摘要
2型糖尿病（T2DM）与人类胰岛淀粉样多肽（hIAPP）聚集为细胞毒性淀粉样物质有关。在这里，我们测试了二苯基吡唑（DPP）衍生的小分子抑制剂anle145c对hIAPP的细胞毒性和聚集特性的影响。我们证明了与抑制剂孵育的hIAPP产生了〜10 nm大小的无毒寡聚物，与hIAPP的初始聚集状态无关。这表明anle145c具有特殊的作用方式，其中anle145c稳定的低聚物充当hIAPP和anle145c的优选聚集状态的热力学吸收剂。我们还证明了该抑制剂以非常有效的方式起作用，亚化学计量浓度的anle145c足以（i）抑制hIAPP诱导的INS-1E细胞死亡，（ii）防止溶液中的hIAPP原纤维形成，并且（iii）将预先形成的hIAPP原纤维转化为无毒的低聚物。总之，这些结果表明anle145c是抑制T2DM中淀粉样蛋白形成的有前途的候选者。
蛋白和聚集的错误折叠成淀粉样结构与许多疾病有关，包括2型糖尿病（T2DM），帕金森氏病和阿尔茨海默氏病1，2，3，4。这些所谓的淀粉样蛋白疾病通常具有与年龄有关的病理作用的标志。然而，2型糖尿病有很大区别，它是一种常见的代谢性疾病，联系到生活方式和肥胖5，6，7，即使在早期的年龄越来越影响人们7，8，9。它在世界各地流行开始采取流行病的程度和T2DM从而代表了社会的主要健康问题7，10。
在T2DM甲突出的病理事件被认为是有毒的淀粉样蛋白物质的由37形成氨基称为人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）酸蛋白11，12，13。hIAPP是一种与胰岛的兰格汉斯岛的胰岛β细胞中的胰岛素共同分泌的激素。在典型的用于T2DM的病理状况，hIAPP在相对高浓度的产生，从而促进聚合并有助于胰腺细胞死亡14，15。聚集过程还可以通过因素的影响，如金属离子，胰岛素，硫酸化聚糖和膜的存在下16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，由此复杂的解释在体内在分子水平上的研究。然而，对于hIAPP在2型糖尿病的一个重要角色是由hIAPP聚集的高患病率在2型糖尿病人中找到了意见强调5，11，26和物种，其IAPP不能形成纤维据报道，他们不发展T2DM特征在于胰岛淀粉样沉积物27，28，29。
抑制hIAPP淀粉样蛋白形成被认为是帮助对抗T2DM的有效策略。几种天然小分子的淀粉样蛋白抑制剂化合物，如没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），白藜芦醇和姜黄素，以及各种合成抑制剂已经显示出能够抑制hIAPP纤维性颤动或减少hIAPP的细胞毒活性4，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39。然而，发现大多数这些抑制剂仅在相对较高的浓度下才有效地起作用。
最近，已经开发了一系列的二苯基吡唑（DPP）淀粉样蛋白抑制剂，可以作为有希望的低聚物调节剂来对抗淀粉样蛋白疾病40。值得注意的是，先导化合物“anle138b”被发现抑制蛋白质聚集的朊病毒病，帕金森氏病（PD），阿尔茨海默氏病（AD），多系统萎缩（MSA）和克罗伊茨费尔特-雅各布病（CJD）的情况下，在体外和在体内40，41，42，43，44，45，46，47。对于任何一种DPP化合物，均未测试对hIAPP的影响。然而，hIAPP是一个有趣的靶标，因为它形成的寡聚物具有不同于其他经过充分研究的淀粉样蛋白形成蛋白48的某些特征。
在这里，我们开始阐明DPP化合物是否可以有效对抗hIAPP的聚集。在此初始研究中，我们选择了DPP衍生的小分子抑制剂anle145c，因为它在结构上非常亲脂性铅化合物anle138b，并且同样是淀粉样蛋白聚集的有效抑制剂。Anle145c还具有比anle138b更具水溶性的优势，其溶解度介于50至100 µM之间，而anle138b 40的溶解度约为0.2 µM 。因此，避免了由于抑制剂在水性环境中聚集而造成的假象，并且可以在anle138b不可能实现的浓度下轻松，系统地研究anle145c与hIAPP的相互作用。
