摘要
Toll样受体TLR5识别一个称为D1的保守结构域，该结构域存在于几种致病细菌的鞭毛蛋白中，而在幽门螺杆菌中则不存在。高毒力幽门螺杆菌菌株具有IV型分泌系统（T4SS），可将毒力因子输送到胃上皮细胞中。在这里，我们显示幽门螺杆菌 T4SS组件之一，蛋白CagL，可以充当不依赖鞭毛蛋白的TLR5激活剂。CagL包含一个D1样基序，可介导对TLR5 +上皮细胞的粘附，TLR5激活和体外下游信号传导。TLR5表达与幽门螺杆菌感染和人类活组织检查中的胃部病变有关。使用Tlr5-knockout和野生型小鼠，我们表明TLR5对于有效控制幽门螺杆菌感染很重要。我们的结果表明，CagL通过激活TLR5可以调节对幽门螺杆菌的免疫反应。
幽门螺杆菌是一种持久的范例定植病原体对人类世界人口的50％，代表了慢性胃炎，消化性溃疡和胃恶性肿瘤的重要危险因素，而控制感染和疾病发展的宿主因素仍不清楚1，2。Toll样受体（TLR）是先天性免疫受体用于检测入侵的微生物的3，4，5。TLR5特异性检测沙门氏菌，弧菌和其他人类致病物种表达的细菌鞭毛蛋白中存在的保守基序，称为αD1a 。相反，幽门螺杆菌已经进化获取的特定突变在其鞭毛蛋白FLAA的D1相互作用结构域逃避TLR5通过免疫检测而不会损害鞭毛运动6，7。高毒力的幽门螺杆菌菌株具有细胞毒素相关基因致病岛（cag PAI），该岛编码IV型分泌系统（T4SS），形成了注射器样菌毛结构，可将诸如CagA和LPS代谢物的毒力因子转运到胃中上皮细胞8，9，10。T4SS菌毛暴露蛋白CagL需要建立宿主细胞接触并驱动效应子传递11。TLR5在感染期间的作用幽门螺杆菌已多次排除由于其鞭毛蛋白的低固有活性6，7，12，13，14。但是，我们以前曾报道过，幽门螺杆菌感染上调了上皮细胞和免疫细胞的TLR5表达15。这就提出了细菌因子激活TLR5的问题。
所述T4SS提供多重因素对宿主细胞质，其随之而来的疾病形成和进展不同细胞信号8，9，10。在这里，我们显示T4SS菌毛尖端蛋白CagL对于以TLR5依赖性方式激活NF-κB是必需的。来自全球各地的各种幽门螺杆菌菌株的CagL序列都带有D1样的基序，这表明TLR5信号传导和NF-κB激活是必需的。另外，使用人胃活检和小鼠模型的分析表明，TLR5激活和信号传导可能对幽门螺杆菌感染和相关的免疫反应很重要。
为了检查该细菌因子在幽门螺杆菌激活TLR5，我们利用建立了与TLR5（TLR5稳定转染的HEK293报道细胞+），并且另外表达对促炎转录因子NF-κB荧光素酶报告7，12，13，14，15。该系统还具有的优点是，相关蛋白和LPS代谢产物不能被易位到HEK293细胞15，16。因此，理想情况下，监视这些细胞中的TLR5激活不受其他T4SS功能的影响。TLR5激活在8小时内持续增加，并取决于感染的多重性（补充图 1）。）。与亲本对照相比，高毒性cag PAI阳性临床分离株在TLR5 +细胞中特异性激活NF-κB，而缺乏cag PAI的分离株仅显示背景NF-κB激活（图 1a，b）。观察到各种菌株感染后TLR5激活没有任何延迟。这些发现表明，TLR5激活需要T4SS。接下来，我们用野生型（WT）幽门螺杆菌和知名毒力基因的同基因突变体感染了TLR5 +和亲代细胞。vacA，ureB，flaA和cagA的失活并未消除TLR5的激活，而cagL的丧失各种结构性T4SS基因的α1和β4消除了TLR5的激活（图 1c，d和补充图 2和3）。值得注意的是，cag PAI 对TLR5的激活与重组沙门氏菌鞭毛蛋白（rFliC）的激活一样强（图 1d，补充图 4）。作为另一个对照，HEK293-TLR4 +报告细胞的感染显示了非T4SS依赖性的NF-κB激活，而FliC则没有激活（补充图 5）。）。为了鉴定TLR5的细菌结合伴侣，将细胞感染或用rFliC处理，并使用TLR5特异性抗体进行免疫沉淀。等量的TLR5沉淀（图 1e）。对印迹的重新探测揭示了CagL的强大信号，但其他cag PAI蛋白则没有（图 1e）。不出所料，rFliC也被共沉淀，而FlaA Hp没有（图 1e）。这表明CagL与完整感染的上皮细胞上的TLR5发生物理相互作用。
