生物衰老及其机制基础具有巨大的生物医学和生态意义。衰老涉及多种生物功能的下降，并限制了物种的最大寿命。衰老与涉及DNA甲基化的表观遗传变化有关。此外，对哺乳动物的分析表明，基因启动子中CpG位点的密度与寿命相关，而基因启动子是DNA甲基化的目标。使用252个完整基因组以及动物年龄和启动子序列的数据库，我们显示了整个脊椎动物的模式。我们还基于一组选定的启动子中的CpG密度推导了预测寿命时钟。寿命时钟可准确预测脊椎动物的最大寿命（R 2 =仅在选定的42个启动子中CpG位点的密度中得出= 0.76）。我们的寿命时钟提供了一种全新的方法，可以仅使用基因组序列就可以准确地估计寿命，并且可以为尚不了解和已灭绝的物种估计这一具有挑战性的参数。

生物老化几乎在所有动物种类观察到的1，2。衰老涉及到各种生物功能的下降，并且该过程的动力学限制了物种的最大寿命3。个体的长寿密切相关，特定等位基因在遗传模型生物体4，5，6。老化也与涉及DNA甲基化（DNAM）几个表观遗传变化相关联的7，8。胞嘧啶-磷酸-鸟苷（CpG）位点的DNAm涉及对胞嘧啶进行共价修饰以形成5-甲基胞嘧啶。对DNA的这种修饰具有调节基因表达的潜力，包括对长寿至关重要的基因的表达，而不会改变基础序列。这DNAM在启动子CpG位点可以积累或随着年龄的增长可预见的下降，之上后生漂移[19]更随机过程的观察，已使发展的“时钟像”生物标志物的年龄9，10，11。例如， 通过表观遗传钟12，可以在一系列组织中以很高的精度（R 2 = 0.92）预测单个人的年龄。。类似的后生时钟已经在一系列哺乳动物和鸟类的创建13，14，15，16，17。

尽管经常被报道，但是很难定义一个物种的最大寿命。由于难以估计野生个体的年龄，因此通常是圈养动物的最高报道价值。另外，它是为广大个体的物种中的一个公认的舆论值18，或者是基于记录从一个小数字，有一个年龄估计为特殊情况导致野生个体的14，19。物种之间的最大寿命差异很大，即使在相对密切相关的物种之间20。在脊椎动物中，侏儒虾虎鱼（Eviota sigillata）等物种仅生存8周21，而格陵兰鲨鱼（Somniosus microcephalus）可以活400年以上22。在哺乳动物中，林鼩（鼠鼩鼱属杂色山雀）有2.1年最短寿命报道一个23，而一些弓头鲸（Balaena mysticeta）已报告是老年人已有200多年的19，23。物种之间寿命的差异具有生态意义，因为年龄调节着动物生命周期和人口统计学的基本方面，例如死亡率24。因此，寿命是评估动物灭绝风险25，评估生物安全风险26的关键以及估计渔业和其他收获生物的可持续产量27。然而，尽管具有如此深远的现实重要性，但大多数野生动物的寿命却很差，因为很难估算28。

最大寿命被认为是遗传控制下的23，24，25，但到目前为止，还没有基因变异可以考虑物种间的差异寿命。由于衰老的特征是DNAm引起的基因表达变化，因此寿命的另一个潜在控制因素是适应DNAm对基因表达调节的影响的基因组变化。具体地，高密度的CpG位点，也称为CpG岛的簇，是高度的启动子序列中的保守29，30以及用于调节基因表达的公知的31。CpG位点也容易发生突变32 它们在调控基因表达中的功能可能使其成为改变寿命的进化压力的主要靶标。

这项研究得到了强有力的支持，该研究表明CpG密度与一组保守的哺乳动物启动子之间的寿命相关[ 26]。McLain和Faulk 33确定了1,079个启动子，其中CpG密度与寿命的增加相关（q <0.05）。这暗示了CpG密度在哺乳动物物种的最大寿命中的功能性作用。高密度CpG区可能为长寿物种提供更大的缓冲，以防止由积累的甲基化引起的失调33。尽管启动子在整个脊椎动物中都得到保守34尚不清楚启动子中的CpG密度是否是与寿命相关的基因表达的关键驱动力。而且，尽管许多研究已经探索了使用特定CpG位点的甲基化预测能力，但尚无此类研究调查CpG密度预测寿命的能力。