我们的发现表明，该分子可通过hIAPP在亚化学计量浓度下有效抑制聚集和细胞毒性，并且能够通过热力学稳定无毒寡聚物，将成熟的淀粉样蛋白原纤维转化为无毒的anle145c稳定的寡聚物。结果表明，在T2DM的情况下，anle145c是抑制蛋白质聚集的有希望的候选者。
在这项研究中，我们调查了hIAPP和小分子抑制剂anle145c之间的相互作用。图 1显示了这些分子的结构。
（A）hIAPP的主要结构。该肽在Cys2和Cys7与酰胺化的C末端之间具有二硫键。（B）DPP衍生物anle145c的化学结构。
使用大鼠胰腺β细胞系的胰岛素瘤（INS-1E）细胞，测试了anle145c保护活细胞免受hIAPP诱导的细胞毒性的能力。这些细胞与胰腺中产生胰岛素的β细胞非常相似，已知它们会在T2DM 15的条件下受损，这很可能是hIAPP聚集的结果。
如图2A的显微照片所示 ，未处理的INS-1E细胞显示出贴壁细胞的正常表型。大多数细胞是有活力的，并附着在细胞培养皿上。相反，经hIAPP处理的细胞似乎具有受损的细胞生长。与hIAPP孵育后，观察到细胞形态发生变化，大多数细胞脱落，表明大量细胞死亡（图 2B）。然而，当在hIAPP之前添加低浓度的anle145c时，细胞再次以类似于不存在hIAPP时的形态生长（图 2C）。基于流式细胞术的DAPI染色（图 2G）证实了hIAPP诱导的细胞死亡，并证明该抑制剂可以挽救细胞活力。1 µM anle145c的浓度已经相当于抑制剂与hIAPP的1/10摩尔比，已经足以产生最大的拯救作用，而进一步提高anle145c的浓度则不会进一步抑制hIAPP诱导的细胞死亡。此外，结果表明存在于所有含有anle145c或hIAPP或两者的样品中的DMSO浓度不会引起实质性的细胞死亡，而且抑制剂本身也不具有细胞毒性。
hIAPP和anle145c对INS-1E和MJS细胞的影响。上图：孵育6小时后INS-1E细胞的显微图像，显示（A）未处理的细胞，（B）与10 µM hIAPP孵育的细胞，和（C）与1 µM anle145c和10 µM hIAPP孵育的细胞。中：孵育24小时后MJS细胞的显微镜图像，显示（D）未经处理的细胞，（E）细胞与10 µM hIAPP孵育，以及（F）细胞与1 µM anle145c和10 µM hIAPP孵育。比例尺代表175 µm。下图：孵育24小时后对死细胞的百分比进行定量，通过对INS-1E细胞（G）和MJS细胞（H）。两幅图均从左至右显示未经处理和经DMSO处理的细胞，然后依次显示在存在不同浓度的anle145c的情况下为10 µM hIAPP和在没有hIAPP的情况下为5 µM anle145c。除未处理的细胞外，所有样品均含有相同的最终DMSO浓度（5体积％）。误差棒代表来自两个独立实验的标准误差。
作为独立的对照模型，我们使用了人黑素瘤细胞系（MJS细胞）产生的细胞，该细胞对hIAPP具有毒性。如图2D所示，这些细胞具有与INS-1E细胞明显不同的形态。然而，对于MJS细胞，获得了相似的结果，即在加入hIAPP后大量细胞死亡（图2E，H），在低浓度抑制剂存在下存活力增加（图2F，H），没有明显的细胞毒性抑制剂本身。
为了深入了解hIAPP和anle145c之间相互作用的分子性质，我们接下来研究了在不存在和存在抑制剂的情况下hIAPP的聚集行为。
使用ThT结合测定法追踪hIAPP的聚集动力学。ThT是一种广泛使用的荧光染料，不与单体hIAPP结合，但在与淀粉样蛋白结构结合后显示出增强的荧光49。如图3A所示， 在缓冲液中孵育hIAPP会导致〜3 h的初始滞后阶段，然后ThT荧光强度急剧增加（生长阶段），直到达到〜6 ha饱和水平（高原阶段）为止。 。anle145c的浓度已经很低，导致高原区域的荧光强度显着下降，直到anle145c与hIAPP的摩尔比为1/5时，再也检测不到荧光强度增加（图 3B）。）。值得注意的是，原纤维形成的滞后时间似乎几乎不受抑制作用的影响（图 3C），表明anle145c可能作用于原纤维形成之前存在的晚期低聚物，从而将它们排除在原纤维形成过程之外。但是，另一种解释可能是抑制剂与ThT竞争结合在原纤维上，从而降低了ThT强度50。