一个 幽门螺杆菌 I型，但不是类型II菌株，表达功能T4SS允许在受感染的AGS细胞作为对照相关蛋白磷酸化。b通过NF-κB荧光素酶报告基因检测定量的TLR5激活仅限于HEK报告细胞中的I型分离株。c CagA递送及其在AGS细胞中的磷酸化需要功能性cagL 和cagA，但不需要vacA，ureB和 flaA基因。d HEK293细胞中的TLR5激活需要功能性cagL。沙门氏菌的重组鞭毛蛋白（rFliC）用作阳性对照。Ë通过用α-TLR5抗体进行免疫沉淀确定，CagL和rFliC与TLR5 +细胞上的TLR5相互作用。定量数据显示为平均值±SD。**** p <0.0001（单向方差分析）。每个红点代表一个数据点。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们使用活细胞成像17监测了荧光标记细菌与TLR5的相互作用。亲代细胞的感染揭示了WT 幽门螺杆菌和ΔcagL突变体的低荧光信号和低结合亲和力。相反，WT而不是ΔcagL突变细菌牢固地附着于TLR5 +细胞（图 2a）。这些数据表明，TLR5的表达允许幽门螺杆菌有效附着于TLR5 +细胞，而CagL充当细菌表面上的TLR5配体。细胞结合测定证实了这一点18在时间过程中，表明与ΔcagL突变体相比，有效连接WT需要TLR5表达（补充图 6）。为了研究哪些CagL-基序与TLR5相互作用，我们进行了肽阵列19。为此，将覆盖CagL序列的重叠的15聚体肽点在膜上，并用重组TLR5（rTLR5）探测（补充图 7和8）。有趣的是，rTLR5与阵列肽No.5牢固结合。20（图 2b）。对该肽序列（DLALLKANFEANELF）的数据库搜索显示，在CagL中，来自世界各地不同地区的分离株均具有非凡的保守性（补充图 9）。），并且与来自弧菌，爱德华氏菌，沙雷氏菌和沙门氏菌（特别是8个残基的“ DLALLKAN”序列，代表TLR5激活基序）的TLR5激活鞭毛蛋白的αD1a结构域高度相似。相比之下，空肠弯曲杆菌和芽孢Bartonella bacilliformis的 FlaA Hp和其他TLR5非活化鞭毛蛋白则不存在这种基序（图 2c）。沙门氏菌 FliC与TLR5 之间复杂晶体结构的结构检查表明，相应的鞭毛蛋白序列片段与TLR5直接相互作用（补充图 10a，b）。如前所述如图13所示，该片段含有一个亮氨酸残基，其在各种TLR5激活鞭毛蛋白和CagL（L79）中高度保守，但在非激活鞭毛蛋白中不存在（图 2c）。该亮氨酸与TLR5的F278形成疏水相互作用（补充图 10c），而在FlaA Hp中观察到的赖氨酸（K95）的存在会在疏水性F278侧链附近带正电荷（补充图 10d）。），从而导致不利的互动并取消了TLR5激活。这些结果表明幽门螺杆菌避免了通过TLR5检测到其FlaA，而是表达了T4SS蛋白CagL以促进TLR5的结合和活化。
一个结合FITC标记的幽门螺杆菌 G27 WT或Δ CAGL突变体亲本和TLR5 +细胞，如使用活细胞的条件下LigandTracer系统随时间监测。b将重叠的CagL 15-mer肽的肽阵列与重组His-tagged TLR5一起孵育。用α-His抗体探测表明TLR5与肽20结合，但未发现部分重叠的肽19或-21。c CagL的20肽序列与激活TLR5的鞭毛蛋白αD1a结构域具有同源性，但与TLR5非激活的鞭毛蛋白则无同源性。定量数据显示为平均值±SD。** p <0.01；*** p <0.001（双向方差分析）。源数据作为源数据文件提供。
为了验证这些发现并确认CagL在TLR5识别中的关键作用，我们将CagL中提议的TLR5激活基序（DLALLKAN）替换为FlaA Hp的相应序列（VKATQAAQ，一个非TLR5激活基序）（图 3a））分别在cag PAI阳性菌株P12或cag PAI阴性菌株1061中。感染HEK293细胞后，发现ΔcagL突变体与WT CagL互补可恢复TLR5激活，而CagL缺失DLALLKAN-motif或CagL则不是这种情况，其中原始序列已被FlaA Hp序列VKATQAAQ（图 3b）。WT FlaA Hp的遗传互补没有如预期的那样激活TLR5，但是在FlaA Hp中引入CagL的DLALLKAN序列恢复了其激活TLR5的潜力（图 3b）。另外，我们在包括L79A，L81A或N85A在内的CagL DLALLKAN基序的进化保守残基中产生了点突变（补充图 11）。