处理的反应混合物中，并在室温下孵育15分钟。 37°C允许TFPI和FXa之间形成复合物。加入40 µl预热的磷脂（PTT试剂）和20 µl 2 mM生色底物S-2765（Na-苄氧基羰基-D-精氨酰基-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺-二盐酸盐）（Chromogenix ），在酶标仪中于405 nm和37°C下测量残留FXa活性。相对于如上所述用FXa孵育的TFPI稀释系列，定量残余TFPI活性。
用多克隆兔FSAP抗体（5ug / ml）包被高结合ELISA板（Costar，Cambridge，MA），并用BSA（3％wt / vol）封闭后，捕获WT-或MI-SPD。毕奥- PPACK，毕奥-抑肽酶，毕奥- Mab570在用25mM Tris（pH值7.4），137 mM的NaCl的缓冲液中的溶液，用2mM的CaCl 2，0.3％（重量/体积）BSA和0.1％（重量/体积）Tween-20。充分洗涤后，将板用过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素显影，并用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物显影。不添加WT-或MI-SPD而与板结合用于获得空白值，在SPD存在下从结合中减去空白值以获得特异性结合。在竞争实验中，在增加浓度的抑肽酶或PPACK存在下确定Biot-PPACK的结合。
FSAP-SPD的同源性模型是使用蛋白质结构预测程序I-TASSER 25生成的。使用C端（Ile314-Phe560）的247个残基作为输入序列，并使用uPA（PDB ID：2VNT）作为模板构建模型。所有模型的C得分（置信度得分）在0.83至0.85范围内，TM得分（结构相似度）在0.83±0.08之间，表明模型具有正确的拓扑结构和相似度26。为了分析金属离子的结合位点，将WT-SPD模型叠加在FXa结构（PDB ID：2JKH）上，其中Na +和Ca 2+描述了结合位点。可视化模型，并使用PyMOL Molecular Graphics System绘制图形；版本1.7.2.0（Schrödinger，LLC）。
全长FSAP（第24-560位氨基酸）在大肠杆菌中表达，但不能从包涵体中重新折叠。甲SPD构建跨越重链的22个氨基酸（氨基酸292 - 560）以包涵体有效地制造，并且可以重折叠成活性蛋白酶（参见图 1B（用于本研究的构建体的详细信息），并用于本研究的所有实验。蛋白酶结构域中的重链和Cys122之间的链间二硫键保留在该构建体中。通过测量生色底物S-2288的水解来优化重折叠条件。该制剂的活性状态表明该蛋白在重折叠过程中经历了经典的自催化活化，并在Arg15-Ile16处裂解（参见下文）。WT-SPD在重折叠缓冲液中非常稳定。根据输入蛋白质的量，由于大量沉淀，重折叠过程的总产量为10％至15％。活性部位滴定显示最终可溶性WT-SPD制剂中有59±4％（n = 3种不同的制剂）具有活性。制剂的均一大小表明无效部分被错误地折叠，但是对此没有进一步研究。在初步实验中，对苯甲idine-琼脂糖的亲和力选择显着增加了活性位点的浓度，但这也增强了自蛋白水解作用。因此，我们建立了一种制备FSAP SPD的可靠方法，方法是将FSAP的SPD生成为未折叠的蛋白质，并通过控制性折叠产生活性形式。
我们进行了广泛的测试，以检查蛋白质是否可以在不同条件下在不同细菌中以可溶形式表达。这包括在低温（例如15°C，22°C和30°C）下诱导表达。用八种不同的具有不同pH值，离液剂和离子组成的溶解度缓冲液提取细胞沉淀，但未产生功能性可溶性蛋白。补充图 S1显示了在诱导后直至4小时的不同时间点，不同细菌菌株中的FSAP表达。