在这里，我们扩展了启动子CpG密度与哺乳动物寿命之间相关性的观察，以产生所有脊椎动物寿命的预测模型。我们使用具有已知寿命的动物的参考基因组来鉴定可以预测寿命的启动子。我们结合了来自主要数据库的数据，包括NCBI基因组35，真核启动子数据库（EPD）36，动物衰老和长寿数据库（AnAge）23和TimeTree 37建立一个估计寿命的预测模型。我们的结果表明，选定启动子中的CpG密度可高度预测整个脊椎动物的寿命。据我们所知，这是第一项建立遗传预测模型的研究，该模型可通过遗传标记来估计脊椎动物的寿命。

根据CpG密度估算寿命

我们确定了所有具有NCBI 35中参考基因组的脊椎动物，AnAge数据库23中已知的最大寿命和TimeTree 37中的进化差异时间。该原始数据集包含来自五个脊椎动物类别的252种（补充表   1），寿命范围为1.1年，绿松石kill鱼（Nothobranchius furzeri）至205年，R眼石鱼（Sebastes aleutianus ）。我们从数据集中删除了人类（智人），因为它们的最大寿命为120年，这并未反映出变异性和真实的全球平均寿命（60.9–86.3岁）38。

哺乳动物是数据集中最具代表性的脊椎动物类别（补充表   1），来自EPD的启动子的平均BLAST长度为374 bp（补充图   2）。BLAST命中长度随与人类的进化距离增加而降低（R 2  = -0.85，p值<2.20×10 -16；补充图   2），这很可能是使用人类启动子序列的反映。我们还确定了跨动物物种的总CpG位点与基因组大小之间的正相关性（R 2  = 0.64，p值<2.2×10 -16）（补充图   3）。）。已经提出，增加的重组率可防止在增加染色体数目和基因组大小的过程中CpG岛密度的损失39。这表明在不同大小的动物基因组中保持了全基因组CpG密度。

经过10次交叉验证以优化模型后，最终寿命预测因子基于42个启动子（补充表   2）（请参见方法）。从这里开始，模型中的启动子将被称为寿命基因座，模型本身被称为寿命时钟。如预期的那样，寿命时钟返回训练数据集内物种的已知寿命与预测寿命之间的回归系数（R 2  = 0.78，p值<2.20×10 -16）（图   1a）。此外，使用测试数据集中的独立样本集，寿命时钟还返回了较高的回归系数（R 2  = 0.76，p值<2.20×10 -16；图   1b）。）。此外，对于训练和测试数据集，使用未转换的对数值的已知寿命和预测寿命之间的相关性分别为0.77和0.76。尽管模型是使用所有类别的脊椎动物开发的，这是使用系统发育广义最小二乘（PGLS）方法（请参见方法）解释的，但重要的是要注意，在各个类别的脊椎动物中可能存在多个回归斜率。因此，可能会针对物种类别或分类法开发更多定制模型。这通过ANCOVA测试得到了证实，该测试显示出具有预期最大寿命的脊椎动物类别具有显着效果（p值= 0.00014）。此外，2  = 0.49，p值= 0.043，鱼；R 2  ＝ 0.56，p值＝ 0.025，哺乳动物。R 2  ＝ 0.91，p值＝ 1.85×10 -13，Reptilia。R 2  = 0.94，p值= 0.029）。由于测试数据集中的样本量较小，我们无法确定两栖动物的回归系数。随着AnAge数据库继续获得更多寿命数据和更多参考基因组，将来可能会开发其他针对物种类别或分类学排名的寿命预测模型。从所有五个脊椎动物类别预测物种寿命的准确性（补充表   1和图   1b）），表明CpG密度已在脊椎动物的寿命中应用了通用的生物标志物面板。

