摘要
根据双胞胎研究估计，遗传因素至少占哮喘风险的一半，通过人群研究确定的遗传变异仅解释了很小的一部分。哮喘患病率高的多代大家庭可以作为一种模型，以识别人口研究遗漏的密切相关个体中的高渗透性遗传变异。为了实现这一目标，确定了一个四代印度哮喘患者家庭，并招募其进行检查和基因测试。选择代表全世代的20名受试者进行全基因组基因分型，其中8名接受了外显子组测序。通过外显子组测序鉴定与受感染个体隔离的非同义和有害变体。嗅觉受体基因中优先的有害错义常见变异在不同种族的哮喘队列中验证了OR2AG2与哮喘的危险单倍型分离。进行了表型测试，以验证减少气味的能力方面的预期缺陷。在模型系统和无关的人肺样本中测试了与哮喘生物学相关的通路水平相关性。我们的研究表明，OR2AG2和其他嗅觉受体可能与哮喘的病理生理有关。对感兴趣的大家族的遗传研究可以导致有效的发现。
哮喘是一种慢性的呼吸道疾病，除了对环境造成的损害之外，还由于强烈的遗传易感性1所致。以前的哮喘遗传学研究，如连锁分析，双胞胎研究，候选基因方法和GWAS（全基因组关联研究），已经鉴定出许多哮喘候选基因和变异体，但是所有相关的变异体只能解释少于15％的遗传风险2。因此，缺少了很大一部分难题。可以通过获得人口研究遗漏的遗传变异信息来缩小这种差距，但可能会对共享变异的密切相关个体产生强烈影响。通过与紧密相关的个体（例如多代大家庭）的研究，而不是基于人群的研究，发现与哮喘风险相关的此类高渗透性变异体的效率更高。下一代测序已显示出在鉴定新靶标方面的希望，这些新靶标以前是基于候选基因的方法所遗漏的3。外显子测序即测序基因组的编码区中一个家族设立已被证明是在其他复杂的疾病，如心血管疾病和阿尔茨海默氏病的上下文中非常翔实4，5
此前，在印度人口，利用候选基因和基因组范围的候选基因的方法，几个基因包括细胞因子，FcεR1，STAT6和INPP4A被发现与哮喘有关的6，7。在印度，由于内婚制和复合家庭的概念，存在着大量的大家庭。此外，血缘关系和氏族之间的婚姻为精心设计的遗传研究提供了极好的基础。由于哮喘是一种复杂的异质性疾病，因此我们假设可以通过研究患有哮喘的多代大家族来实现能够鉴定高穿透性遗传变异的研究设计。为此，选择了来自印度南部的具有四代哮喘和特应性临床病史的四代家族的受试者子集进行外显子组测序。除此之外，对来自该家族的所有可用样品进行全基因组基因分型，以进行连锁和单倍型分析。
在对外显子组测序进行生物信息学分析和测序验证后，在我们的多代家庭中发现了一个编码嗅觉受体的候选基因OR2AG2的遗传变异在哮喘中是新颖的。文献表明嗅觉受体在气道上的表达类似于苦味受体，并在通过强烈气味激活刺激的粘膜纤毛清除中起作用8。最近的研究（包括韩国人群中的GWAS）报告了嗅觉受体对肺功能的重要意义9。我们假设这些受体的感知和清除缺陷可能会导致病情加重，这是哮喘患者在存在强烈/挥发性气味的情况下经常观察到的现象。在人的肺中具有相关作用的嗅觉受体是一个相对较新的概念。因此，我们使用体外系统和人肺样本探索了嗅觉受体基因OR2AG2在过敏性哮喘中的假定作用。
使用该家庭提供的信息构建了一个四代谱系（图 1）。表1提供了参与受试者的临床细节 。使用Illumina平台对八个样品进行外显子组测序。由于他们的共有基因组较少，因此选择了具有血缘关系的一对夫妇以及该家族的一个远亲成员进行测序，从而提供了更高的机会来发现与该疾病真正隔离的变异体。
家庭1的谱系和样本信息。家庭1是一个四代家庭，大约40％的个体患有哮喘和特应性疾病。收集的样品标有*符号。黑色正方形/圆形表示受影响的成员，而清晰的正方形/圆形表示未受影响的对象。从谱系中无法确定明确的继承模式。有趣的是，这个家庭也有血缘关系（用双线表示）。选择了八位受试者-II：5，III：7，III：9，III：10，IV：31，IV：34，V：27，V：42（5例和3个对照）进行外显子组测序。
测序后获得的数据经过分析管线（补充图 E1A）。测序的平均覆盖率约为50倍。在注释后，总共鉴定出115463个变体。我们的目的是确定仅与受影响的对象隔离并且在不受影响的对象中不存在的变体。为此，使用了无模型方法，因为哮喘是一种复杂疾病，而家谱显示出多种疾病遗传模式。看到910个变体与受影响的家庭成员隔离。在技术验证之前，应对这些变体进行优先排序。