anle145c对溶液中hIAPP纤颤的影响。（A）在不同的anle145c / hIAPP摩尔比下不存在（红色）和存在抑制剂的情况下的hIAPP原纤化动力学，如图所示（B）孵育12小时后的平均ThT强度和（C）平均中点（t 1 / 2）在不同浓度的anle145c存在下的S形过渡。误差棒代表两个独立的ThT实验的标准偏差，每个实验一式三份。（D）在不存在anle145c和（E的情况下）孵育12 h后hIAPP的负染色TEM图像）在anle145c与hIAPP的摩尔比为1/5的情况下存在anle145c（白色标尺代表500 nm）。在不存在的情况下，hIAPP的脂肪族区域的（F）1 H NMR谱图；在anle145c 与hIAPP的摩尔比为1/5 的情况下，（G）在存在的anle145c的情况下。插入图显示了峰的积分强度随聚集时间的变化，对应于单体的耗尽，可能还包括小型，可移动的低聚物。
为了区分这些可能性，我们进行了负染色TEM。如图3D所示，在 孵育12小时后，hIAPP形成成熟的淀粉样原纤维，而在抑制剂与hIAPP的摩尔比为1/5的情况下，在anle145c存在下，未观察到hIAPP的原纤维形成（图 3E）。相反，形成小的非原纤维复合物，证实了在亚化学计量浓度的抑制剂下对原纤维形成的完全抑制。
如果抑制剂确实作用于晚期低聚物，则不应显着影响聚集过程中单体耗竭的动力学。如图3F，G所示，对于脂肪族区域，在不存在和存在anle145c的情况下，通过在hIAPP上的1 H NMR 进行测试。在这两种情况下，都观察到强度随时间的降低，这是由于淀粉样蛋白形成过程中单体的消耗，以及由于小寡聚物的潜在消耗而造成的，该小寡聚物仍然足够小且可移动以有助于NMR信号51。信号强度的量化表明，单体和小的低聚物耗竭的动力学确实与1/2相似。两种情况下的5.7小时值。数据还表明，hIAPP单体几乎被完全消耗。对于芳族区域，没有留下可辨别的信号（补充图 S1），因此可以得出结论，溶液中至多仅可忽略量的hIAPP单体。
在不存在和存在anle145c的情况下温育hIAPP时形成的不同hIAPP物种的性质进一步通过不同的生物物理方法来表征。
通过动态光散射（DLS）研究了颗粒的大小。图 4A显示，在缓冲液中新溶解的单体hIAPP具有约1 nm 的流体力学半径（R H）。孵育16小时后，仅观察到约2–10 µm的非常大的颗粒，这与淀粉样蛋白原纤维的形成一致。当新鲜溶解的hIAPP在抑制剂存在下以anle145c与hIAPP的亚化学计量比为1/5进行孵育时，初始R H仍为〜1 nm。但是，在这种情况下，孵育后仅观察到相对较小的R H升高至约10 nm。
在不存在和存在anle145c的情况下，以anle145c与hIAPP的1/5摩尔比表征hIAPP聚集体。（A）DLS结果显示了在时间t ＝ 0和孵育16小时后，在存在anle145c（右图）的情况下hIAPP（左图）和hIAPP的大小分布，如图所示。（B）AFM结果显示了在孵育16小时后hIAPP（左图）和存在anle145c（右图）的hIAPP的显微照片（上图）和截面分析（下图）。（C）在添加（黑线）和温育22小时（亮线）后立即在不存在（蓝色）和存在（绿色）anle145c的溶液中hIAPP的CD光谱。还显示了缓冲液中anle145c的光谱（黑色）。
通过原子力显微镜（AFM）进一步表征了低聚物质。如图4B所示 ，hIAPP自身形成长度为几μm的原纤维（左，上），而在存在抑制剂的情况下，仅观察到小颗粒（右，上）。通过截面分析获得的单个高度轮廓显示，在存在抑制剂的情况下，原纤维（左，底部）的高度约为4-6 nm，而颗粒的高度约为1-3 nm。
最后，使用CD光谱监测anle145c对hIAPP构象行为的影响（图 4C）。在不存在和存在anle145c的情况下，新溶解的hIAPP的CD光谱在200 nm处显示一个负椭圆度的峰，表明该肽主要采用无规卷曲结构。孵育后，在不存在抑制剂的情况下，hIAPP的构型改变为最小约220 nm的模式，表明存在β-片层形成，而当anle145c与hIAPP的化学计量比为亚化学计量比时，未观察到hIAPP的变化。 1/5。这些结果表明anle145c或者与hIAPP具有与新鲜溶解的hIAPP相似的构象的寡聚结构结合，或者hIAPP的寡聚结构在结合抑制剂时采用这样的构象，从而有效地防止了它形成类似β-折叠的原纤维。