根据CpG密度和寿命位点估算寿命。（a）训练和（b）测试数据集中的已知寿命和预测寿命之间的相关性。颜色表示每种物种的类别。R 2值和p值在每个图的上方给出。

全尺寸图片

寿命时钟在所有类别的物种上均表现良好，产生的中值绝对误差（MAE）为3.72年（图   2a），最大相对误差为5.9％（图   2b）。）在测试数据集中。我们还发现训练和测试数据集之间的绝对错误率之间没有显着差异（p = 0.20，t检验）。在测试数据集中，通过人工饲养（43种）或野生（26种）获得其寿命估计值的物种之间没有发现MAE之间的差异（p = 0.31，t检验）。这表明来自AnAge数据库的寿命估算值的来源（圈养或野生）不是该模型的主要混杂因素。尽管准确性很高，但单个寿命位点不一定代表最强的寿命相关启动子（图   3a，b）。这类似于其他与年龄相关的模型，其中总体模型的各个组成部分不一定与与年龄相关的特征具有良好的相关性13，40。因此，寿命位点可能只是随着寿命的增加而预示CpG密度的方向性。主成分分析（PCA）用于直观表征不同物种中CpG密度的变化。寿命位点的PCA将阐明物种按寿命分离的程度，以及物种中CpG密度变化的其他驱动因素。PCA根据寿命将物种分离（图   4）。该分析表明，基于寿命良好，寿命位点分离物种的CpG密度。这也表明技术差异，例如基因组装配水平（例如重叠群，支架，染色体装配）不是样品之间差异的主要来源（补充图   4）。）。我们还测试了基因组GC含量是否是预测寿命变化的驱动因素，以及是否应在模型中进行调整。但是，GC含量与绝对错误率之间没有关联（补充图   5）。该分析表明，寿命模型与技术因素和基因组内的变异无关。我们还使用原始预测值（补充表3和补充文本）测试了非脊椎动物的寿命时钟   。但是，寿命时钟返回的非脊椎动物估算值不准确，这表明它仅适用于脊椎动物。

寿命基因座的性能和表征。箱形图显示了训练和测试数据集中每个物种的（a）绝对错误率（b）相对错误率。覆盖在箱形图上的每个点代表一个单独的物种。

全尺寸图片

寿命基因座的权重和相关系数。（a）每个生命周期基因座的权重，按从正到负的顺序排列。（b）皮尔逊相关性与每个寿命基因座的权重进行比较。

全尺寸图片

使用寿命位点中的CpG密度进行主成分分析，可显示物种根据已知寿命进行分离。物种通过增加寿命来着色。

全尺寸图片

我们通过与EPD中详细描述的相关基因进行基因本体论（GO）富集来表征寿命相关基因座的功能。先前的研究已经说明的能量代谢和寿命之间的关联41，42，通常被称为活率的最理论43，44。然而，尽管寿命基因座相关基因最常与发育和能量代谢过程相关，但对于任何GO术语都没有明显的富集。我们还进行了寿命与CpG密度之间的Pearson相关性，以确定哪些启动子正相关和负相关（补充表   2）。在42个启动子中，有34个与寿命显着相关（p <0.05），其中12个和22个启动子分别与寿命负相关和正相关。其余的8个寿命位点与寿命没有显着相关。

绝种动物的寿命估算

寿命是生命历史的中心属性，因此寿命估算器与古代DNA分析相结合，可以揭示灭绝物种生态学的这一先前隐藏的方面。我们估计了象科的两个绝种成员的寿命，即长毛象（Mammuthus primigenius）45和直齿象（Paleaoloxodon antiquus）46。通过将单核苷酸多态性（SNP）鉴定到非洲大象基因组中，我们能够估计这两种灭绝物种的寿命。AnAge数据库列出了估计寿命为65年的非洲象，该象已在训练数据集中使用。寿命时钟估计羊毛猛ma象和直牙形大象的寿命均为60.0年。尽管由于缺少围绕猛ma象和直牙象的寿命信息，所以这在当今同类动物的范围内，但很难确定这两个物种的模型的真实准确性。没有先验原因是灭绝物种寿命估计的准确性应低于活物种（测试数据集中的中位数为1.2％，3.72年）。我们还分析了客鸽（Ectopistes migratorius），它具有组装的基因组47，并在1914年灭绝48。寿命时钟估计该客鸽的寿命为28.0年。从未记录过野外野鸽的寿命。然而，已经表明，玛莎的时代，唯一健在的成员至少是17，更容易，因为旧如29年49，50，这虽然只是一个简单的例子，增加了可信度寿命我们的基于模型的估计。