为了理解所有已识别的分离变体的可能含义，使用了以下参数：1.计算机内预测工具（在补充图和补充图 E1B中进行了说明））被用来了解这些变体在人类生理和疾病中的可能含义，并考虑了那些预计具有破坏性后果的变体。2.与哮喘共分离的未报告哮喘（新）基因的基因变异被优先考虑。关注这些变异的想法与我们最初的假设一致，即哮喘缺失遗传力的一小部分归因于有害和高穿透性的遗传变异，这些变异更可能在基于大型家庭的机构中被发现。使用Sanger测序确定并验证了仅与哮喘病例分离并属于哮喘新基因的计算机内预测的有害变异。对来自家族1的所有可用样品进行了基于Sanger测序的确认。通过对感兴趣变体周围区域的Sanger测序来确定插入缺失，而通过SNaPshot测序来验证SNP。图。 图2显示了选自用于Sanger测序的18个基因的变体列表以及与该疾病共分离的确认的变体的最终列表。GWAS数据库在先前发表的哮喘和肺病报告中确定了这些变体中的5种（详细信息在补充文本和表 E3中提供）。
用于验证家族1的变体列表。该图显示了使用Sanger（斜体）和SNaPshot测序反应在家族1的其他成员中进行过验证以滤除外显子组测序假阳性的新型变体（左）列表。 ，（MAF：次要等位基因频率）。右侧显示了经过验证的变体列表。
在已确认的变体中，发现基因OR2AG2中的一个常见变体rs10839616（NM_001004490.1：c.161 G> C）属于与该大家族的所有受影响成员共同分离的风险单倍型。通过对该家族所有受试者的全基因组基因分型可以观察到（补充图 E3）。除此之外，还对正在进行的141例小儿哮喘病例和130例对照患者进行了全基因组基因分型研究，我们有其临床数据（表 2和3 ）。然后，使用该信息检查普通人群中是否有任何疾病的共同分离变异体与哮喘相关。与这样的想法一致，即缺失的变体在总体水平上可能会产生很小的影响，而在小型动力不足的研究中进行统计校正时会丢失，因此我们对交叉点使用了未经调整的关联。在六个疾病共分离变体中，发现OR2AG2遗传变体rs10839616与哮喘显着相关（OR = 1.579，p = 0.0132； MAF = 0.42）。在先前报道的GWAS中，在肺功能参数上也观察到变体rs10839616（补充表 E3）。
补充图 E4A显示了OR2AG2遗传变异对OR2AG2蛋白序列的影响。多序列比对描述了跨非人灵长类动物的不同物种的野生型氨基酸的保守性，表明了目的变体的进化重要性（图 E4B）。此外，计算机预测表明，在携带遗传变异rs10839616（c.161 G> C）的受影响受试者中，OR2AG2基因的功能可能会丧失（图 E4C）。
为了确定受试者中的OR2AG2基因变异是否与嗅觉功能改变或其他哮喘相关表型有关，我们进行了主观和客观测试。家庭的受影响和未受影响的成员使用不同浓度的2-苯乙醇（PEA）的甜的气味进行嗅觉识别和阈值测试10，11。虽然发现和区分不同气味的能力在家庭1的病例和对照之间没有受到损害（数据未显示），但哮喘患者只能在较高浓度下检测到一些气味，表明嗅觉功能障碍（图5）。 3A）。受影响的家庭成员还自我报告了直接询问的嗅觉能力下降。然而，来自该家族的对照受试者没有显示出这种嗅觉功能障碍。这一发现提示与来自同一家庭的对照组相比，患者的相对功能低下。
在人肺样品以及体外上皮细胞和成纤维细胞中，是否有IL-13诱导的家庭1中OR2AG2水平与表型相关性的阈值测试。（A）当测试不同浓度的2-苯乙醇（PEA）（甜味）时，哮喘对象的气味阈值平均得分与同一个家庭的对照对象相比明显降低的图；n = 6个对照，n = 9个哮喘受试者。（B）柱状图表示使用实时荧光定量PCR的正常人受试者（对照）和哮喘患者（哮喘）中OR2AG2的相对mRNA表达，n ＝ 6个哮喘病患者和n ＝ 10个正常受试者。（C）代表性的蛋白质印迹显示，用rIL-13诱导24小时后，人肺泡上皮细胞系（A549）中OR2AG2的蛋白水平降低。（D）代表性的蛋白质印迹显示，用rIL-13诱导24小时的人肺成纤维细胞（HFL1）中OR2AG2的蛋白质水平降低。（E，F）分别在（C，D）中进行的实验的光密度定量，将值标准化为α-微管蛋白水平。所有结果均表示为平均值±SEM。* P <0.05和** P <0.01（t检验）。
