精神分裂症（Scz），自闭症谱系障碍（ASD）和智力障碍是常见的复杂神经发育障碍。海藻酸盐受体（KARs）是涉及突触可塑性的离子型谷氨酸离子通道，由辅助NETO蛋白调节。使用UK10K外显子组测序数据，我们询问了患有Scz，ASD或智力残疾和人口控制的个体中KAR和NETO基因的编码区。进行了后续的基因复制研究；并且进行了计算机和体外功能研究。我们发现与对照组相比，患有Scz的个体有过多的功能丧失和错义变异（p  = 1.8×10 -10），并确定了Scz（p  <1.6×10 -11）和ASD（p  = 6.9×10 -18）的功能变体负担很大。6个破坏性错义变体的单一等位基因关联得到了显着复制（p  <5.0×10 -15），并证实了GRIK3S310A作为保护性遗传因子。功能研究表明，位于GluK2和GluK4，GluK2（K525E）和GluK4（Y555N，L825W）中的三个错义变体会影响激动剂敏感性和电流衰减率。这些发现表明，KAR受体离子通道的遗传变异赋予了精神分裂症，自闭症和智力障碍的风险，并为神经发育疾病提供了新的遗传和药物遗传学生物标记。

精神分裂症和自闭症是常见的，高度可遗传的使神经发育失常的疾病，通常与智力障碍并存。在基因组技术的进步表明两种常见和罕见的变异导致遗传风险的作用1，2，3，4。例如，全基因组和外显子组测序研究表明，截断蛋白的超罕见功能丧失（LoF）点突变以及indel和CNV变异体在患有神经精神疾病的个体中富集，并且既是遗传的又是新生的5，6，7，8，9。这些研究通常发现被破坏的基因参与突触功能，从而导致对于被认为由突触功能障碍引起脑功能障碍的越来越多地使用术语“synaptopathy” 10，11，12。

海藻酸盐受体（KARs）是离子型谷氨酸能受体，其通过五个不同亚基的四聚体组合形成功能性离子通道。GluK1-3亚基形成功能性同源或异源受体，而GluK4和GluK5与GluK1-3亚基结合时作为功能受体参与。每个亚基由细胞外氨基末端结构域，细胞外配体结合结构域，三个跨膜结构域和环M2以及C末端结构域组成。突变在这些保守的区域的氨基酸产生了在信道特性的变化13和可改变为外部阳离子如钠和锂的亲合性14，15。KAR信道特性也由KAR辅助亚基的存在调节神经毡而Tolloid 1一样，NETO1，和神经毡而Tolloid像2，NETO2 16，17，18。

KARs通过影响突触前递质的释放19，有助于产生突触后的兴奋性反应和短期的突触可塑性机制。近年来，他们在不规范的G蛋白偶联的行动信号，新的长时程增强的形式，和突触目标机制，也被认为20，21，22，23。NETO1和NETO2是单程跨膜CUB域包含蛋白质，影响KAR亚基的贩运和KAR功能的动力学24。在发育过程中，KARs和Netos在大脑中高度表达，对于突触发生，神经突向外生长和谷氨酸能途径连通性非常重要25，26，27。啮齿动物基因敲除和转基因模型已经提供了一些证据表明，在以类似于这些受体影响脑功能和行为的损失人类疾病28，29，30，31，32，33。在人类中，常见的，非编码，内含子变体和私人从头位于内特定GluK亚基基因（例如突变GRIK1，GRIK2，GRIK3，GRIK4，GRIK5）已与神经系统疾病的广谱相关联34，35，36，37，38，39和在GluK认知，脑激活和响应基因型依赖性变化到抗抑郁和抗精神病治疗方法已被报道40，41，42，43。然而，在具有智力残疾和神经发育状况的人群中，尚未对所有GluK基因或KAR辅助蛋白的编码变体进行全面筛选。

我们假设，KAR亚基和NETO基因内的破坏性编码等位基因会导致发展神经发育障碍的风险。在这里，我们对具有精神分裂症，精神病，自闭症和智力障碍的人进行UKF评估和ExAC研究44，对LoF变异进行了表征，对KAR亚基和NETO基因内的破坏性编码变异进行了单等位基因关联和负担富集分析。随后，我们使用计算机模拟工具和体外电生理测定法检查了GluK2和GluK2 / GluK4受体内预计的破坏性错义变体的功能作用。