使用Dotblots对这些蛋白质进行结合测定。结果表明，WT CagL和rFliC以及相应的含D1-基序的FliC肽（ELAVQSANSTNSQSD）与rTLR5高效结合（图 3c）。CagL中的单个L79突变对rTLR5结合的影响最强，而L81A或N85A显示出中等水平，而在L81A / N85A双重突变体中则被取消了（图 3c）。）。这些结合特性与其以rFliC作为对照（补充图 12）以剂量依赖的方式激活TLR5 +细胞中NF-κB的能力密切相关（图 3d）。在一起，这些结果表明，CagL模仿鞭毛蛋白的TLR5激活基序。rFliC对CagL-TLR5结合的竞争性抑制进一步支持了该假设，表明CagL和FliC在TLR5中竞争相同的结合位点（补充图 13）。有趣的是，沙门氏菌 FliC 激活TLR5 涉及除D1之外的另一个域，称为D0（参考文献12），但是，CagL中不存在这种域。因此，CagL代表独特的TLR5激活蛋白。
一个 CAGL和FLAA的示意图幽门螺杆菌产生通过缺失或αD1a基序的交换。b将 TLR5 + HEK293细胞感染表达A所示构建体的幽门螺杆菌菌株，然后定量NF-κB活性。c蛋白结合测定。将指定的重组CagL蛋白，FliC蛋白和FliC肽作为对照固定在Dotblots上，然后与重组TLR5孵育。CagL D1母题中的定点诱变揭示了它在TLR5结合中的重要性，如光密度法定量的。d TLR5 +中NF-κB活性的剂量反应曲线和指示量的CagL蛋白处理的亲代细胞。通过使用AAT Bioquest（https://www.aatbio.com）将WT CagL的EC 50值确定为172.6 nM 。CagL D1-基序中的突变确认其在TLR5激活中的功能。如所示，CagL WT值在所有突变体上均显着。定量数据显示为平均值±SD。**** p <0.0001（单向方差分析）。每个红点代表一个数据点。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们通过免疫组织化学检查上述发现是否与患者体内相关。值得注意的是，尽管来自健康未感染者的活检标本未显示TLR5染色（图 4a），但感染后TLR5信号出现，并随着幽门螺杆菌定植的程度和胃黏膜炎症的严重程度逐渐增加（如更新）。悉尼系统20（图 4b，c）。TLR5 +信号主要在固有层内的上皮细胞，浆细胞和粒细胞中检测到，而杯状细胞未染色（补充图 14）。相反，幽门螺杆菌的治疗在成功根除后的6-8周，使用抗生素将胃黏膜中TLR5表达下调至未感染个体中检测到的水平（图 4d）。免疫反应评分21证实TLR5被感染明显诱导，并且与患者的炎症相吻合（图 4e）。接下来，我们试图检查TLR5对小鼠幽门螺杆菌特异性免疫的功能性贡献。为此，我们用菌株PMSS1 感染了tlr5的tlr5缺陷小鼠BL3小鼠感染了三个月，并在研究终点分析了细菌定植水平，胃粘膜白细胞浸润和病理以及胃和淋巴结T细胞反应。Tlr5-/-动物在控制感染方面表现出明显的缺陷（图 4f），这与胃粘膜中的Th1反应强烈降低有关（图 4g；补充图 15b）。有趣的是，在这些动物中，T细胞和中性粒细胞的胃频率以及Th17和Th1 / Th17混合T细胞反应正常或增强（图 4h-j；补充图 15a，b），Th1也是如此。和肠系膜淋巴结中的Th17频率（图 4k，1；补充图 15b）。最新的悉尼系统对整个炎症和胃部病理进行了评分20与野生型动物相比，tlr5 -/-分别类似于和略微降低（图 4m，n）。相对于WT动物，在幼稚的tlr5 -/-中未观察到T细胞或嗜中性粒细胞频率（图 4i，j；补充图 15a，16a，b）或胃组织病理学（数据未显示）的差异。有趣的是，用PMSS1ΔcagL突变体对WT小鼠进行慢性感染表型复制了TLR5缺乏症对胃Th1反应的影响（图 4o，p，补充图 15b）。该突变体的定殖略有减少，但没有明显减少（补充图。 16c）。合并的结果表明，通过TLR5 检测CagL阳性幽门螺杆菌是产生或维持对该感染的局部适应性免疫反应的重要因素，而TLR5的缺失会导致超殖民化。因此，TLR5缺乏症表型化了整个T4SS的基因失活的影响。