但是，我们无法明确确定差异是由于哮喘还是基因型引起的。在已知基因型的小儿哮喘队列受试者中，嗅觉表现普遍下降，可与大家庭的哮喘患者相提并论，但与基因型无显着差异。三组的哮喘表型也大致相似，在肺功能或其他相关参数上没有临床上的重要差异（表 3，图 4）。作为有或没有OR2AG2变异的哮喘受试者之间相似性的另一种解释，我们假设OR2AG2在哮喘的分子发病机理中可能被抑制。因此，在人类样品中和以IL-13诱导进行的体外实验中明确检验了哮喘可能与OR2AG2下降有关的假说。
小儿队列的不同基因型哮喘受试者的肺功能参数，呼出NO和加重频率的时间变化。（A）线图显示了哮喘受试者从基线开始的十五次随访中，不同基因型（CC，CG和GG）的不同肺功能检查的预测值的平均百分比。（B）线图显示哮喘受试者中十五次随访期间实际/调整后呼出气中的一氧化氮水平以ppb为单位，并根据其基因型分组。（C）线图显示哮喘受试者在十五次随访期间的实际/调整后加重频率，根据其基因型分组。
为了验证我们的假设，我们比较了哮喘患者和正常人肺部溶解产物中RNA 的OR2AG2水平。肺组织或固有细胞OR2AG2富集尚未见报道在以前的研究中对嗅觉受体12，13，14。然而，在我们的研究中，通过实时PCR检测，哮喘患者在RNA水平的OR2AG2水平显着下降（图 3B）。如从变体的MAF所预期的，可以从少量样品中低水平的OR2AG2观察到对照数据集中自然变化的存在。另一方面，哮喘患者的OR2AG2水平持续下降。接下来，我们在细胞培养研究中研究了OR2AG2位于已建立的哮喘相关分子途径下游的可能性。治疗（重组）IL13，原型细胞因子用于治疗哮喘15，16，导致抑制OR2AG2在人肺细胞，如示于图 3（C-F） 。这些数据共同支持了OR2AG2可能是哮喘水平在肺水平上的收敛点的假说。
哮喘是一种众所周知的遗传性复杂疾病，数十年来一直是基因组研究的目标。但是，关注家庭中重要度高的变体，但不足以解释人群水平哮喘风险的频率，可能有助于更好地了解哮喘遗传学。
为了达到同样的目的，选择了一个有哮喘的四代人的大家庭，并对其进行了外显子组测序和全基因组基因分型。在经过验证的疾病共分离遗传变异中，基因OR2AG2中的变异之一（c.161 G> C，rs10839616）属于嗅觉受体家族，出于以下三个原因而被选择用于进一步验证：1）在来自不同人群的小哮喘病例对照队列中，它与哮喘显着相关，表明其相关性。一般人群； 2）家庭患者自我报告无法感觉到气味和烟气； 3）该基因在哮喘生物学中发挥新作用的可能性。这一点特别有趣，因为发现该基因变异是该风险单倍型的一部分，该单倍型与该家族的所有受影响成员分开，此外在一项有关小儿哮喘队列的单独研究中有显着关联（正在进行的项目中未发表的数据） ）。我们的观察发现，在一组来自不同人群的受试者中，从家族结构中鉴定出的遗传变异与哮喘有关，这表明这种研究设计在普通人群中的相关性。类似于苦味受体，嗅觉受体在气道中表达。据推测，它们在从环境中感测强烈的气味分子方面起着作用，进而可以激活纤毛运动以清除粘液。8。此过程存在缺陷时，可能会激活气道中的感觉神经元，最终触发哮喘患者的病情加重。最近的报告表明嗅觉受体 OR2AG1（ OR2AG2的类似物）在气道平滑肌（ASM）细胞中表达。虽然一个研究显示激活受体引线的组胺诱导的收缩在ASM细胞 17，其它最近的报告表明，它的抑制阻碍通过在钙触发瞬时增加平滑肌细胞松弛 2+经由依赖于cAMP的信号级联 12，18。我们假设嗅觉受体基因 OR2AG2存在缺陷哮喘患者通过影响平滑肌细胞的收缩力或肺和气道中受体表达细胞的粘液清除能力，可能会对强烈的气味刺激引起病情加重。