LoF和罕见的错义变异在神经发育障碍个体中增加

遗传分析所遵循的流程如图1所示   。在第一个发现阶段，我们鉴定了154个非同义变体，其中包括GRIK1-5和NETO1-2基因中的4个LoF和150个错义变体以及143个调控变体（表   1）。265个变体的MAF <1％，被归类为稀有或超稀有。我们推测，在一般人群中，特征在于几乎没有LoF和错义变异的基因会在患有神经发育障碍的个体中携带大量LoF和破坏性变异，因为这些变异可能会导致疾病风险。在ExAC项目数据库中，GRIK2，GRIK3，GRIK5和NETO1这些基因均被归类为LoF不耐受基因（LoF pLI> 0.90），表明这些基因对功能丧失变异极为不耐受，因此普通人群中几乎没有LoF突变。如表   1所示，我们在ID或ASD或与Scz并存的受影响个体中鉴定了4个LoF变异体（GRIK1 L411X，Scz与ID并存; GRIK4 S98X，ID; GRIK5 Q848X，ASD;以及GRIK5 19：42546908剪接受体，变体（ASD）），其中两个位于LoF不耐受基因GRIK5中。在对照队列中未发现LoF变异。

遗传分析工作流程。调查的数据集以蓝色显示，方法和分析以绿色显示，结果显示为橙色。发现阶段第一阶段分析了患有神经发育障碍（包括严重的神经精神疾病和ASD，ID和双重Scz-ID）的人群和一般人群控制人群的WES和WGS。第二个发现阶段调查了另外两个精神分裂症队列。队列的详细信息在补充表S1中列出 。进行了单一等位基因关联和负担分析。通过使用ExAC队列非精神病学控制人群和精神病学人群进行病例对照研究，对相关等位基因进行随访。缩写：ASD，自闭症谱系障碍；ExAC，外显子组聚合协会；FINSCZ，芬兰精神分裂症样本；ID，智障；MAF，次要等位基因频率；Scz，精神分裂症；SNV，单核苷酸变体；WES，全外显子组测序；WGS，全基因组测序。

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ExAC还对GRIK2，GRIK3，GRIK4，GRIK5和NETO1进行了分类。因为错义不耐症基因（missense z> 2.80）再次表明，这些基因中的普通人群中存在的错义突变比预期的少。在当前研究中鉴定出的150个错义变体中，有75个被认为是蛋白质破坏型，有40个被认为是可能破坏型，35个被认为是良性。发现受影响个体中的罕见和超稀有非同义变体的数量要多于对照个体中发现或共有的罕见非同义变体的数量，尽管事实是对照群体的个体数是两倍（受影响的病例频率为0.58；控制频率为0.26；在两种情况下都可以找到变体，控制频率为0.16）（补充表   S4 – S7）。如图   2所示，在Scz和ASD患者中发现了大部分LoF和预期的破坏性错义变体，而在对照中发现了大多数预测的良性错义变体，或在病例和对照组之间共享（补充表   S8）。与罕见的LoF和错义突变相反，在病例和对照个体中发现了相同频率的常见非同义，同义和调节变体。鉴定出的最常见变体（MAF> 0.1）是同义变体（87.5％），在病例和对照个体中均存在。

功能变体的频率和效果大小以及GRIK2和GRIK4中非同义变体的位置。（A）与首次发现研究中的对照个体相比，患有严重神经精神病（即精神病）和ASD的个体具有更高百分比的罕见功能变异。（B）与精神分裂症的个体相比，在第二个发现研究中，具有比对照个体更高的稀有功能性变体百分比。（C）LoF和错义变体在分类为LoF和不义错的基因中具有比调节变体更大的风险效应大小。（D）与LoF和破坏性错义变体相比，监管变体和良性错义变体的风险影响规模较小。（E）在受影响和对照个体的GRIK2和GRIK4蛋白内鉴定的LoF和破坏性错义变体的位置。蛋白质域用ATD颜色编码为蓝色；LBD（S1和S2）为黑色；跨膜结构域M1-M3-M4红色；M2循环为红色，C端域（CTD）为绿色。外壳或控件中携带的损坏的错义变体，或分别用蓝色和黑色进行颜色编码。（F）三个损坏的错义变体的位置，即GluK2 K525E，GluK4 Y555N和GluK4 L825W。术语“共享”表示在病例组和对照组中均发现的变体。缩写：ATD，氨基末端结构域；LoF pLI，LoF不耐受评分的适用性。