a – d患者胃活检中TLR5表达的免疫组织化学。比例尺：200 µm。未感染的胃粘膜（a）既不显示病理变化也不显示TLR5阳性细胞，而具有中度慢性，轻度活跃的胃炎和中度幽门螺杆菌定植的胃粘膜（b）则显示表面上皮的胞质和核TLR5染色以及胞浆染色浆细胞。c在明显的幽门螺杆菌存在下，具有慢性中度活跃性胃炎的胃黏膜带有基底淋巴滤泡的定植和轻微的肠化生以及轻微的腺体萎缩显示上皮细胞质和细胞核TLR5染色强烈，浆细胞胞浆染色。d接受根除细菌治疗的胃炎患者的胃粘膜。TLR5的表达降低到未感染的对照水平。e）患者中TLR5染色的免疫反应评分（IRS）定量。* p ≤0.05; **** p <0.0001（单向方差分析）。f – n tlr5 -/-和野生型（WT）小鼠感染了幽门螺杆菌 3个月（+ Hp 3个月）。F通过铺板和菌落计数确定细菌定植。通过流式细胞术确定的胃固有层CD4 + TCRα/β + T细胞中IFN-γ +，h IL-17 +以及表达两种细胞因子的细胞的g频率。i，j所有CD45 +白细胞中固有层CD4 + T细胞和Ly6G +中性粒细胞的频率。ķ，升 IFN-γ的频率+和IL-17 +中细胞所有MLN CD4 + TCRα/β +T细胞。m，n根据最新的悉尼分类对每只小鼠的两个吉姆萨染色切片，以0–6的评分对胃炎症和增生进行了评分。○，p WT小鼠感染了幽门螺杆菌 PMSS1 WT或其CagL缺陷型突变体三个月。通过流式细胞术确定的胃固有层CD4 + TCRα/β + T细胞中IFN-γ +和IL-17 +细胞的频率。非参数Mann-Whitney U检验用于所有统计比较（f – p）；* p <0.05；**p <0.01；*** p ＜0.001。源数据作为源数据文件提供。
最后，我们旨在研究TLR5信号在启动先天性和适应性免疫应答中的作用。TLR5的基因表达谱+和亲代细胞暴露于幽门螺杆菌或不通过微阵列进行的和显露的肿瘤坏死因子（TNF）和NF-κB依赖型趋化因子应答中TLR5的显著上调+相比，亲代细胞（补充图 17和18；补充表 1和2）。特别地，感染后差异表达了几种趋化因子和细胞因子（CCL2，CCL20，CXCL1，CXCL10，IL-32，IL-17F等）。有趣的是，以前报道CCL20是由沙门氏菌鞭毛蛋白，但不是由LPS或肠道菌群，对于未成熟树突状细胞，其然后引发先天免疫和适应性免疫的招募22，23。我们通过ELISA证实，通过与rCagL或rFliC共同孵育并感染WT 幽门螺杆菌，但不感染ΔcagL突变体，HEK293报告细胞和表达内源性TLR5的培养T84细胞也以TLR5依赖性方式受到刺激。补充图 19）。另外，在我们的微阵列中，受感染的TLR5 +细胞差异表达CXCL10 。
最近，有报道说鞭毛蛋白具有保护性的粘膜作用，并且鞭毛蛋白可诱导CXCL10和重组CXCL10保护小鼠免受白色念珠菌感染24。此外，CXCL10表达也被表达鞭毛蛋白25的工程化抗肿瘤T细胞诱导。此外，幽门螺杆菌以TLR5依赖性方式诱导CCL2 。这是特别令人感兴趣的为功能CCL2 / CCR2轴，驱动单核细胞和巨噬细胞的募集到被感染粘膜，需要的Th1免疫力幽门螺杆菌26。CCR2表型的丧失反映了TLR5缺乏症的所有方面（过度克隆，Th1反应降低但Th17反应正常），这表明TLR5信号在胃上皮细胞中的一个关键后果可能是这些细胞的募集和随后的保护性启动。 T细胞反应（参见图5a中的模型 ）。我们建议幽门螺杆菌触发TLR5信号，以消除在细菌生态位中的细菌竞争者。这些发现对很好TLR2的作用，补充先前的工作（参考文献27，28），TLR9（参见29）和TLR10（注释28，30时），幽门螺旋杆菌感染。无反应的鞭毛蛋白和从TLR5到CagL的识别转移表明，在幽门螺杆菌与宿主相互作用的过程中，这些重要因素的显着共同进化。我们建议这种转变赋予幽门螺杆菌独特的能力，分别通过暴露或隐藏CagL来避免永久性TLR5激活（图 5b，c），这与早期观察到的菌毛功能可以开启和关闭有关T4SS蛋白质编码基因的重组8。长期感染CagL阳性菌株而不是CagL阴性菌株的后果之一是严重后遗症，尤其是消化性溃疡疾病和胃癌的可能性大大增加。根据cagL和其他cag PAI突变体产生的背景水平，我们还建议至少还有一种靶向TLR5的幽门螺杆菌因子。了解幽门螺杆菌的 TLR5信号传导如何负责细菌的免疫控制，可以使我们对人类生物学的了解与对这些重要感染的发病机理的了解一样。