WT-SPD的自动激活可以在还原条件下进行SDS-PAGE，因为重链中会丢失22个氨基酸，分子量从30.6 kDa变为28.1 kDa。30.6 kDa条带的N端测序显示了预期的STKLP序列，而28.1 kDa条带以WT-SPD中的Ile16（IYGGF）开始（图 2A）。N端Met残基可能被大肠杆菌氨肽酶去除了。WT-SPD的自激活动力学显示在4°C下48 h的最大激活（图 2B）。MI-SPD最多显示3天没有激活（图 2B），在进一步的实验中显示长达1周，但在4°C下长时间保存数月会导致某些制剂自动激活（图 2C））。显示出通过MW变化而自动激活的MI-SPD制剂对生色底物S-2288具有非常低的酶活性。在重折叠步骤中，相对于蛋白质量，MI-SPD的回收率比WT-SPD高约2倍。由于其极低的催化活性，因此无法在MI-SPD上进行活性部位滴定。
激活WT-和MI-SPD。（A）将WT-SPD重新折叠，并在还原的SDS-PAGE上与未折叠的蛋白质进行比较，然后对凝胶进行考马斯染色。对应于条带的N末端测序结果显示在右侧，MW标记显示在左侧。（B）WT-和MI-SPD制剂重新折叠的时间过程为24-72小时。（C）WT-和MI-SPD制剂在48 h内的重折叠与3种不同MI-SPD制剂的重折叠状态相比，MI-SPD的三种制剂在-20°C下储存6个月后，表现出不同程度的活化。（D）将WT-SPD（Arg15Gln）和MI-SPD（Arg15Gln）（5μg）与嗜热菌素（1μg/ ml）在37℃下孵育15分钟。SDS-PAGE，然后对凝胶进行考马斯染色。（E）将相同的混合物与生色底物S-2288一起温育，并且在底物水解之后，通过测量在405nm处的吸光度，并表示为mOD / min（平均值±SD）。
在将激活位点从Arg15突变为Gln后，我们还比较了WT-和MI-SPD的自动激活，以防止自动激活并通过嗜热菌蛋白酶控制激活。如预期的那样，WT和MI同工型的Arg15Gln突变体均未显示出自动激活。两者均可以通过嗜热菌素激活，这通过条带的分子量变化以及N端测序证实（图 2D）。如从原始N端序列（STKLP）开始产生许多低MW谱带所见，嗜热菌素还非特异性地裂解SPD（图 2D）。用嗜热菌蛋白酶激活的Arg15Gln突变体显示出对S-2288的强大活性，而类似激活的MI同工型则没有可检测的活性（图 2E）。）。Arg15Gln突变体以其酶原形式正确折叠的事实表明，激活不是SPD正确折叠的先决条件。因此，低酶活性是MI-SPD的固有特性，而不是归因于缺乏重折叠。
由于血浆纯化的FSAP已显示可激活pro-uPA和VII因子（FVII）并使TFPI失活，因此我们用WT-SPD和MI-SPD的激活形式测试了这些天然底物。WT-SPD在激活pro-uPA和FVII方面是有效的，而MI-SPD没有这种活性（图 3A，B）。FVII激活所需的WT-SPD浓度比pro-uPA激活高大约100倍，这与血浆纯化蛋白9的早期观察结果相似。WT-灭活了TFPI，而MI-SPD则没有灭活（图 3C），血浆纯化的FSAP 27也是如此。。因此，WT-和MI-SPD对生理底物的性质比较显示了预期的活性模式。因此，即使重组SPD缺少调控结构域，也可以表型化全长FSAP的某些已知功能。