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我们还发现LoF不耐性基因内的罕见LoF和错义变体（LoF pLI> 0.90）的作用大小大于LoF耐受性低的基因内罕见LoF和错义变体的作用大小（0.3与-0.2相比）公制（图   2d）。此外，如图   2和补充图   S1所示，与分类为调节性的变体相比，稀有的LoF和错义变体被表明具有更大的作用大小，并且在LoF不耐性和LoF之间稀有的调节变体的作用大小没有差异。耐受基因。

与疾病风险或预防相关的单一编码等位基因

发现两个单一编码变体与疾病显着相关（表   1和补充图   S2，S3）。发现位于氨基末端结构域（ATD）的GRIK3 S310A对更广泛的神经发育表型具有保护作用，例如患有精神病和ASD / ID表型的疾病（p  = 1.01×10 -18 ; OR = 0.59，CI 0.52-0.66 ，）。GRIK3 F586V与发生自闭症的风险有关（p  = 2.84×10 -7；或= Inf）。此外，A895G位于GRIK5的胞质蛋白结构域内被发现在正常意义上对发展性精神分裂症具有保护作用（p  = 4.06×10 -5； OR = 44.83，CI 2.70–765）。

GRIK和NETO基因内编码变体的富集

我们分析了功能变异的负担和积累率，发现LoF，错义和调控变异的负担显着增加，其中包括病例人群中的所有等位基因频率（p  = 3.38×10 -20）。同样，如表   2所示，我们还发现超稀有和罕见的LoF，错义和调控变体的负担增加（p  = 2.07×10 -15）。当将较宽泛的神经发育表型（例如ASD，精神病和ID）或较窄的精神病表型与对照个体进行比较时，我们观察到所有GRIK和NETO内LoF和错义变异的负担显着增加基因（广泛的神经发育，等位基因频率，p  = 2.97×10 -10；广泛的神经发育，超罕见和稀有p  = 6.02×10 -7；精神病，所有频率；p  = 6.17×10 -7；精神病，超频率稀有和稀有p  = 1.83×10 -7）。我们还发现，在所有等位基因频率（p  = 6.86×10 -18）以及单独的超稀有和稀有变异（p  = 1.30×10 -9），LoF，错义和调控变体的负担明显增加。），以解决合并的智力障碍/ ASD人群。但是，尽管我们发现ASD / ID 的常见和稀有变体（p  = 3.15×10 -11）负担很大，但仅超稀有和稀有变体并没有达到全基因组范围的显着水平（p  = 0.026）。

还对每个单独的基因进行了负荷分析（补充表   S9 – S11）。GRIK3，GRIK5和NETO1这三个基因被分类为LoF和不义不育，表明其功能性变体的负担增加（GRIK3 p  = 1.26×10 -5的常见和稀有变体；NETO1 p  = 4.66×10 -16；和罕见变体仅适用于GRIK5 p  = 9.99×10 -6）。我们还评估了每个基因水平按严重的神经精神病学表型（即精神病）或ASD / ID表型分组。对于精神病分组，我们观察到在低频罕见的全基因组显著负担和内错义变异体GRIK5（p  = 7.83×10 -10）和常见和稀有功能性变体的内增加的负担NETO1（p  = 6.76×10 -6）。对于ASD和ID样本，我们确定了GRIK3（p  = 3.31×10 -13），GRIK1（p  = 1.20×10 -5）内常见和稀有的LoF，错义和调控变异的基因组范围或名义上的重大负担。）和NETO1（p  = 2.79×10 -12）。