一个 TLR5是不是在健康的胃组织中表达。幽门螺杆菌感染在受感染的胃病患者中诱导了TLR5的表达，根除后TLR5消失，表明该受体受到严格调节。这些数据与WT和TLR5 -/-小鼠的感染研究一致，该研究证明TLR5控制免疫反应和幽门螺杆菌定植。幽门螺杆菌的 TLR5识别通过具有D1模拟基序的T4SS菌毛蛋白CagL发生，而避免了鞭毛蛋白的识别。此外，CagL介导的TLR5激活上调了几种趋化因子和细胞因子及其受体的表达。如所示，通过TLR5依赖性和非依赖性信号通路均增加了各种吸引免疫细胞的趋化因子，例如CXCL1，CXCL3，CCL2，CXCL10，CCL20和细胞因子TNF，IL-32和IL-17F。此外，CCL20，TNF和TNF受体（TNFR）的联合表达暗示通过TLR5依赖性信号传导诱导粘膜淋巴样组织形成。来自患者的感染的胃活检显示胃粘膜浆细胞上TLR5的表达增加。幽门螺杆菌感染。各种信号传导参与的蛋白类别以不同的颜色突出显示，如底部所示。b 幽门螺杆菌表达无反应的鞭毛蛋白（“关闭”状态），而是表达T4SS菌毛表面蛋白CagL，当表达T4SS菌毛时可以触发TLR5激活（“开启”状态）。c但是，可以通过在T4SS蛋白8中重组来打开和关闭T4SS菌毛功能。通过将CagL隐藏在T4SS的“ OFF”状态，此转移为幽门螺杆菌提供了避免永久性TLR5激活的独特能力。我们建议，通过参与TLR5，幽门螺杆菌可能能够控制宿主的炎症反应及其自身的定植。
的幽门螺旋杆菌在本研究中使用的菌株包括CAG PAI阳性的野生型（WT）分离物P1，P12，26695，NCTC11637，G27，N6和PMSS1以及所述CAG PAI-负WT分离株1061，Safr7，Ka125和UH4（参考文献11，15，16，17，18，22，27，31，32，33）。等基因突变幽门螺杆菌通过标准基因破坏产生通过使用卡那霉素或氯霉素抗性基因盒，分别插入程序31，32，33，34。使用标准程序 34在染色体上的脲酶基因座中进行了 cagL和 flaA基因的遗传互补。所有幽门螺杆菌菌株在补充万古霉素（10μg/ mL），制霉菌素（1μg/ mL）和甲氧苄啶（5μg/ mL）的马血清琼脂平板上薄层生长，并通过添加卡那霉素（ 8μg/ mL）或氯霉素（4μg/ mL）。所有抗生素均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。在37℃下在含有5％氧气一个Campygen气体混合厌氧罐中进行2天的细菌孵育 2，10％CO 2和85％N 2（奥克斯oid，韦瑟尔，德国）。收获在琼脂平板上生长的幽门螺杆菌，并使用无菌棉签（Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国）将其重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中。使用Eppendorf分光光度计在550nm下以光密度（OD）测量细菌浓度。连续稀释细菌悬浮液后，还用生长在马血清琼脂平板上的菌落形成单位（CFU）交叉检查细菌的数量。在没有抗生素和抗真菌药的培养基中生长的真核细胞用幽门螺杆菌感染，感染复数（MOI）为5到200，持续8小时（补充图 1）。）。使用MOI为25可获得最佳结果，然后将其应用于所有后续研究中。将未感染的模拟对照细胞与等量的PBS孵育。
重组CagL WT和突变体在载体pET28a（Novagen，Merck Millipore，Darmstadt，德国）中以C端His-tag融合体形式表达。使用pET28a-CagL WT质粒作为DNA模板通过PCR进行CagL的定点诱变。扩增在含有2mM的MgCl50μl的反应进行2，0.2 10mM的dNTP，每种引物为0.2μM（补充表 3）和0.5单位的Phusion高保真DNA聚合酶（NEB，Ipswich的，USA），然后进行PCR纯化（NucleoSpin凝胶和PCR净化，德国杜伦Macherey-Nagel），用Dpn消化I（NEB）和使用T4 DNA连接酶（NEB）的连接。重新测序和蛋白质印迹证明了所得质粒中CagL的正确表达。通过使用建立的方法11进行CagL变体的纯化，包括一些改进步骤。