我们还研究人类寿命的估计是否显著从他们的近亲不同，包括黑猩猩51，52和人科的家庭，丹尼索瓦人的灭绝成员53（智人杰尼索娃）和尼安德特人54（智人尼安德特）。寿命时钟估计人类的寿命为38.0年（hg19）。人类的寿命最多是一个有争议的话题55，56。在过去的200年间，人类的平均寿命增加了一倍多，因为现代医学和生活方式的改变57，58。早期人类已报告有40年的预期寿命最高57，58按照现代的标准少了一半23，38。同样，黑猩猩的寿命估计为39.7年。在野生黑猩猩的最大寿命被认为是55岁的女性，然而据报道，许多活到大约40岁的23，59。接下来，我们估计Denisovans和尼安德特人的寿命。我们估计Denisovans和Neanderthals的寿命均为37.8年。这表明这些已灭绝的人类科物种的寿命与人类早期的现代人类相似。

长寿命物种的寿命估算

在205年的数据集中，ough眼石鱼（Sebastes aleutianus ）是最古老的物种。乌龟和鲸鱼的一些种类也有报道住了超过100年的60，61。这些物种很有趣，因为它们可以提供有关寿命和与年龄相关的疾病的模型和见解，但它们也是获得寿命估计的困难物种。我们探索了寿命时钟在几种非常长寿的物种中的应用，这些物种并未包含在训练数据集中。我们首先在Pinta岛龟（Chelonoidis abingdonii）的基因组上测试了寿命时钟，其寿命在校准范围内62。孤独的乔治是最后一个幸存的平塔岛龟，据估计，他的基因组已超过100岁。寿命时钟估计Pinta岛龟的最大寿命为120岁。该寿命估计比Lonesome George的死亡年龄的大多数估计值高10-20年62。重要的是要注意，这不是Pinta岛龟的最大使用寿命，因为只有一个人在死亡时记录了年龄。然而，该模型为这种长期存在且数据极为缺乏的物种提供了可靠且经过严格验证的寿命估计。将模型应用于具有更好寿命信息的其他加拉帕戈斯龟中，将能够进一步评估其寿命估计。Chelonoidis abingdonii。

鲸被认为是寿命最长的哺乳动物19，据估计211岁19。使用我们的寿命估算器和弓头鲸基因组63，我们估计弓头鲸的最大寿命为268年。这个估计寿命为57年，较古老的老年个体更迄今为止19，63。长寿物种的寿命估算是困难的，因为许多年龄的估算都是通过外推模型进行的，这些模型是根据来自年轻得多的已知年龄个体的有限数据校准的。弓头鲸提供了另一个例子，寿命是通过眼球氨基酸外消旋的另一种方法预测的19远远超出了模型的校准范围，就像我们的寿命时钟一样。此外，很少有可能从出生到死亡都追踪长寿物种，因为它们通常会在一代研究人员中存活下来。还需要注意的是，这些动物的许多年龄估计都没有发现病理迹象19。通常，如果动物处于其寿命的上限，则可以预期某些与年龄有关的疾病的病理特征。缺乏这些发现表明，这些动物没有达到其寿命的最大值，并且可能有更长的寿命。

通过分析具有已知寿命的脊椎动物基因组中的CpG密度，我们确定了42个基因启动子，可以用作寿命的高效生物标志物。这是一项新颖的研究，因为先前的研究已经调查了相关性，但没有使用CpG密度作为预测性生物标志物33。我们能够在五个最特殊的脊椎动物类别上测试我们的寿命时钟，证明了根据CpG密度预测寿命的潜力。我们无法准确地估计非脊椎动物的寿命，可能许多无脊椎动物不表现出DNA甲基化的程度为脊椎动物64，65，66。此外，我们发现与脊椎动物相比，转录起始位点周围的CpG密度在昆虫中具有明显的模式（补充文本），类似于先前的研究67。但是，我们能够将寿命时钟应用于寿命长的脊椎动物物种以及难以获得寿命估计值的其他群体。但是，由于可能存在其他环境选择压力，任何对物种的遗传调控都可能是次要因素。在生殖年龄后具有寿命的物种可能就是这种情况，因此，可能存在一些非遗传因素，这些因素可能更能预测其最大寿命。

有人提出，DNAm模式不会随着年龄的增长而保持不变，CpG密度可能与延长寿命的基因表达有关33。CpG密度与哺乳动物的寿命有关33。但是，这项研究表明，这也发生在其他脊椎动物中。尽管启动子相对进化保守34，CpG位点还是容易发生突变68这可能使它们成为选择的目标，包括寿命的变化。CpG密度可能处于选择性压力之下，因为它可能调节长寿相关基因的表达。此外，我们模型在非脊椎动物中的不良表现可能反映了非脊椎动物69 CpG位点的替代功能和基因组分布。