另外两个精神分裂症队列中的GRIK和NETO遗传关联

在第二个发现阶段，我们研究了另外两个精神分裂症数据集的外显子组，UKSCZ（N = 553）和FSZNK（N = 285）队列。与在第一阶段发现LoF变异是在具有ID或ASD的个体中识别出的情况不同，在第二阶段中我们没有识别出任何LoF变异。这可能与以下事实有关：所有受影响的个体都诊断为Scz，而不是ID或ASD。但是，我们检测到197个编码变体，其中97个是错义变体。预测58个错义变体会造成破坏，而这些破坏性错义变体中的34个（59％）仅在受影响的个体中被发现（补充表   S12 – S16）。和以前一样，我们调查了GRIK和NETO单一编码等位基因与Scz的风险或防御相关（图   S1 – S3）。内的剪接变体GRIK2 6：102337505，c.1525-10 C> T（p  = 4.43×10 -8 ; OR = 42.26，CI 2.53-704）和内的错义变异体GRIK3，R865G，（p  = 6.8×10 -6； OR = 73，CI 4-1226）显示出与精神分裂症风险显着相关（表   1）。

与我们先前对精神病表型的发现一致，我们观察到GRIK和NETO基因具有高功能编码变体的积累率（表   2，补充表   S17）。例如，我们发现在所有等位基因频率下，错义和调控变体的负担显着增加（p  = 1.26×10 -25），而仅错义变体的负担显着增加（p  = 4.39×10 -15）。另外，在GRIK3（p  = 5.24×10 -10）和NETO1中都发现了常见和稀有的错义变体的较高负担。和NETO2基因具有较高的常见和稀有调节变异体的积累率（p  = 1.60×10 -28和p  = 8.03×10 -10）。我们还观察到GRIK5中罕见的调控变异体的负担（p  = 3.37×10 -5）。

等位基因关联稳健性的证据

为了评估在发现阶段识别出的显着相关的单个等位基因的稳健性，我们比较了UK10K发现阶段受影响的病例与ExAC队列的未受影响外显子组（N = 45,376）中罕见和常见编码或剪接变体的等位基因频率。我们在表1和补充表S18中列出了8个全基因组显着关联（3个错义，4个同义词和1个剪接位点），   从而   验证了我们先前的发现。在这三种错义变体中，有两个与神经精神疾病的保护具有显着的关联，即GRIK3 S310A（p  = 6.49×10 -50； OR = 0.51，CI 0.47–0.56）和GRIK1 L902S（p  = 4.83×10-15 ; OR = 0.40，CI 0.32-0.48），而一个人显示出与神经精神疾病风险显着相关，即GRIK5 A895G（p  = 8.55×10 -24； OR = Inf）。我们还确定了在名义上的显着性水平相关的6个变体（3个错义，1个同义词和2个剪接位点变体），补充表   S18。

最后，使用来自ExAC的健康个体数据（N = 45,376）和来自ExAC研究的精神疾病部门（N = 15,328）的数据，其中包括患有其他神经系统和精神疾病的个体，例如Tourette综合征，因此涉及的范围更广神经发育表型，我们比较了先前在研究早期阶段发现的所有破坏性编码变体的等位基因频率。我们观察到九个重要的关联（p  <2×10 -34）；表1和补充表   S19中提供了5个错义变体，3个同义词和一个剪接变体   。显着性水平（1×10 -6至1×10 -108）反映检测具有非常大的样本数，例如，N = 45000的关联的动力，并且是符合值报道为在大群组研究个体的变体44，45，46。

与我们之前的发现一致，我们再次观察到GRIK3 S310A变体的等位基因频率存在显着差异（未受影响的个体MAF 0.29，疾病MAF 0.25；p  = 4.07×10 -35； OR 0.81，CI = 0.80-0.84）和GRIK3 R865G变体的名义意义（未受影响的个体，MAF 0.004，疾病MAF 0.006；p  = 2.07×10 -5；或1.49，CI = 1.22-1.73）。