简而言之，在16℃下诱导表达20小时。在天然条件下，通过HisTrap HP（GE Healthcare，英国白金汉郡），HiTrap Q HP（GE Healthcare）通过亲和色谱纯化CagL，然后通过Superdex-75（GE Healthcare）进行凝胶过滤。纯化的CagL的表观大小估计为27 kDa。通过SDS-PAGE /考马斯蓝染色判断CagL的纯化具有> 95％的同质性（补充图 11））。纯化的CagL蛋白的折叠构象通过使用分光旋光计的圆二色性确认。HEK293亲本和TLR5 +细胞用5μg/ mL的CagL蛋白处理12小时。NF-κB活性通过标准萤光素酶报告基因检测。
迄今为止，TLR5的融合版本是唯一可用的可溶性重组TLR5（rTLR5）蛋白，可作为鞭毛蛋白识别的活性受体7。对于rTLR5，斑马鱼TLR5的N末端片段（氨基酸残基22–390）与with鱼可变淋巴细胞受体的C末端片段（VLR残基126–200）融合。此外，rTLR5附加到C端凝血酶切割位点，Strep-tag II（WSHPQFEK）和His6标签上，以促进纯化。通过建立的标准程序7表达和纯化rTLR5。在用rTLR5表达杆状病毒感染后，在Hi5昆虫细胞表达系统中分泌了rTLR5。使用Ni-NTA亲和力（Qiagen）和Strep-Tactin亲和层析（IBA Lifesciences）纯化rTLR5。将纯化的rTLR5在20 mM HEPES（pH 7.4），150 mM NaCl和1.5 mMβ-巯基乙醇中透析，并通过SDS-PAGE分析。
CagL肽阵列是通过SPOT合成技术生成的。简而言之，使用Fmoc / tert在氨基官能化纤维素膜上合成了补充图4中所示的肽 丁基化学。每个斑点由5 nmol肽组成。为了进行结合测定，将肽阵列在室温下用10 mL封闭缓冲液封闭过夜，该封闭缓冲液由2×封闭缓冲液浓缩物（Sigma-Aldrich）和5％（w / v）蔗糖的TBS-T溶液（0.02 M磷酸钠缓冲液0.1 M氯化钠（pH 7）和0.05％Tween-20）。将封闭缓冲液中的5 µg / mL重组斑马鱼TLR蛋白（His标记）添加到肽阵列中，并在旋转的同时在室温下孵育4小时。然后，将阵列用15 mL TBS-T缓冲液洗涤3次，然后与在8 mL封闭缓冲液中的40μL小鼠α-Tetra-His-抗体（Qiagen，目录号34670）孵育，得到1：200在室温下稀释2小时。最后，是辣根过氧化物酶的第二种共轭α小鼠抗体（Life Technology，Darmstadt，德国，猫。没有。31446）在10 mL封闭缓冲液中以1：10,000的比例稀释，并使用ECL Plus化学发光Western blot试剂盒（GE Healthcare）进行抗体检测，如下所述。如预期的那样，印迹上无肽的模拟对照未显示任何信号（见图。 2b，位置C20-25）。
将指定的重组CagL蛋白（各1μg），FliC蛋白（1μg）和FliC肽作为对照固定在Dotblots上，然后使用上述用于肽SPOT阵列的方案与1μg重组TLR5孵育。在CagL的D1基序中进行了定点诱变34，以研究单个氨基酸在TLR5结合中的重要性。为了研究CagL和FliC是否在TLR5中竞争相同的结合位点，我们还通过添加生长的rFliC（如补充图12中所示的反应所示）来完成竞争分析 。使用根据我们的Western blot规程处理的α-TLR5抗体（见下文）可视化结合的TLR5，并通过光密度测定法定量信号强度。
人胃腺癌细胞系AGS（ATCC CRL-1739）在RPMI-1640培养基中生长，该培养基中添加了10％的胎牛血清（Gibco，佩斯利，英国）。用pUNOhTLR5（TLR5 +）或pUNOhTLR4（TLR4 +）构建体（目录号293-htlr5和293-htlr4a，InvivoGen，在美国圣地亚哥（San Diego，USA）和T84细胞（ATCC CCL-248）在含有4.5 g / L D-葡萄糖，4 mM L的 Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养-谷氨酰胺，110 mg / L丙酮酸钠，10％FBS（Invitrogen，卡尔斯巴德，美国），并补充有1％抗生素和抗真菌溶液（Sigma-Aldrich）和10μg/ mL杀稻瘟素（InvivoGen）。所有细胞系均在37°C的5％（v / v）CO 2培养箱中培养，并每2至3天以1：3至1：5的比例继代培养，其融合度为70至90％。通常在感染前将细胞维持在75 cm 2的组织培养瓶中，并接种到6孔或12孔板（Greiner-Bio-One，德国）中。