寿命是种群生物学的重要参数，因此寿命时钟在野生动物种群的研究和管理中具有多种潜在的应用。例如，通过种群生存力分析（PVA）70为濒危物种的命运建模。就渔业而言，通常通过根据纳入自然死亡率（M）的人口模型设定捕捞限额来管理捕捞。然而，中号是最困难的人群的特征之一，为鱼类估计71，72。寿命时钟在基于寿命历史的M估计中有明确的应用，因为寿命和M密切相关且M一旦知道寿命，就可以用很少的额外信息进行估算73。基于寿命的M估计量相对于替代方法的主要优势在于，它们提供了快速的估计，避免了过去曾导致主要渔业崩溃的新开发种群的不当收获，例如橙色粗毛（Hoplostethus atlanticus）74。从基于基因组寿命的估计值中得出M估计值的能力，对于评估总体上对种群生物学了解不多的近期营养级别较低的渔业尤其有价值75。

尽管我们的模型对于广泛的野生动植物应用具有很高的预测价值和潜在重要性，但在解释其结果时仍需要考虑一些注意事项。首先，该模型依赖于AnAge数据库的寿命估算。尽管AnAge是世界上最大的寿命数据库，并进行自己的质量评估，但它确实包含了圈养动物和野外动物的各种估计值76。因此，估计物种的寿命很可能高估了野外通常会达到的寿命。其次，由于具有基因组和寿命估计的物种数量有限，我们选择在组合分析中使用所有可用物种。这为脊椎动物提供了通用的寿命预测因子，但我们的研究结果还表明，CpG密度与寿命之间可能存在分类群特异性关系。所有脊椎动物类别均具有统计上显着的回归系数，具有已知和预测的寿命，但具有不同的相关性。毫不奇怪，哺乳动物具有最强的相关性，但这可能是由于该模型是用来自EPD的人类特异性启动子开发的。哺乳动物是最近进化最全的脊椎动物类别77因此，与其他类别相比，启动子序列的发散时间更短。因此，在将来的研究中，一旦有更多数据可用，使用类特定的启动子数据库来重新校准分类类的特定模型将是理想的。将来，特定于类别的模型可能会提供更大的预测能力，但将需要实用得多的基因组。尽管如此，尽管存在这些限制，但寿命时钟仍可以在非常多样化的一组生物中提供卓越的预测能力。

在这项研究中，我们已经表明，CpG密度与五个最特殊的脊椎动物类别的寿命密切相关。我们的结果还使我们能够构建可以仅通过少量基因组学特征准确预测寿命的模型。寿命时钟已广泛应用于有关现存和已灭绝物种的种群生物学的问题。寿命是用于管理诸如鱼，鲨鱼和受威胁野生物种之类的已收获野生物种的模型的核心组成部分，在这些模型中，寿命对于确定可持续收获和种群生存力至关重要。寿命时钟还为研究灭绝物种的生物学提供了新的机会，而古老的DNA方法可以在其中提供基因组组装。

启动子序列保守和CpG密度计算

我们将来自EPD 36的人类（智人）中以转录起始位点（TSS）（每个启动子为-499至100 bp）为中心的启动子序列作为启动子序列的数据集。我们选择了人类数据集，因为与其他可用物种相比，人类数据集具有最多的启动子序列（29,598个启动子），并且已使用一系列高通量转录起始位点定位方法进行了实验验证36。简要地，如前所述33，使用基本局部比对搜索工具（BLAST）v2.2.31，将启动子序列映射到每个物种中的单个热门序列。在同一性> 70％的物种中，认为存在重大打击。通过计算每种物种启动子中CpG位点的总数并除以BLAST命中长度来确定CpG密度。如果在给定物种中未鉴定到启动子命中点，则将CpG密度视为0。

寿命预测建模

为了根据CpG密度估算寿命，我们使用了AnAge 23可获得的最大寿命数据。AnAge数据库包含各种来源的动物的寿命估算值，包括圈养和野生动物。尽管AnAge包含其他表型数据（包括各种身体特征），但与怀孕相关的信息（例如妊娠期长度和离婚年龄可能与寿命相关）已从任何寿命预测模型中排除。这是由于数据太稀疏以至于无法包含在建模中。另外，它也使模型不受许多种可能无法获得或未知的因素的影响。