一个重要的问题是anle145c是否能够对生长的原纤维起作用，如果可以的话，会形成什么样的结构。如图 5A所示，再次以低于化学计量的浓度向hIAPP原纤维中添加anle145c，导致ThT强度迅速降低，这表明hIAPP原纤维经历重塑并转化为较小的结构，不与ThT结合。EM证实了这一点（图 S2）。重要的是，DLS测量（图 5B）和AFM测量（图 5C）显示，从原纤维开始获得的粒径与将抑制剂与hIAPP单体共同孵育时获得的粒径相似（图 4A，B）。在不同的孵育时间添加anle145c的DLS和AFM测量（补充图 S3和S4）进一步表明，最终的低聚状态与hIAPP的起始聚集状态无关（补充表 S1和S2）。如果是这种情况，那么anle145c也应该能够将hIAPP原纤维中的β-折叠结构转换回为大部分随机的线圈构象。在不同的孵育时间加入anle145c后，hIAPP原纤维的CD测量值（图 5D）显示，hIAPP的构象确实恢复为hIAPP单体与抑制剂共孵育时所观察到的构象（图 4C）。
在anle145c与hIAPP的摩尔比为1/5的情况下，将anle145c添加到成熟的hIAPP原纤维中的作用。（A）在不存在anle145c（黑色）并且在t ＝ 0（蓝色）和t ＝ 8h（绿色）加入anle145c时hIAPP原纤维形成的动力学。（B）DLS显示完全形成的hIAPP淀粉样蛋白原纤维的尺寸分布，其在添加anle145c之前（顶部）和在添加anle145c之后（底部）16h。（C）在hIAPP温育16小时后的AFM，显示完全形成的hIAPP原纤维（左）和在与anle145c另外温育23小时后（右）的含有相同原纤维的样品。（D）在以下时间点与anle145c孵育后，新鲜孵育的IAPP（深蓝色），hIAPP纤维（浅蓝色）和hIAPP纤维的CD光谱：t = 4小时（浅绿色）和t = 16小时（深绿色）。（E）通过将hIAPP原纤维与anle145c温育16小时（规模为200μm）而获得的anle145c稳定的hIAPP低聚物加入后，INS-1E细胞的显微图像。（F）定量添加hIAPP后24小时（左）和添加衍生自与anle145c一起温育的hIAPP原纤维的anle145-稳定的寡聚体后24h的死细胞百分比。误差棒代表来自两个独立实验的标准误差。
如果Anle145c稳定的寡聚物对细胞无毒，则只能与体内相关。因此，测试了寡聚物对INS-1E细胞系的作用。如图5E所示 并在图5F中进行了量化 ，结果表明，将细胞与源自hIAPP原纤维温育的anle145c稳定的寡聚体温育时，它们仍然保持大多数活力，类似于将单体hIAPP添加到细胞中的情况在存在anle145c的情况下（图 2F，G）。
总之，在不同的孵育时间点将anle145c添加到hIAPP中所获得的结果表明，在存在anle145c的情况下，稳定anle145c的寡聚物形成了hIAPP的优选聚集状态的热力学阱，并且这些寡聚物是无细胞毒性的。
在这里，我们研究了DPP衍生的小分子抑制剂anle145c与hIAPP之间的相互作用，并研究了该抑制剂对hIAPP诱导的细胞毒性的影响。我们将首先讨论解决方案中的情况。
我们发现anle145c是溶液中hIAPP聚集的非常有效的抑制剂，亚化学计量浓度的anle145c足以完全抑制原纤维形成。代替原纤维，形成了寡聚物种，我们称之为“ anle145c稳定的寡聚体”。通过DLS，EM和AFM实验观察到的尺寸分布与〜10 nm的低聚物一致。在与anle145c的低聚复合物中，hIAPP的二级结构主要是无规卷曲，类似于新鲜溶解的单体hIAPP，但也类似于有毒和无毒的低聚物48。