根据制造商的规程，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）分离RNA。用于安捷伦2100生物分析仪平台（美国圣克拉拉的安捷伦科技公司）批准了用于微阵列分析的RNA质量。最佳质量的RNA用于进一步的步骤。每个总RNA样品100 ng用于线性基于T7的扩增，并使用安捷伦低输入快速安培标记试剂盒制备Cy3标记的cRNA。使用ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies，威尔明顿，美国）测量cRNA的产量和染料掺入率。使用安捷伦基因表达杂交试剂盒，使用安捷伦60-mer寡核苷酸微阵列处理方案进行Cy3标记的cRNA杂交。简要地，0。使用安捷伦推荐的杂交室和恒温箱，将杂交缓冲液中的6μgCy3标记的片段化cRNA过夜（17 h，65°C）与安捷伦全人类基因组寡核苷酸微阵列8x60K V2杂交。随后，将微阵列在25°C下用安捷伦基因表达洗涤缓冲液1洗涤1分钟，然后用预热的安捷伦基因表达洗涤缓冲液2（37°C）进行第二次洗涤1分钟，杂交后的荧光信号使用安捷伦的微阵列扫描仪系统检测了安捷伦微阵列。使用安捷伦特征提取软件（FES）读取和处理微阵列图像文件。以上步骤在Miltenyi Biotec（德国贝尔吉施格拉德巴赫）的微阵列服务中心进行。使用安捷伦推荐的杂交室和柱箱将温度降至65°C）至安捷伦全人类基因组寡核苷酸微阵列8x60K V2。随后，将微阵列在25°C下用安捷伦基因表达洗涤缓冲液1洗涤1分钟，然后用预热的安捷伦基因表达洗涤缓冲液2（37°C）进行第二次洗涤1分钟，杂交后的荧光信号使用安捷伦的微阵列扫描仪系统检测了安捷伦微阵列。使用安捷伦特征提取软件（FES）读取和处理微阵列图像文件。以上步骤在Miltenyi Biotec（德国贝尔吉施格拉德巴赫）的微阵列服务中心进行。使用安捷伦推荐的杂交室和柱箱将温度降至65°C）至安捷伦全人类基因组寡核苷酸微阵列8x60K V2。随后，将微阵列在25°C下用安捷伦基因表达洗涤缓冲液1洗涤1分钟，然后用预热的安捷伦基因表达洗涤缓冲液2（37°C）进行第二次洗涤1分钟，杂交后的荧光信号使用安捷伦的微阵列扫描仪系统检测了安捷伦微阵列。使用安捷伦特征提取软件（FES）读取和处理微阵列图像文件。以上步骤在Miltenyi Biotec（德国贝尔吉施格拉德巴赫）的微阵列服务中心进行。将微阵列在25°C下用安捷伦基因表达洗涤缓冲液1洗涤1分钟，然后用预热的安捷伦基因表达洗涤缓冲液2（37°C）进行第二次洗涤1分钟，杂交的安捷伦微阵列的荧光信号使用安捷伦的微阵列扫描仪系统检测到。使用安捷伦特征提取软件（FES）读取和处理微阵列图像文件。以上步骤在Miltenyi Biotec（德国贝尔吉施格拉德巴赫）的微阵列服务中心进行。将微阵列在25°C下用安捷伦基因表达洗涤缓冲液1洗涤1分钟，然后用预热的安捷伦基因表达洗涤缓冲液2（37°C）进行第二次洗涤1分钟，杂交的安捷伦微阵列的荧光信号使用安捷伦的微阵列扫描仪系统检测到。使用安捷伦特征提取软件（FES）读取和处理微阵列图像文件。以上步骤在Miltenyi Biotec（德国贝尔吉施格拉德巴赫）的微阵列服务中心进行。
对每个样品组分析了三个重复样品。在对所有单个微阵列的强度数据进行背景校正后，在阵列之间进行分位数归一化。将归一化强度进行log 2转换，并用作进一步分析的基础。单向ANOVA（p ≤0.01）中的溶液的样品中施加和使用两种类未配对意义微阵列分析（SAM）方法做样品之间的差异表达分析35使用TIGR MeV软件4.9.0版，调整增量参数以确保最低的假有效基因中位数（FDR = 0）。使用Tukey事后检验（ANOVA）和Benjamini＆Hochberg方法（FDR）评估数据。通过欧氏距离，完全连锁的方法，将得出的显着差异基因表达数据用于绘制层次聚类。可通过登录号GSE123623在GEO数据库中获得微阵列数据集。
