摘要
心脏通常会因病理性应激而经历不良重塑和肥大生长。MiRNA可以调节心脏功能并参与心脏肥大的调节。本研究旨在确定miR-296-5p在心脏肥大中的作用以及肥大级联反应中的潜在机制。通过横向主动脉缩窄（TAC）建立具有心脏肥大的小鼠。血管紧张素II诱导心肌细胞的心肌肥大。在miRNA转染的心肌细胞中检查了miR-296-5p及其靶基因CACNG6的表达。在TAC手术小鼠中，miR-296-5p的表达上调。miR-296-5p的抑制作用在体外和体内均可减轻心脏肥大。双荧光素酶报告基因检测结果表明，CACNG6是miR-296-5p的直接靶标，调节钙信号的表达。通过靶向CACNG6，发现MiR-296-5p加剧了心肌肥大，这表明抑制miR-296-5p可能具有抑制心脏肥大和心力衰竭的临床潜力。
心脏通常会因病理性应激而发生不良重塑和肥大生长[ 1 ]。肥大是一个过程，其特征是心肌细胞的大小增加而细胞数量未改变[ 2 ]。长时间的心脏肥大是心力衰竭和猝死的原因之一[ 3]。建议将控制心脏发育的分子事件重新部署以控制肥大性生长。心脏肥大总是参与心脏胎儿基因的改变，例如脑钠尿肽（BNP），β肌球蛋白重链（β-MHC）以及其他编码心钠素的基因。除了胎儿基因的上调外，病理性肥大还与纤维化增加和心脏功能障碍减少有关[ 4 ]。但是，心脏肥大的分子机制尚不完全清楚。
微小RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA，可以使信使RNA（mRNA）处于部分互补的结合位点，从而通过改变目标mRNA的稳定性来调节蛋白质的合成速率[ 5 ]。它们可以负调控转录后基因的表达。越来越多的证据表明，miRNA参与细胞分化，凋亡，发育和增殖的调控[ 6 ]。miRNA可调节心脏功能包括电信号传导，心肌收缩，心脏生长和形态发生[ 7，8，9]。他们还可以参与心脏肥大的调节。但是，miRNA在心脏肥大和重塑中的作用尚不清楚。
越来越多的证据表明miR-212 / 132，miR-22，miR-208a，miR-27b和miR-378与心脏肥大的发展有关。遗传研究已经揭示了miR-296-5p已涉及胶质母细胞瘤，肺癌和其他恶性肿瘤[进展10，11，12 ]。在心血管疾病中，衰竭心脏的微阵列分析显示，在小鼠衰竭心脏的第5天和第28天，miR-296-5p均上调[ 13 ]。
我们的研究先前已检测到miR-296-5p在心脏肥大中的表达。在具有横向主动脉缩窄（TAC）引起的心脏肥大的小鼠中它被上调。因此，有必要进一步研究miR-296-5p在心脏肥大中的功能，以更好地了解心脏稳态的调节。在本研究中，我们旨在阐明miR-296-5p在心脏肥大中的作用，因此，有必要确定miR-296-5p在心脏肥大中的潜在调控作用及其潜在机制。
对从北京生命河实验动物中心获得的雄性C57BL / 6小鼠进行TAC程序。用异氟烷麻醉60只体重25–30 g（8周）的小鼠，并进行开胸手术。解剖主动脉并用26号针头将7-0丝线绑在血管周围，以确保一致的闭塞。假手术组的小鼠进行了开胸手术和主动脉解剖，而没有主动脉狭窄。确认TAC可以显着增加心脏重量与胫骨长度之比（HW / TL）和超声心动图的变化。由于出血并发症，TAC手术后约有2％的小鼠无法存活。所有动物程序均按照首都医科大学动物护理和使用委员会的指导进行。
从新生C57BL6小鼠（1-2天大）的心脏中分离出新生小鼠心肌细胞。开胸后，心脏突然跳出，并迅速切除。分离心室并转移至无Ca 2+和Mg 2+的冷汉克平衡盐溶液（HBSS）中（Gibco，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚）。将组织在37°C的一系列孵育中分散在含有1.2 mg / ml胰酶和0.14 mg / ml胶原酶的HBSS中。离心后，将细胞重悬于含有10％胎牛血清（Gibco）并补充有抗生素（青霉素，链霉素； Gibco）的Dulbecco改良的Eagle培养基（Gibco）中。将细胞在37°C的95％空气和5％CO 2的潮湿气氛中培养。为了进行实验，将细胞以每孔2×10 5个细胞的密度接种在六孔板中。培养24小时后，用2×10 5病毒颗粒/ mL的ad-anti-miR-296-5p和ad-si-NC（GenePharma）转导细胞。转导后12h，用血清代替培养物在1μM血管紧张素II（ang II，Sigma，USA）中再培养48小时。