在计算机和体外测定中，GluK2和GluK4 TMD和LBD域内的罕见变体支持功能作用

使用计算机模拟工具检查了在精神分裂症患者中鉴定出的三个预测的破坏性错义突变，它们位于GluK2和GluK4亚基的“关键”配体结合（GluK2 K525E）和跨膜（GluK4 L825W; GluK4 Y555N）域内。我们发现，GluK4 Y555N破坏了氢键，并导致了显着的热力学不稳定作用（Δ∆G = 1.65）。GluK4 L825W不会影响氢键的形成，但会对总能量产生轻微的破坏作用（∆∆G = 0.755）。GluK2 LBD K525E突变导致氢键的产生，但未预测到可预测的可观察到的热力学效应（Δ∆G = 0.06），如补充图S4所示。 。但是，在GluK2 K525E变体的配体结合结构域区域观察到预测的正静电势下降（补充图   S5），这可能会影响细胞表面表达47。总而言之，计算机模拟蛋白质模型分析表明这三个预测的破坏性突变可能影响蛋白质构象，结构关系或静电势。

为了进一步研究功能变化，我们在爪蟾卵母细胞中表达了野生型和突变的GluK2同聚物和GluK2 / GluK4异聚体，并使用电压钳测量了它们对谷氨酸应用的电流响应。电流上升至峰值，然后衰减至稳定状态（图   3b）。由于该系统的时间限制，电流代表了激活，去敏和去激活过程的混合，但大概是激活主导了上升阶段，而去敏和去激活主导了衰减阶段。我们测量了峰值电流（EC 50）和电流衰减率（τ 衰减），尽管这些当前动力学不是生理学，但我们比较了野生型和突变型受体之间的响应变化（图   3；补充表   20）。

GluK2和GluK4突变体的通道特性已改变。（A）上图：野生型GluK2和GluK2 / GluK4受体以及突变的GluK2 / GluK2 K525E，GluK2 / GluK4 Y555N和GluK2 / GluK4 L825W亚基组合的谷氨酸盐浓度-响应曲线。点是最大峰值响应±SEM的平均值，曲线是希尔方程的拟合值。下图：野生型和突变型GluK2 K525E，GluK4 Y555N，GluK4 L825W KAR 的pEC 50的比较。（B）上图：针对1 mM谷氨酸的10 s施用（巴）（针对野生型和突变的GluK2受体），野生型和突变型GluK2 K525E，GluK4 Y555N，GluK4 L825W KAR的两条微电极电压钳（TEVC）迹线或-80 mV时0.1 mM谷氨酸盐（用于野生型和突变的GluK2 / GluK4受体）。已经对响应进行了缩放，以使峰值响应等于辅助比较电流衰减动力学，因此没有垂直比例尺。下图：比较野生型和突变型GluK2 K525E，GluK4 Y555N，GluK4 L825W KAR的电流衰减τ1值。统计学上的显着差异表示为*（p  <0.05），**（p  <0.01）或****（p  <0.0001）。缩写：谷氨酸，谷氨酸；hGluK2，人GluK2；KA，海藻酸，PEC50：EC 50值的负对数。

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GluK4 L825W将GluK2 / GluK4受体的峰值电流产生的谷氨酸效能降低了42.6倍（p  = 0.0001，n = 10-18）。同样，GluK4 Y555N突变体将GluK2 / GluK4受体峰值电流的谷氨酸效能降低了15倍（p  = 0.0001，n = 9-13）。GluK2 K525E LBD变体本身不起作用，但是当与GluK2共表达时，GluK2同聚物的谷氨酸效能降低了4.5倍（p  <0.05，n = 15-17）（图   3a，b）。这些结果暗示KAR通道活性降低。

发现 在施用0.1 mM谷氨酸后，GluK2 / GluK4 L825W和GluK2 / GluK4 Y555N异构体的电流衰减速率比GluK2 / GluK4野生型受体慢2.3倍（分别为p  = 0.047和p = 0.002）（图。   3，补充表   S20）。这表明两个GluK4突变都可能导致通过通道的功能轻度增加，并可能长时间保持开放状态。GluK2 K525E并未显着影响电流衰减率。综上所述，我们的观察结果支持所有突变体的功能总体可能下降。