WT-和MI-SPD对生理底物的影响。（A）在37°C下用WT-SPD（●）和MI-SPD（■ ）激活pro-uPA（10μg/ ml）。使用底物S-2444的水解测量uPA活性，并以平均值±SD，mOD / min给出。发现单独的SPD针对S-2444的活性是微不足道的。（B）在37°C下15分钟内通过WT-SPD（●）和MI-SPD（■ ）激活FVII 。如材料和方法中所述对产生的FVIIa进行定量测量。（C）WT-SPD使TFPI失活（●）和MI-SPD（■），然后按照FXa抑制测定法（如材料和方法中所述）测量TFPI活性。结果以nM TFPI给出（平均值±SD，n = 5）。
为了阐明MI同工型（Gly221Glu）的低催化活性的基础，从而测试221位Glu的重要性，将该残基突变为以下氨基酸：Ala，Gln，Leu或Asp。与Gly相比，Ala代表一种小氨基酸，在psi / phi扭转角附近没有柔韧性。Gln的大小与Glu相似，但不带电荷，但仍能形成氢键，而Leu的大小相似，但疏水且不形成氢键。Asp比Glu小，但电荷相同。如后所述，这些研究是在Ca 2+和Na +的最佳浓度下进行的。针对标准生色底物S-2288研究了动力学性质。对于WT-SPD，Km 107±7 µM， k cat为650±28 min -1（n = 3）。与WT-SPD相比，Ala突变体的催化效率低50倍，而MI突变体的催化效率低2000倍。Gln-，Leu-和Asp-突变体的活性可忽略不计（图 4A，表 1）。这三个表现出微不足道的活性的突变体最有可能也未经历自动激活。
MI位置上不同氨基酸替代物的功能作用。（A）WT-SPD（●），MI-SPD（■），-Ala（▲），-Gln（▼）–Asp（◆）和–Leu（∗）突变体的Michaelis-Menten图，使用S-2288作为基板。WT-SPD的浓度为30 nM，而突变体的浓度为300 nM，活性以μM/ min（平均值+ SD）表示。（B）将WT-和突变体-SPD重新折叠48小时，并测定抗S-2288水解的活性。将MI-和SPD突变体（5μg/ ml）与WT-SPD（0.1μg/ ml）在37°C下预孵育30分钟，然后确定针对生色底物S-2288的酶活性。底物水解之后，测量在405 nm处的吸光度，并表示为mOD / min（平均值+ SD）。
还将所有突变体与活性WT-SPD一起孵育以增强活化，但是这并未导致其酶活性的任何其他变化（图 4B）。因此，仅用大小相似的Ala替代原始Gly会导致部分保留酶活性，而所有其他替代都产生与MI-SPD相同的特性。
较早的研究表明，激活MI-FSAP的酶原形式后，新的N末端（Ile16）无法与Asp194形成盐桥，从而使构象变为活性蛋白酶7。我们通过与biot-PPACK进行结合研究，寻求MI-SPD活性位点构象改变的进一步证据。如后所述，这些研究是在Ca 2+和Na +的最佳浓度下进行的。为了保持其正确构象，使用固定的多克隆FSAP抗体捕获了WT-和MI-SPD。Biot-PPACK以浓度依赖的方式与WT-SPD结合，但MI-SPD的结合率低（图 5A，B）。针对FSAP SPD的抑制性抗体Mab570均等地结合到两个同工型，表明这两个同工型在板上均被同等捕获，并具有保守的表位。Biot-抑肽酶显示与两种同工型的结合微不足道，表明其对WT-SPD的亲和力非常低（图 5A，B）。biot-PPACK与FSAP-SPD的结合可能会与过量的PPACK和抑肽酶竞争，但MI-SPD并非如此（图 5C）。因此，生物素化的PPACK与MI-SPD的低结合本质上是非特异性的。WT-SPD的酶促活性被生物素抑制剂同样抑制，与非生物素抑制剂相当，表明生物素化不会改变其特性（图 5D）。）。较高浓度的生物素化和非生物素化的Mab570对活性的抑制作用相同，但未显示。因此，WT-SPD绑定到PPACK，而MI-SPD不绑定。