根据Trizol（Invitrogen）的说明，从心脏组织或心肌细胞培养物中提取总RNA。使用超微分光光度计（NanoDrop，Thermo，美国）检测RNA的浓度和纯度。为了进行逆转录，将RNA样品逆转录为cDNA，总系统为20μl。在25°C下进行5分钟逆转录，在50°C下进行45分钟，然后在85°C下灭活逆转录酶5分钟。将cDNA合成和通过qRT-PCR分析，并定量RT-PCR法进行参照SYBR的指令®Premix Ex Taq™II试剂盒（中国大连，塔卡拉）。将靶基因的mRNA水平标准化为β-肌动蛋白基因。使用2- ΔΔCt方法通过实时定量RT-PCR测定血管紧张素II处理的心肌细胞中ANP，BNP和β-MHC的基因表达水平。在ad-anti-miR-296-5p转染的心肌细胞中也检测到CACNG6的mRNA表达。通过三个独立实验的六次重复分析来分析mRNA的表达水平。
TargetScan用于预测miR-296-5p的潜在靶标。然后进行荧光素酶测定以进一步证实心肌细胞中miR-296-5p和CACNG6的关系。CACNG6 3'-UTR过量表达的载体购自GenePharma。在miR-296-5p模拟物或对照miRNA模拟物存在的情况下，用海肾荧光素酶基因下游的CACNG6的全长3'-UTR转染HEK293细胞，并与pGL3-基本控制质粒（萤火虫荧光素酶）共转染产生pGL3-basic-CACNG6 3'-UTR-WT。构建了CACNG6 3'-UTR的种子序列转化突变版本，称为pGL3-basic-CACNG6 3'-UTRMut，作为对照。转染后二十四小时，收集细胞裂解液，然后依次用于荧光素酶活性的检测。
将小鼠随机分为不同的组。在TAC手术（3.5×10 7病毒颗粒）的心脏注射1次，在小鼠体内进行ad-anti-miR-296-5p或ad-anti-NC的转导。两名熟练的技术人员不知道分组并进行注射。4周后，收集心脏，将左心室在液氮中快速冷冻，并保存在-80°C下进行后续实验。
使用带40 MHz换能器的Visualsonics Vevo 2100（Visualsonics）超声系统进行超声心动图检查。测量左心室收缩末期直径（LVESD）和左心室舒张末期压力（LVEDP）。根据系统计算左心室缩短分数（LVFS）和左心室射血分数（LVEF）的百分比。从至少三个心动周期分析参数。从每组六只小鼠收集数据。
用于免疫染色的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，并用0.5％Triton X-100透化15分钟，然后用3％BSA封闭30分钟。将细胞与所示的第一抗体（α-SMA，Abcam，剑桥，英国）在4°C孵育过夜。清洗三遍后，将印迹与Alexa Fluor标记的二抗（Invitrogen，CA，USA）孵育2小时，然后再进行DAPI染色10分钟（日本奥林巴斯）。
TAC后第4周从小鼠采集心脏样品。将样品用4％多聚甲醛固定并包埋在石蜡中，切成5微米厚的切片，并按照说明用苏木精和曙红染色。
将样品在含EDTA的无蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的RIPA裂解缓冲液中在冰上裂解30分钟，然后在4°C下以12,000×g离心15分钟。收集上清液并保存在-80°C。根据制造商的规程，使用BCA蛋白质检测试剂盒（Beyotime）测量蛋白质浓度。对组织或细胞提取物进行SDS-PAGE和Western blot分析。将PVDF膜上印迹的蛋白质与以下一级抗体在4°C下孵育过夜：CACNG6（abcam; 1：1000，ab30966），p-PLN（abcam，1：2000，ab15000），PLN（abcam，1：2000， ab2865），RyR2（abcam，1：2000，ab2868），SERCA2（abcam; 1：2000，ab2861），β-肌动蛋白（Sigma，1：1000，A3854）。使用了驴抗小鼠（1：5000）或山羊抗兔（1：5000）二抗（BBI life science D110085，D110058）。使用化学发光成像系统（Tannon）可视化蛋白质条带。从三个生物学重复中分析印迹。