我们在两个发现阶段对约4,580个基因组进行了综合分析，得出的结果支持以下假设：在患有精神分裂症，自闭症和ID的个体中，KAR亚基和NETO基因内的LoF和破坏性变体丰富。我们对特定候选基因集的观察结果与近期大规模全基因组研究以及对患有精神分裂症和患有ID的精神分裂症患者的外显子组研究一致，这些研究报告超稀有编码和特征为错义和LoF变异体耗尽基因的常见变异体负担增加9，48。同样，我们的研究结果提供进一步的支持，除了稀有从头作为一个强大的致病因素变化对自闭症5，49，遗传的LoF和破坏性突变可能会给自闭症和ID带来风险。我们还确认证据表明，SCZ，ASD和ID的表型的遗传共享诱发因素和神经病理学50，51，52与内等位基因频率和效果大小的光谱，并且变体GRIK和NETO基因有助于这些表型。

我们在涉及特定功能的KAR亚基的关键蛋白结构域中确定了LoF和破坏性错义变体。发现大多数显着相关的复制等位基因具有保护性，例如GRIK3 S310A，并且是未来遗传研究的新靶标。我们的电生理结果支持LBD和TMD突变体都改变通道门控行为的想法。但是，变体也可能通过多种替代方式影响KAR功能。例如，KAR和NETO相互作用的破坏可影响卡尔斯突触本地化53，54。同样，KAR CTD改变可能抑制N-钙黏着蛋白相互作用，从而影响突触的分隔和KAR募集到膜上55和破坏C末端PDZ配体结合的突变可能影响分泌途径，反馈系统和神经元活动20。这些突触人口和亚细胞的特定过程突显了KAR亚基可用性的重要性，以及变体，无论是编码还是通过表观遗传机制起作用，如何影响KAR时空模式，这些模式可能导致谷氨酸神经传递的下游改变。

与许多NGS研究一样，该研究的局限性在于基因组覆盖率取决于读取深度和测序质量。由于在人群中并未统一调用几种UTR调控变异体，因此我们的结果可能错过了导致疾病风险的重要KAR和NETOs等位基因。举例来说，我们排除的3'UTR内的插入缺失GRIK4这是我们以前报道赋予保护，防止通过变更GluK4 RNA和蛋白质丰富的开发躁郁症36，37。此外，GRIK4和GRIK3中未评估的内含子变体还显示出与响应于抗抑郁和抗精神病药物显著协会42，56，57，58。

精神分裂症患者个人的病例对照GWAS研究最近表示常见等位基因的成绩单中C4基因编码一种补体成分4蛋白和SNAP25，囊泡融合蛋白，有助于疾病的风险59，60。既SNAP25和第二补体级联蛋白家族的成员（C1ql2和C1ql3）位于突触后的网站和结合KAR亚基和由此调节KAR离子通道行为61，62。对这种新兴的遗传风险途径的进一步探索可能有助于开发针对神经发育状况的新药。根据我们的发现，以及需要从遗传风险因素进行翻译以明确治疗反应和疾病预后的生物标志物的需求，未来的研究将使用大量具有表型，基因组，医学和药物数据的人群（例如，英国生物库和美国“全部”美国研究计划”）应包括KAR和NETO风险等位基因的详细表征。

在UK10K测序项目中，对具有神经发育障碍临床诊断的个体进行了外显子组测序，作为神经发育集合的一部分（补充表S1中提供了更多详细信息   ）。UK10K财团委员会先前已获得所有参与者和/或其法定监护人的基因组研究伦理批准和知情同意。UK10K项目是根据赫尔辛基宣言中的道德原则声明进行的。根据UK10K项目访问协议ID5574，授予了Knight博士访问测序数据集的权限。测序的所有个体均为欧洲血统。