1 H NMR实验表明，anle145c不会募集单体hIAPP物种或小的低聚物，因为它的存在似乎并不影响单体消耗的半衰期。此外，单体物质的招募将有效地降低hIAPP单体浓度，从而导致增加的原纤维形成滞后时间51，52，53，它完全不会受到的ThT测量观察到。相反，我们的发现，原纤维形成的滞后时间与anle145c的浓度无关，这表明anle145c作用于在原纤维形成之前存在的晚期寡聚物种。然后，这将防止它们成为生长的原纤维的一部分，但不会干扰原纤维形成过程本身。
已经提出hIAPP寡聚物经历“活化”，即。具有高能垒的过渡，从无规卷曲组织中的低聚物到有序的β-片层低聚物，然后它可以长成原纤维54。anle145c可能通过与寡聚体相互作用并阻止形成热力学上更有利的状态来阻止此“活化”步骤。然后，这种状态将由稳定的hIAPP寡聚体组成，其中hIAPP保留为大部分随机的卷曲构象。
与热力学上优选的种类一致，anle145c稳定的低聚物不仅可以通过与单体hIAPP物种孵育获得，还可以通过与原纤维孵育而获得。发现两个低聚物群体的行为非常相似，这是因为它们具有相似的大小分布和构象，并且它们对细胞无毒。此外，在孵育的不同时间向hIAPP群体中添加anle145c表明，anle145c稳定的寡聚物的形成受热力学控制，即。无论hIAPP聚集体的初始种群分布是什么，都将获得具有相似最终尺寸分布的anle145c稳定的寡聚物。
原纤维形成hIAPP的确切途径尚不清楚，但他们很可能会涉及到许多不同的潜在寡聚中间体48，55，56。在图 6中，我们提出了一个简化的模型来总结anle145c对溶液中hIAPP的主要影响。值得注意的是，较小的非毒性寡聚体的稳定化也已观察到在体内对α突触核蛋白与相关anle138b 40，46。两项观察结果均与DPP化合物的体外设计原理一致，后者是将较大的寡聚物转化为较小的寡聚物40。尽管如此，anle145c对hIAPP的作用还是很明显的，原因有两个。
anle145c与hIAPP相互作用的模型。热力学由不同聚集状态下的水平条定性表示，因为ΔG和动力学差异由箭头表示。聚集状态在水平轴上定性表示。在没有anle145c（黑色箭头）的情况下，hIAPP分子呈无规卷曲构型（1）相互作用形成寡聚体（2）。随着时间的流逝，这些低聚物的性质会发生变化，并且将形成β-片层结构（3），最终将长成成熟的淀粉样原纤维（4），这被认为是热力学上最稳定的形式。当hIAPP在anle145c（红色箭头）存在下孵育时，它与（晚期）hIAPP低聚物相互作用形成稳定的，无毒的anle145c稳定的低聚物（5），低聚物保留了大部分随机的卷曲构型。当将anle145c添加到生长的原纤维或其他时间点形成的hIAPP聚集体中时，可获得类似的无毒的anle145c稳定的低聚物，表明anle145c稳定的低聚物充当热力学吸收体。这些anle145c稳定的低聚物形成的确切途径尚不清楚。
首先，我们使用了铅化合物anle138b的水溶性更高的变体，到目前为止，该变体还没有广泛测试其抑制淀粉样蛋白形成的能力。出乎意料的是，这项研究的结果表明anle145c可能是迄今为止报道的最有效的hIAPP原纤维形成抑制剂。实际上，发现在亚化学计量的anle145c浓度下，可以防止（i）原纤维形成，（ii）hIAPP诱导的细胞死亡得到抑制，并且（iii）原纤维转化为无毒的anle145c稳定的低聚物。据我们所知，这是首次报道hIAPP抑制剂化合物对这三种作用均具有如此高的效率。此外，Anle145c似乎以前所未有的方式发挥作用，将hIAPP以无毒的anle145c稳定的低聚物形式捕获在热力学池中。
效果显着的第二个原因是，先验的人不可能假设DPP化合物会有效对抗hIAPP毒性低聚物。这是因为hIAPP低聚物具有的某些特征与其他经过充分研究的淀粉样蛋白形成的蛋白质（例如α-突触核蛋白57）不同，即它们不显示广泛的二级结构，并且它们不暴露疏水性表面以使它们与疏水性结合分子，例如1-苯胺基萘-8-磺酸（ANS）48。在anle145c存在下观察到的对聚集的有效抑制，从而突出了DPP化合物对抗淀粉样蛋白聚集的一般效率。