抑制剂与WT-SPD和MI-SPD活性位点结合的特征。（A）WT-或（B）MI-SPD（2μg/ ml）被捕获在兔抗FSAP多克隆抗体包被的孔（5μg/ ml）上。按指示添加不同浓度的Biot-PPACK（●，0–2μM ），Biot- 抑肽酶（■，0–2μM）或Biot-Mab570（▲，0–2μg/ ml），并使用链霉亲和素POD在450 nm处的吸光度（OD，平均值+ SD）。（C）在与（A，B）类似的实验中，在存在或不存在浓度增加的情况下测试了与WT-SPD（●，■）和MI-SPD（▲，▼）结合的Biot-PPACK（0.1μM）PPACK（●，▲，0–1μM）或抑肽酶（■，▼，0–1μM）。（D）在浓度越来越高的Biot-PPACK（▲）和PPACK（∗，μM），Biot- 抑肽酶（■）和抑肽酶（◆，μM）存在下测定WT-SPD对S-2288的蛋白水解活性，Biot-Mab570（●）和Mab570（▼，μg/ ml）。酶活性以mOD / min（平均值+ SD）表示。所有结合和活性研究均在2 mM Ca 2+和137 mM Na +存在下进行。
据报道，FSAP活性7通过与金属离子Ca 2+或Na +结合而改变。我们测试了Na +和Ca 2+的生理水平是否能够调节WT-SPD制剂的活性。Ca 2+的存在导致K m降低12倍，催化效率提高50倍，而Na +导致催化效率提高4倍（图 6和表 2）。
Na +和Ca 2+对WT-SPD活性和金属离子结合位点的影响。（A）Na +（▲，150 mM），Ca 2+（■，5 mM）一起（●）和无（▼）在浓度不断增加的情况下对WT-SPD活性的影响。基底S-2288表示为Michaelis-Menten图。用于这些实验的缓冲液是含有2 mM EDTA和Tween-20（0.1％wt / vol）的Tris（50 mM，pH 7.4）。所有值均为平均值±SD。（B）带有卡通效果的FX（PDB ID：2JKH，绿色）与WT-SPD（橙色）的整体结构叠加。Ca 2+和Na +来自FX的离子分别显示在品红色和蓝色球体中。FX 的Ca 2+结合环（上部插图）和Na +结合环（下部插图）显示了与相应的金属离子配位的相应氨基酸残基。黄色虚线表示氢键。
为了确定FSAP SPD中可能的金属离子结合位点，我们将WT-SPD模型与FXa（PDB ID：2JKH）6叠加。重叠的结构表明WT-SPD 中同时存在Ca 2+（品红色球）和Na +（蓝色球）结合位点（图 6）。在WT-SPD模型中，与FXa相比，氨基酸Asp64，Asp66，Glu70和Glu71可以与Ca 2+形成潜在的坐标。这些功能和模型研究预测在FSAP的SPD中存在Ca 2+结合位点，如最近所述7。关于Na +，如FXa所示，可能会在220和180个环的残基之间发生结合6。因此，我们可以证实较早的发现，即Ca 2+是FSAP酶活性的强激活剂。
迄今为止，重组活性FSAP的表达一直很困难，因为哺乳动物细胞18对酶活性FSAP的耐受性很差。解决这个问题的一种方法是准备一个突变体，该突变体最初是无活性的，但可以被外源蛋白酶如嗜热菌素7激活。该方法的缺点是嗜热菌蛋白酶的广泛的底物特异性，这可能导致在其他外来部位的不希望的裂解，从而引起潜在的假象。在我们的实验中，除了活化位点外，FSAP-SPD对嗜热菌素的多次切割非常敏感。为克服这些问题，我们开发了一种在大肠杆菌包涵体中制备FSAP重组SPD的方法。。蛋白质在重新折叠之前保持稳定和无活性。该蛋白在-20°C复溶缓冲液中稳定1年，或在4°C复溶缓冲液中非常稳定。该缓冲液最有可能允许自动激活，但由于重折叠缓冲液的各个成分的结合以及完全酶促活性所需要的Na +和Ca 2+的缺乏，阻止了自动降解。这些方法将能够表达大量的FSAP-SPD，这对于将来进行详细的生化，细胞和体内研究至关重要。