我们在家庭中观察到与我们的基因型发现显着的表型相关性。大多数哮喘患者会对环境中刺激物（包括过敏原）的增加敏感，并倾向于避免其增加的情况，因为暴露于较高浓度的刺激物和过敏原会导致严重的哮喘发作。该家庭的患者自我报告无法感知到代表敌对环境的气味和烟雾，直到空气中的含量明显升高，之后他们才出现严重症状甚至哮喘加重。但是，家庭的控制对象仍然不受影响。通过对家庭1的受试者使用不同稀释度的PEA（甜味）溶液进行气味阈值测试，证实了这一观察结果。哮喘对象中发现异味的能力明显降低，与同一个家庭的对照组相比，显示出相对低渗。尽管队列中基因型与表型的相关性不太明显，但我们观察到队列中约80％的哮喘患者携带了疾病等位基因的副本。尽管气流限制的差异不大，但这些都是轻度至中度哮喘的年轻哮喘患者。小儿哮喘队列中与基因型相关的差异可能会出现更长的时间。另外，哮喘队列的更大样本量和更广泛的基因组分析，例如非基因型变异的推算，可以提供更多信息。值得注意的是，开始调查的索引族已经引起了众多哮喘患者的临床关注，并且控制起来更加困难。对儿童哮喘受试者的进一步调查随访也可能使该受试者更加了解。
总之，这些数据与一个模型相符，在该模型中，OR2AG2的先天遗传缺陷或获得性细胞因子介导的OR2AG2抑制均导致哮喘发病。由于嗅觉功能与哮喘表型有关，已知强烈的气味会触发哮喘，因此其机制可能与嗅觉异常或气道平滑肌细胞松弛受损有关。但是，不能排除其他可能性，需要进一步探讨OR2AG2在哮喘遗传学中的相关性。最后，我们的研究强调了大型家族研究在加速复杂疾病的遗传发现中的价值。
这项研究确定了一个多代哮喘家族（家庭1）（图 1）。受试者是由家庭中熟悉的几代医生诊断的，基于发作性胸部症状以及满足美国胸科学会（ATS）标准19的肺功能的历史。根据全球哮喘倡议（GINA）指南，大约40％的家庭成员被诊断出患有过敏性哮喘和特应性。我们对所有获得研究书面同意的20名受试者进行了支气管扩张剂治疗前后的肺活量测定（表 1）。）。没有哮喘的特应性受试者（例如过敏性鼻炎/皮炎）被排除在分析范围之外（III-13，IV-5，IV-29，V21和V41）。除此之外，还使用了来自小儿队列的141名哮喘患者和130名对照进行了全基因组基因分型。小儿受试者是印度新德里全印度医学科学研究所（AIIMS）正在进行的前瞻性哮喘研究队列的一部分，该研究正在收集其多维基因型和表型数据。根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会的标准（ATS / ERS）招募哮喘儿童20使用患者病史，症状和肺功能评估以及知情同意书。对照正常成年人是健康的非吸烟志愿者，没有胸部疾病/症状的病史，因此被选择用于代表呼吸道疾病低风险人群。
从所有参与受试者获得书面知情同意书（对于儿童，则获得父母/监护人的同意）。向参加者及其父母解释了研究的性质及其目的。这项研究是根据印度德里CSIR基因组与整合生物学研究所的机构人类伦理委员会批准的相关准则进行设计和进行的，伦理批准号为IHEC / 2015/06和全印度医学科学研究所（ AIIMS）哮喘队列研究伦理委员会，批准号A-15 / 5.5.2008。
家谱描述了近亲的情况，但没有明确的继承方式。因此，对于外显子组测序，选择了来自家谱遥远分支的受影响受试者。补充说明了用于外显子组测序的样品选择标准的细节。使用Qiagen DNA血液微型试剂盒从血液中分离DNA。使用Illumina TruSeq选择8位受试者-II：5，III：7，III：9，III：10，IV：31，IV：34，V：27，V：42（5例和3个对照）进行外显子组测序DNA外显子组试剂盒，用于按照制造商的规程捕获外显子区域。将6个样品多路复用并装在Hiseq的单个泳道上。2000流通池用于测序。测序后，对数据进行质量检查（QC）和生物信息学分析21进行了一些细微的修改，如补充方法（补充图 E1A）所述。
为了了解这些变体对人类生理学和疾病的潜在影响，利用了计算机模拟预测工具（如SIFT 22，Polyphen-2 23，CADD 24，GERP 25和MutationTaster 26）来确定优先级并选择对哮喘生物学有影响的有害变体（补充图 E1B）。除此之外，与所有受影响的受试者（即在疾病条件下）共同分离的哮喘中未报道的基因（即新型）变异体被优先考虑。使用Exome Variant Server 27和1000Genome变体从dbSNP数据库28获得了每个变体的次要等位基因频率（MAF）。NHGRI，NCBI，Genecards和SNP4疾病被用于列出已知的哮喘基因。
为了消除假阳性，使用SNaPshot（单核苷酸变异）和Sanger测序（插入缺失）方法，在家族的所有20个成员中确认了从外显子组数据中筛选出的遗传变异。底漆细节在补充表E1中提供 。