在细胞中，我们观察到以比抑制溶液中hIAPP聚集所需的化学当量更小的亚化学计量比有效抑制hIAPP的毒性作用。这并不罕见，对于其中进行了比较，更高以及被发现较低浓度在细胞中需要比在溶液中抑制剂化合物31，32，58，59。重要的是，anle145c在细胞中的更高效率进一步增加了该化合物作为抑制剂预防hIAPP胰岛淀粉样蛋白形成并从而对抗T2DM的潜力。
总而言之，这项研究向现有的hIAPP淀粉样蛋白形成的潜在抑制剂系列中添加了高度有前途的抑制剂anle145c，并将T2DM作为DPP化合物可能靶向的另一种淀粉样蛋白疾病。因此，结果强调了DPP衍生化合物作为淀粉样蛋白疾病的小分子低聚物调节剂的潜力。
人hIAPP（氨基酸序列：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY，包括二硫键和酰胺化的C末端）获自Bachem AG（批号7001439）。硫黄素T（ThT）获自Sigma Aldrich。Anle145c由基于NMR的结构生物学部门（德国哥廷根MPIbpc）提供，并按照先前的描述进行合成40。
如前所述制备hIAPP储备溶液60。简而言之，将hIAPP溶解在1、1、1、3、3、3-六氟-2-丙醇（HFIP）中，并孵育1小时以消除任何先前存在的超分子结构。使用氮气蒸发HFIP，然后在真空干燥器中蒸发1 h。为了进行荧光，显微镜（TEM，AFM），DLS和细胞生存力测定，将所得肽膜以2 mM的浓度溶于DMSO中，并孵育1小时。如果需要，将hIAPP在DMSO中进一步稀释至所需浓度。对于NMR实验，将肽膜以50 µM的浓度溶解在10 mM磷酸盐缓冲液中，在D 2 O中的pH 7.4 。对于CD实验，将肽膜以25 µM的浓度溶解在10 mM磷酸盐缓冲液中。 ，pH 7.4。
将anle145c的储备溶液制成DMSO或DMSO-d 6中的10 mM溶液，用于NMR实验。
如前所述，使用Spectrafluor Tecan（奥地利萨尔茨堡）酶标仪进行硫黄素-T结合荧光测定61。通过监测荧光染料硫黄素T（ThT）与原纤维结合后荧光强度的增加来测量原纤维形成的动力学。使用了酶标仪和标准的96孔平底黑色微量滴定板以及430 nm激发滤光片和535 nm发射滤光片。首先将2.5 µL的anle145c在DMSO中的所需浓度添加到195 µL的缓冲液中，该缓冲液包含10 µM ThT，10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 7.4。然后通过添加2.5 µL的DMSO中的0.4 mM hIAPP溶液开始ThT分析。加入所有组分后立即将微量滴定板摇动10 s，但在测量过程中不要摇动。所有ThT分析均在不同的日子使用不同的hIAPP储备溶液对一式三份的样品进行。i和F t是初始和最终荧光值。这种拟合可以估算动力学参数，例如荧光达到其最大强度（t 1/2）的 50％的时间。
使用Technai 12电子显微镜以120 kV的电压记录TEM图像，如先前所述61。在不存在和存在anle145c的情况下，在与硫黄素T分析相同的条件下孵育溶液中的hIAPP。将该混合物的等分试样（20μL）放在辉光放电的300目碳涂层铜网格上2分钟，然后将网格吸干并干燥。如先前61所述，用饱和的乙酸铀酰酯（2％w / v）将网格负染色45秒，然后将它们吸干并干燥。使用Technai 12电子显微镜以120 kV操作检查栅格。
INS-1E大鼠胰岛素瘤细胞在RPMI 16％FCS，100 U / ml青霉素，100 µg / ml链霉素，10 mM HEPES，1 mM丙酮酸钠，2.5 mM葡萄糖和50 µMβ-巯基乙醇中培养。在含有10％FCS（PAA实验室），100 U / ml青霉素，100 µg / ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（完全培养基）的RPMI 1640（Invitrogen）中培养人类黑素瘤细胞系MelJuSo（MJS）。所有细胞系均在37°C和5％CO 2下培养。