在第一个发现阶段，我们检查了大约846名精神分裂症或精神病患者，550例ASD患者，124例智力残疾患者以及双重诊断患有ID（77）或ID（175）合并精神病的人（图   1）。由于排除了不同KAR / NETO基因中不良的测序数据，评估的数量有所不同。在第二个发现阶段，研究了另外两个精神分裂症队列（NEURO UKSCZ N = 553； NEURO FSZNK N = 285）。人口控制来自UK10K项目的人口控制部门（TwinsUK10K，肥胖UK10K； N = 2,095）。在研究的后续阶段，我们尝试通过首先将病例发现队列中鉴定出的变体的MAF与针对ExAC普通人群报道的MAF（N = 45,376）进行比较，来复制等位基因关联。随后，我们比较了ExAC队列的精神科（N = 15,328）和非精神科（N = 45,376）感兴趣的等位基因。

变体调用文件（VCF）从欧洲基因组-现象库中获得。可从ExAC网站获得ExAC非精神科的VCF文件。基因型组织表达计划用于鉴定在大脑中表达的主要转录本，并检查了大脑表达和规范转录本（补充表   S2））。至少12倍的读取深度被接受为质量控制。使用snpEff，snpSift和dbNSFP进行了编码变体的功能注释。变体分类为：LoF变体（停止获得，移码和破坏剪接的变体）；错义 和调控（同外显子周围的10 bp以内的同义，无损伤的剪接位点变体和3'UTR或5'UTR变体）。使用LoF转录效果估算器（LOFTEE，版本0.2）进行LoF注释。突变体测试仪，Panther DB，Align GVGD和PolyPhen2用于预测错义突变是否有害。使用人类剪接仪（HSF 3.0）评估剪接效果。计算发现阶段发现的变异的次要等位基因频率（MAF），并将其与衍生自一般人群数据库（例如GnoMAD）的MAF进行比较。

使用Fisher精确检验或卡方检验进行单等位基因关联分析，并带有两条尾。使用Holm-Bonferroni方法调整P值进行校正，并将显着性设置为两个级别；全基因组水平（p  <5×10 -8）和较不保守的名义水平（p  <1×10 -6）。使用R软件（v.3.4.1）计算赔率（OR）和置信区间值。实施了核心方法SKAT和SKAT-O，以鉴定携带大量常见，罕见和罕见破坏性变体的基因63。使用IMPUTE2软件64进行缺失野生型基因型的插入。用于计算机蛋白质建模的结构模板是从结构生物信息学研究合作社（RCSB）蛋白质数据库中获取的，或者是使用RaptorX软件65从Uniprot氨基酸序列生成的。更多详细信息，请参见补充表   S3。使用Pymol（PyMOL版本2.0，Schrödinger，LLC）的诱变功能进行计算机诱变，并在野生型和突变结构中检查了8 A内的预测氢键。使用FoldX v3.0 66进行自由能计算（ΔG）。自适应Poisson-Boltzmann求解器（APBS）软件包用于研究突变蛋白67中静电表面电势中的表面电势变化。

野生型和突变型KARs（GluK2 K525E，GluK4 Y555N和GluK4 L825W）使用上述方法在非洲爪蟾卵母细胞中表达68。爪蟾卵母细胞由欧洲爪蟾提供为卵巢小叶英国朴次茅斯大学资源中心。动物护理和治疗均按照国家和国际法律和政策进行。根据诺丁汉大学的机构指南和规定进行了电生理研究方案。GluK2和GluK4的人cDNA克隆获自GenScript（USA）。使用QuikChange II诱变试剂盒（Agilent Technologies）将突变引入构建体，并使用mMessage mMachine试剂盒（Invitrogen）生成cRNA。向卵母细胞注射50.6 nL cRNA（250–300 ng /μL），并在GTP溶液中孵育。卵母细胞以10 mL / min的速度注入青蛙林格氏液，并以-80 mV的电压固定两电极（Geneclamp 500，Axon Instruments）。以10 mL / min的流速在10至10之间的浓度下灌注谷氨酸-9  M和10 -3  M持续10 s。将峰值电流幅度归一化并相对于谷氨酸浓度作图以确定EC 50。通过拟合指数方程，估算了10 s谷氨酸施用期间的电流衰减时间常数（τ）。实验在多个单元（n≥5）中进行。

由于根据UK10K项目访问协议ID5574授予了Knight博士访问权，因此当前研究期间生成和/或分析的数据集无法公开获得，但是有关确定的变体的更多信息可应合理的要求从相应的作者处获得。