MI-SPD在长达1周的时间内都未显示出自动激活这一事实，突显了其对自动激活的抵抗力。数月后观察到一些自动激活，但我们无法以一致的方式查明为此所需的因素。在真核细胞中表达的全长构建体在MI-FSAP 7中也表现出较慢的自激活动力学。通过测序和活性研究确定，将WT-和MI-SPD突变为Arg15Gln可以防止自动激活，并可以通过嗜热菌蛋白酶进行靶向切割。尽管此过程可以有效地自动激活WT-和MI-SPD，但已激活的MI-SPD实际上仍然处于非激活状态。如许多较小的MW带的出现所观察到的，嗜热菌素还存在其他裂解，这限制了该方法的实用性。
MI-SPD对生色底物S-2288，FVII，pro-uPA和TFPI的蛋白水解活性降低。在测试的MI位置的所有氨基酸替代物中，只有Ala突变体保留了实质的酶促活性，表明该位置对于整个蛋白质的活性具有重要作用。这些结果与最近的报告非常相似，即Ser和Ala突变体部分具有活性7，而MI同工型则无活性。与缺乏酶活性一致，在MI-SPD中PPACK的结合也丢失了。据报道，抑肽酶能够结合酶原和某些丝氨酸蛋白酶的活性形式，例如胰蛋白酶原28。尽管抑肽酶可以与biot-PPACK竞争与WT-SPD的活性位点的结合，但其亲和力太低，无法在给定条件下进行与生物素化抑肽酶的结合研究。但是，抑制WT-SPD活性的单克隆抗体Mab570同样能与MI-SPD结合，表明两种同工型中某些表位的总体保守性。
在较早的研究中，有人提出MI同工型是无活性的，因为在Ile16和Asp194之间的离子对的形成，对实现从酶原到活性的构象很重要，在该突变体7中受到干扰。考虑到在这些实验中将热解酶裂解的WT-FSAP与自动活化的MI-FSAP进行了比较，存在较高的人工制品潜力。另一个可能的解释是，当220环的柔性改变时，当Gly被更大的Leu，Gln和带负电荷的残基（Glu和Asp）取代时，会干扰S1口袋中由残基189定义的底物结合。 –192、214–212和224–228。加拉等。使用WT和MI-SPD的静态同源性模型，并建议在两个同工型之间的活性位点的构象差异12。需要进一步详细的晶体学研究来剖析MI-FSAP中酶活性丧失的确切原因。
Stavenuiter 等。图7证明Ca 2+和Na +在增加FSAP的酶活性中均起作用。我们发现使用底物S-2288 ，Ca 2+对WT-SPD的K m和k cat具有相似的作用。同源性模型显示，Ca 2+在220-环/ 180-环中的Ca 2+和Na +的可能结合位点与Stavenuiter 等人的结果一致。7。但是，在我们的研究中，Na +的作用要小得多。建议的Na +结合位点在两个具有低序列同一性和插入/缺失的环之间，并且非常灵活，因此其位置分配是不确定的。
这项研究中提出的主要进展代表了大规模制备重组FSAP-SPD的首次证明。与本研究中的SPD-亚型得到的结果在很大程度上匹配血浆来源的蛋白质所作的早期观察9，27以及从哺乳动物表达系统中得到的蛋白质7，18。在编写此手稿的过程中，我们已经能够开发出一种新颖的底物，一个活性位点探针以及一种针对FSAP 29的特异性和选择性抑制剂。同样，我们还发现，这种FSAP制剂可以概括血浆FSAP对细胞中基因表达的影响30。这交叉验证并进一步增强了当前方法的可靠性，并为该领域的进一步研究打开了可能性。
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