在与hIAPP一起孵育之前，将细胞接种。在不同浓度的anle145c存在下将hIAPP加入细胞中。hIAPP的终浓度为10 µM。处理后，将细胞用PBS彻底洗涤，用胰蛋白酶消化并转移到96孔板中。将细胞与DAPI（2 µg / ml）孵育10分钟，并洗涤3次以去除染色液。使用FACS Canto II通过流式细胞仪测量所有样品，并使用FlowJo V10软件进行分析。
NMR实验是在Bruker Avance III光谱仪上记录的，该光谱仪在500 MHz 的1 H频率下运行，并配备有如先前所述51的TCI低温探针（温度20°C）。使用TopSpin程序（布鲁克公司）对实验进行处理和分析。在pH 7.4的D 2 O 中的10 mM磷酸钾缓冲液中进行测量。在无和存在anle145c的情况下，肽浓度为50 µM。将肽膜溶解在磷酸盐缓冲液中，然后立即转移到直径为5 mm的Shigemi管中，该管的样品体积为300 µL。肽信号强度随时间的变化随后记录一维1H谱图直到肽信号强度完全衰减。然后，对肽1 H共振（在脂肪族和酰胺/芳香族区域中）进行积分，并将这些值绘制为时间的函数，从而形成S型曲线，可以使用R程序通过Boltzmann S型方程来拟合该曲线。
在室温下，在Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments，英国）上，在不存在和存在不同浓度的anle145c的情况下，对hIAPP进行DLS测量。将2.5 µL anle145c在DMSO中的所需浓度的等分试样添加到195 µL缓冲液中，该缓冲液包含10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 7.4。随后加入2.5 µL溶于DMSO的0.4 mM hIAPP溶液，并将混合物转移至小容量比色杯中进行测量。每次测量平均进行7次，大约需要7分钟才能完成。记录体积百分比，其基于样品中多种成分的质量或体积而不是基于其散射（强度）来描述样品中多种成分的相对比例。数据处理通过Zetasizer软件实现自动化。
在配备有Nano-Scope IIIa控制器（Digital Instruments）的MultiMode扫描探针显微镜上，在攻丝模式下，在室温下以1.0至1.5 Hz的扫描速率在AFM测量下使用E型扫描仪（扫描尺寸为15 mm-615 mm ）和MMMC悬臂支架（Veeco Instruments，曼海姆，德国），配备有硅SPM传感器（PPPNCHR，NanoAndMore，韦茨拉尔，德国），如前所述62。将不带有和带有anle145c（10 µM）的hIAPP（50 µM）在10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl缓冲溶液中孵育不同的时间间隔，然后沉积在新鲜裂解的云母上。样品用温和的氮气流中，用水冲洗，用氮气流再次干燥，最后冷冻干燥过夜干燥，如先前所述61。在空气中以240 kHz左右的驱动频率和15至379 mV的驱动幅度扫描干燥的样品。采样区域的所有高度和振幅图像均以5.1 Mpixels的分辨率获取。对于图像分析和处理，使用软件NanoScope版本5（Veeco Instruments，曼海姆，德国）。
CD光谱在Jasco 810分光旋光计（Jasco Inc.，Easton，MD）上测量。在存在和不存在anle145c的情况下，在不同的温育时间下，在室温下在10 mM磷酸盐缓冲液中，hIAPP的pH 7.4的0.1 cm路径长度的细胞中进行测量。每0.2 nm以20 nm / min的扫描速率进行测量。报告的每个光谱是五次扫描的平均值。肽浓度为25μM。以hIAPP与anle145c 61的5/1摩尔比添加anle145c 。
hIAPP，人胰岛淀粉样多肽；ThT，硫代黄素；RH，水动力半径；DLS，动态光散射；AFM，原子力显微镜；EM，电子显微镜。T2DM，2型糖尿病；DPP，二苯基吡唑。
在当前研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
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