所有数据均表示为至少三个重复的单独实验的平均值±标准差（SD），并使用GraphPad Prism™版本5.00软件（GraphPad，拉荷亚，加利福尼亚州，美国）进行了分析。然后使用不成对的两尾学生t检验（两组）确定统计学显着性。P <0.05的值被认为具有统计学意义。
在用血管紧张素II治疗的心肌细胞中也证实了这种现象。在经过ang II处理的心肌细胞中，它显示出比正常细胞更大的大小（图 1a）。总是使用ANP，BNP和β-MHC的水平来评估心肌肥大的程度，在Ang II治疗组中发现它们的水平升高（图 1b）。HE染色显示，TAC治疗的心脏明显大于假手术组（图 1c）。此外，用超声系统评估了包括LVEDP，LVFS，LVEF，LVESD在内的小鼠的超声心动图参数，这进一步表明接受TAC的小鼠的心脏功能受损（图 1d，e）。为了检测miR-296-5p在患有心肌肥大的小鼠心脏组织中的表达水平，我们使用TaqMan定量PCR测量了患有心肌肥大和假手术的小鼠左心室组织中miR-296-5p的表达水平。与假手术相比，心肌肥大的心肌中MiR-296-5p表达上调，而假手术与HW / TL之比一致（图 1f，g）。类似地，与正常细胞相比，经ang II处理的心肌细胞中miR-296-5p表达上调（图 1h）。
MiR-296-5p分别在接受Ang II和TAC处理的心肌细胞和心肌中上调。使用 α-SMA免疫染色来评估是否接受Ang II治疗的心肌细胞大小。b使用qPCR检测心肌肥大生物标志物ANP，BNP和β-MHC的水平。c在假手术和TAC治疗下心脏的苏木精和曙红染色。d，Ë超声心动图小鼠包括LVEDP，LVFS，LVEF，LVESD的参数与超声系统进行评价。f量化心脏重量与胫骨长度之比。g，h用qPCR检测miR-296-5p的表达。* p 与对照组或假组相比，<0.05。
为了鉴定对miR-296-5p的抑制是否能保护心肌细胞免受刺激诱导的肥大，用含有抗miR-296-5p的腺病毒载体转导了心肌细胞。为了检测腺病毒的有效性，我们评估了每组中miR-296-5p的表达，结果表明抗miR-296-5p的腺病毒在体内和体外均显着下调了miR-296-5p的表达。与抗NC组相比具有更高的体外活性（图 2a，b）。响应Ang II，与抗NC组相比，抗miR-296-5p组的平均心肌细胞大小减少，这表明在Ang II刺激下抑制miR-296-5p恢复了心肌表型（图 2d）。）。此外，与抗NC组（图2g）相比，抑制miRNA-296-5p显着降低了ANP，BNP和β-MHC的表达水平， 这与HW / TL的比率（图2h）一致。 。
MiR-296-5p敲低释放了由Ang II和TAC处理诱导的肥大。a，b在分别受到ad-anti-miR-295-5p感染的心肌细胞和心肌中，miR-296-5p分别下调。c在TAC，TAC +抗NC和TAC +抗miR-296-5p处理下心脏的苏木和曙红染色。d使用α-SMA免疫染色分别评估接受Ang II，Ang II +抗NC和Ang II +抗miR-296-5p处理的心肌细胞的大小。e，f用超声系统评估包括LVEDP，LVFS，LVEF，LVESD在内的小鼠的超声心动图参数。G使用qPCR检测心肌肥大生物标志物ANP，BNP和β-MHC的水平。h量化心脏重量与胫骨长度之比。* 与Ang II +抗NC组或TAC +抗NC组相比，p <0.05。