在来自该家族的20名受试者的DNA中，按照制造商的规程，使用Illumina Infinium Global Screening Array试剂盒2.0版进行全基因组基因分型。使用Genome Studio 2.0调用了基因型。使用Haploview 29进行连锁分析，并使用PHASE工具30 2.1.1版（在补充图 E3中显示）进行单倍型分析。
从271个个体（141个哮喘患者和130个对照）的持续病例对照队列（如下一个子主题中所述）中获取的DNA中，按照制造商的规程使用IlluminaOmni1-Quad SNP试剂盒进行了全基因组基因分型。表2中提供了主题详细信息 。使用PLINK软件31对数据进行质量控制和分析。该数据集用于检查人群中外显子组测序与哮喘之间已验证变异的关联。
来自AIIMS小儿哮喘队列的141名受试者接受了3个月的随访，为期5年。小儿科目是印度新德里全印度医学科学研究所（AIIMS）正在进行的一项前瞻性哮喘研究队列的一部分，该研究正在收集多维基因型和表型数据（该研究已得到AIIMS伦理委员会的批准）。根据患者的病史，症状和肺活量评估，根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会标准（ATS / ERS）20招募哮喘儿童。对照正常成年人是健康的非吸烟志愿者，没有胸部疾病/症状的病史，因此被选择用于代表呼吸道疾病低风险人群。表2中提供了样本详细信息 。在这些随访过程中记录肺功能值，呼出一氧化氮（FeNO），恶化频率。在15次随访中绘制了肺功能的预测值。根据年龄，性别和身高调整呼出气的一氧化氮值（FeNO）和恶化频率。两者的实际值均使用调整后的值进行归一化。所有的图已经显示在图 4中。队列特征来自三个基因型组GG，CG和CC。为了比较基因型之间的FeNO值和加重频率，分别计算了从随访1到随访15的三种基因型的FeNO实际值/调整值/恶化频率的平均值，并作了图，如图 3和图6所示。 4。在使用Shapiro-Wilk检验检验正态性假设后，使用ANOVA（参数）和Kruskal-wallis检验（非参数）计算了肺功能，呼出气一氧化氮和恶化频率的基因型之间差异的统计显着性。使用Bonferroni校正（P-值≤α/ n）进行多次检验校正，进行10次比较，当P值≤0.005时，对于α= 0.05，结果被认为是有意义的。所有分析均使用R统计软件进行。
使用Chimera工具32获得了蛋白质OR2AG2的 3D结构。使用NCBI blast工具和t-coffee 33进行多序列比对，以研究目标变体侧翼区域蛋白质序列的保守性。
经过机构审查委员会（来自我们的合作者YS Prakash博士）的批准，在经过梅奥诊所罗切斯特圣玛丽医院进行胸外科手术的患者的知情同意下，获得了人的肺标本。样本来源的患者是白种人。补充表E2中提供了人类受试者的详细信息 。
在线补充中提到了细胞培养，总细胞/组织裂解物，cDNA合成，实时PCR和免疫印迹的方案。
使用从德国Burghart Messtechnik GmbH购买的Sniffin's Sticks使用2-苯乙醇（PEA，甜味）进行鉴定和阈值测试。测试使用制造商的协议11。在测试期间，实验人员对患者的分配视而不见。患有鼻炎/鼻窦炎的受试者被排除在测试之外。气味分数定义为受试者能够识别气味分子的管数。气味阈值的平均分数是检测气味分子的逆估计，即，受试者的平均分数较低，因为嗅觉受体的激活将需要较高浓度的气味配体，所以它们检测气味的能力较差。
两组之间的比较是在使用Shapiro-Wilk检验进行正常性检验之后，使用未配对的学生t检验（参数）和Wilcoxon检验（非参数）进行的。同样，为了比较两个以上的组，基于正态性检验执行了ANOVA或Kruskal wallis。除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±SEM。
所有结果均可在手稿或补充文件中找到。根据合理的要求，通讯作者可以提供其他信息。
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