总共252种（补充表   1）（不包括人类）包含参考基因组，可从NCBI基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/），AnAge中的最大寿命数据和TimeTree中的进化发散时间。AnAge数据库是对其他研究的荟萃分析，这些研究报告了文献中物种的寿命。在AnAge数据库中用于本研究的252种物种中，有151种来自被圈养的动物，其中有84种在野外，有17种来自不确定的圈养或野生来源。此外，来自252种动物的AnAge寿命值来自多个来源，并且样本量较大（> 1000）。动物的分类学分类保持在NCBI上。已知寿命经过自然对数转换，以使数据适合线性模型。将物种随机分配给一个训练（176个样本）或测试（76个样本）数据集（70/30分割）。78。确定了训练（平均值= 575 MYA）和测试（平均值= 584 MYA）数据集的平均发散时间，以确定其中一个数据集中是否存在密切相关物种的偏倚。但是，我们发现没有显着差异（p = 0.6391，t检验），这表明在训练或测试数据集中，没有紧密相关物种的过度代表。训练数据集服从弹性净罚分回归模型 79该物种的寿命用于逆转29598个启动子的CpG密度。glmnet函数设置为10倍交叉验证，可返回性能最佳的模型。glmnet的α参数为0.5，基于训练数据的最小λ值为0.16539。这样一来，共有42个启动子可用于估计寿命。该模型返回最有用的启动子，但是它确实允许一些冗余以增加鲁棒性79。使用从TimeTree 80，caper和APE 81下载的发散时间执行PGLSR. Vertebrate类中的程序包也已合并到模型中，从而为每个特定类创建了特定模型。在原始预测值（系数权重乘以相应CpG密度和系数截距的乘积之和）上训练了PGLS（补充表   2）。估计寿命的最终公式为：

其中，x是每个样本的原始CpG密度权重之和，a和b是取决于脊椎动物类别的系数，表   1）。测试数据集用于验证模型。确定了已知寿命和估计寿命与MAE之间的相关性，以评估模型的性能。

主成分分析

使用PCA来确定在寿命位点中使用CpG密度分离物种的特征。这还将提供对模型中可能需要考虑的其他变量的洞察力。使用FactoMineR 82中的PCA功能执行PCA 。

古代基因组寿命估算

为了确定已灭绝物种的古代基因组寿命，我们使用了BAM文件，该文件已映射到与参考基因组最接近的亲戚。与相关参考基因组相比，Samtools v1.3和bcftools v1.6用于识别灭绝物种的BAM文件中的单核苷酸多态性（SNP）。寿命位点内的SNP具有获得或丢失CpG位点的潜力，从而改变CpG密度。使用相关参考基因组中寿命位点的位置，如上所述计算了CpG密度。可从欧洲核苷酸档案馆（ENA）获得有关猛ma象（SAMEA3340290）的BAM文件45大象和直足大象（SAMEA24850918）分别与非洲大象基因组LoxAfr 3.0和LoxAfr 4.0一起使用，因为它们是每个研究中使用的基因组版本，用于寿命估算。对于丹尼索瓦人与尼安德特人的寿命估计，我们从原来的研究下载BAM文件53，54，其已被映射到人类基因组（hg19）。

转录起始位点周围的CpG密度

为了确定每种物种在TSS周围的CpG密度，我们使用了来自NCBI基因组的fasta和gff文件。使用bedtools v2.25.0 83将每个TSS的5kbp上游和下游序列分成500 bp的条带。CpG密度是通过计算每个仓中CpG位点的总数来确定的。函数NbClust 84用于确定数据中CpG簇的总数。此功能提供30个指标，包括缺口统计和轮廓方法，并根据多数规则确定聚类总数。使用R中执行的Kolmogorov–Smirnov检验，对物种之间的CpG密度分布进行了统计学上的显着性差异检验。

基因本体论与进化距离

使用2018术语使用Enrichr 85进行基因本体（GO）富集。如果调整后的p值<0.05，则认为GO项有意义。使用R版本3.5.1执行R中的所有分析。进化距离是使用TimeTree 37确定的，TimeTree 37使用了文献中的多种来源来确定物种分化时的中值时间。