为了阐明miR-296-5p的抑制作用是否可以降低体内心肌肥大，在TAC手术后1周向小鼠的心脏注射了ad-anti-miR-296-5p。预计体重增加会反映出TAC诱发的小鼠心脏肥大，而ad-anti-miR-296-5p治疗小鼠则逆转了这些TAC诱发的变化。与ad-anti-NC组相比，ad-anti-miR-296-5p组在心脏组织学切片中测定的心肌细胞大小显着减少（图 2c）。对于心脏功能，检测到包括LVEDP，LVFS，LVEF，LVESD在内的参数。与ad-anti-NC相比，ad-anti-miR-296-5p组的LVEDP和LVESD显着降低。ad-miR-296-5p组在第4周时LVFS和LVEF显着改善（图 2f））。综上所述，这些结果表明，miR-296-5p的抑制作用可以在体外和体内保护心脏免受心肌肥大的影响。
为了探索miR-296-5p在心肌肥大中的进一步机制，我们使用生物信息学扫描研究了miR-296-5p的潜在靶基因。我们发现CACNG6基因的3'-UTR包含高度保守的miR-296-5p种子序列，这表明CACNG6是miR-296-5p的靶标（图 3a）。为了验证该预测，我们使用TargetScan算法在CACNG6的3'-UTR中检测到了可能的miR-296-5p种子序列，并将野生型和突变型CACNG6的3'-UTR克隆到荧光素酶报道基因系统中。存在miR-296-5p时，与野生型CACNG6 3'-UTR连锁的萤光素酶报告基因的活性降低，而突变型CACNG6的活性未改变（图 3b）。）。为了进一步证实miR-296-5p和CACNG6之间的相关性，我们验证了CACNG6在心肌细胞中的表达。结果表明，在ad-miR-296-5p感染的心肌细胞中，CACNG6的蛋白表达明显降低（图 3c，d）。此外，我们检测了CACNG6的mRNA水平，发现在ad-miR-296-5p感染的心肌细胞中CACNG6的mRNA表达降低了（图 3e）。这些数据一起表明，CACNG6是miR-296-5p的直接靶标。
MiR-296-5p直接靶向小鼠心肌细胞中的CACNG6。a显示了CACNG6 3'-UTR中miR-296-5p位点的结合。b进行荧光素酶活性测定以鉴定CACNG6是否是miR-296-5p的直接靶基因。c，d使用 Western印迹法评估ad-miR-296-5p和ad-anti-miR-296-5p感染后的蛋白表达。È的qPCR使用下的感染来评估RNA表达广告的miR-296-5p和广告抗miR-296-5p。* 与miR-NC组相比p <0.05。
我们通过功能实验进一步评估了CACNG6在心脏肥大中的作用。在心肌细胞中进行了ad-CACNG6感染引起的CACNG6的过表达，以确定其在心肌肥大中的作用。使用QPCR测定法评估CACNG6表达。结果表明，用ad-CACNG6感染后，心肌细胞和心肌中CACNG6水平显着升高（图 4a，b）。与心肌细胞中miR-296-5p敲低的作用一致，CACNG6的过表达部分挽救了心肌肥大的生长。评估心肌细胞大小和肥大基因（包括ANP，BNP和β-MHC）的表达表明，CACNG6的过表达抑制了Ang II治疗诱导的心脏肥大（图 4c–e）。另外，HE染色表明CACNG6的过表达表现出小鼠心脏肥大的减弱（图 4f）。此外，与对照组相比，ad-CACNG6组的LVEDP和LVESD显着降低。与对照组相比，ad-CACNG6组的LVFS和LVEF显着改善（图 4g，h）。
CACNG6过表达释放了由Ang II和TAC处理诱导的肥大。a，b分别在ad-CACNG6感染的心肌细胞和心肌中上调了CACNG6的过度表达。Ç α-SMA的免疫染色来评价心肌进行血管紧张素Ⅱ，血管紧张素II + CACNG6治疗尺寸。d使用qPCR检测心肌肥大生物标志物ANP，BNP和β-MHC的水平。e量化心脏重量与胫骨长度之比。f在TAC，TAC + an-CACNG6处理下心脏的苏木精和曙红染色。克，ħ用超声系统评估包括LVEDP，LVFS，LVEF，LVESD在内的小鼠的超声心动图参数。* p <0.05，与血管紧张素Ⅱ或TAC基，＃p <0.05，与血管紧张素II +控制或TAC +对照组。
研究表明，CACNG6参与电压依赖性钙通道的调节，并且已证实CaMKII调节在心脏肥大中起重要作用。为了研究miR-296-5p的抑制是否通过调节心肌细胞中的CaMKII信号传导来改善心脏功能，通过蛋白质印迹法评估了CaMKII，SERCA2和CaMKII依赖性PLN。感染ad-anti-miR-296-5p后，CACNG6的表达反向恢复。接下来，用ad-anti-miR-296-5p处理，p-PLB，RyR2和SERCA2的表达被上调，而PLB和p-CaMKII的表达则被下调。CaMKII活性过高会导致心脏肥大，因此， 5a，b）。
MiR-296-5p抑制了CACNG6相关蛋白的表达。a，b进行蛋白质印迹分析以评估p-PBL，PBL，SERCA2，NCX1，RyR2，CaMKII，p-CaMKII的表达水平。* p <0.05，与血管紧张素Ⅱ组，＃p <0.05，与血管紧张素II +抗miR + sicontrol基。
为了进一步研究CACNG6与miR-296-5p之间的关系。我们进行了救援实验。使用CACNG6的SiRNA来降低CACNG6的水平，qPCR结果证实该水平是有用的（图 6a）。此后，我们评估心肌细胞的细胞面积。如图6b，c所示 ，siCACNG6逆转了miR-296-5p缺失的作用。随后，检测ANP，BNP和β-MHC的表达水平。我们发现siCACNG6在ANP，BNP和β-MHC的水平上逆转了miR-296-5p敲低的功能（图 6d）。
删除CACNG6可逆转心肌细胞中miR-296-5p敲低的作用。进行 QPCR以评估CACNG6的表达水平。b，c使用α-SMA免疫染色来评估是否接受Ang II治疗的心肌细胞大小。d使用qPCR检测心肌肥大生物标志物ANP，BNP和β-MHC的水平。* p <0.05，与血管紧张素Ⅱ组，＃p <0.05，与血管紧张素II +抗miR + sicontrol基。
的20q13.32基因组区域的扩增已在各种癌症类型的[已发现14，15，16 ]。的miR-296已被归类为血管性的miR，其中的miR-378和miR-17-92相同的基因簇中，沿着由于其肿瘤血管生成[贡献17，18 ]。
响应于暴露于人脑神经胶质瘤细胞，正常人脑内皮细胞中的MiR-296上调。miR-296的下调和上调分别导致与人类内皮细胞血管生成有关的形态学特征的抑制和诱导[ 18 ]。通过调节多种信号通路，包括细胞周期蛋白D1，p27，P-糖蛋白，Bcl-2，MDR1和Bax，miR-296的下调可抑制食管癌细胞的发展[ 19 ]。MiR-296在胃癌，肺腺癌和食道癌的进展中也起着关键作用[ 20]。如在心血管系统中一样，miR-269-5p在肥厚型心肌病患者中被上调。这一发现引起了我们对miR-269-5p在心脏肥大过程中的作用的关注[ 21 ]。
在本研究中，我们发现miR-296-5p的表达水平发生了改变。进一步的体内和体外研究表明，抑制miR-296-5p可显着抑制心脏肥大。此外，miR-296-5p耗竭减轻了TAC引起的心脏功能损害。
miRNA通过与靶向区域结合来调节特定基因的表达水平。我们使用生物信息学分析软件预测了miR-296-5p的潜在靶基因。证实CACNG6是心肌细胞中miR-296-5p的直接靶标。
钙通道，电压依赖性，γ亚基6（CACNG6）基因编码稳定钙通道的蛋白质[ 22 ]。最近的研究表明，CACNG6基因表达与慢性阻塞性肺疾病，损伤后的人气道上皮反应以及肺组织实质有负相关关系[ 23 ]。CACNG6是一种不可或缺的膜蛋白，可在其非活性状态下稳定钙通道[ 24 ]。钙通道功能与多种心血管疾病有关，例如高血压和心脏肥大[ 25]。我们随后评估了几种钙通道蛋白的表达水平。结果表明，CACNG6参与了SERCA2，NCX1，RyR2的调控，以及PLB和CAMKLII的磷酸化。但是，下游的潜在机制仍不清楚，哪些需要进一步探讨。
通过靶向CACNG6，发现MiR-296-5p加剧了心肌肥大，这表明抑制miR-296-5p可能具有抑制心脏肥大和心力衰竭的临床潜力。在本研究中，我们首先探讨了miR-296-5p在肥大中的作用。此外，我们研究了miR-296-5p的直接靶基因CACNG6的作用。我们的发现提示了新型生物标志物或肥大的潜在治疗靶标。同时，应在时间表中列出更多的研究内容。
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