DAVID（注释，可视化和集成发现数据库）v6.8工具用于通过选择遗传本体术语GOTERM_BP_FAT和KEGG途径进行功能聚类来鉴定与生物途径或过程相关的差异表达基因。的显著高度富集的（最高的严格性，EASE得分> 2.0，p 基因中<0.001）簇中差异表达H.幽门螺杆菌感染TLR5 +（2/31簇）和亲本细胞（4/11簇），分别鉴定。
将HEK293亲本细胞，TLR5 +和TLR4 +细胞（每个2×10 5 / mL）培养在12孔板中，并根据制造商的说明用TurboFect试剂用2 µgNF -κB荧光素酶构建体15转染48小时（赛默飞世尔科技，美国沃尔瑟姆）。转染的细胞在MOI = 25的情况下用幽门螺杆菌感染8 h，或用rFliC（100 ng / mL）处理，并通过荧光素酶分析进行分析。简而言之，通过在裂解缓冲液（25 mM HEPES，2 mM EDTA，20 mM DTT，5％甘油，1％Triton X-100，pH 7.8）中的被动裂解来收获细胞。使用萤光素酶测定缓冲液（25 mM HEPES，15 mM MgSO 4），将一部分裂解物用于测量相对光单位（萤光素酶活性），在Orion微孔板光度计（Titertek Berthold，Pforzheim，德国）中加入5 mM ATP，0.5 mM D-荧光素，pH 7.8。用Bradford蛋白测定试剂（Bradford，Hercules，美国）测量每种裂解物的蛋白浓度，并将等量的裂解缓冲液用作空白。相对光单位用蛋白质浓度归一化，并将值绘制为测试样品与对照样品的比率。
人类T84细胞以前有报道表达对沙门氏菌 FliC 22有反应的内源性TLR5 。因此，如上所述，我们用幽门螺杆菌感染了T84细胞或用重组蛋白对其进行了处理。24小时后，收集上清液并进行细胞因子ELISA。使用Quantikine ELISA试剂盒和制造商（R＆D Systems，美国）提供的方案确定培养基中CCL20的浓度。用10 ng / mL重组TNF处理细胞作为对照（R＆D Systems）36。
为了进一步确定HEK293细胞上TLR5配体的身份，在存在或不存在α-hTLR5中和抗体的情况下对细胞进行了研究。将HEK293亲本和TLR5 +细胞（每毫升培养液2×10 5）与α-人TLR5（α-hTLR5）IgA孵育，该抗体是针对人TLR5的中和性单克隆抗体（mAB），可阻断鞭毛蛋白诱导的细胞活化（InvivoGen，目录号maba2-htlr5）。如制造商所述，可以在10 ng / mL到1μg/ mL的各种浓度下获得α-hTLR5-IgA抗体的中和能力。孵育1小时，然后用rFliC或幽门螺杆菌处理如上所述感染。使用类似的方案（InvivoGen，目录号mabg-htlr4），用抗人TLR4的中和单克隆抗体（mAB）对表达的HEK293细胞中的TLR4进行抑制。作为HEK293细胞中TLR4激活的阳性对照，我们使用标准方案（InvivoGen）应用了大肠杆菌 LPS（Sigma-Aldrich）和多粘菌素B作为抑制剂。
所有蛋白质序列均从NCBI GenBank数据库获得。通过应用Clustal Omega程序（版本1.2.4）执行多个蛋白质序列比对，例如图 2c和补充图 9，该程序使用种子引导树和HMM轮廓图技术在三个或更多序列之间产生比对（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）。手动组装序列，并由Clustal Omega使用默认参数进行比对。图2c中使用的序列的登录号 如下：幽门螺杆菌 CagL（NP_207335.1），鳗弧菌 FlaA（CDQ50898.1），塔氏爱德华氏菌 FliC（AAN52540.1），粘质沙雷氏菌 FliC（BAO34403.1），肠炎沙门氏菌 FliC（ATI85802.1），幽门螺杆菌 FlaA（AAD07667.1），空肠弯曲杆菌 FlaA（CAL35451.1）和细菌芽孢杆菌 FlaA（ABM44761.1）。
的结构幽门螺杆菌 FLAA Hp的使用复杂的在复杂的斑马鱼TLR5（zTLR5）被建模沙门氏菌（：3V47as模板PDB）的鞭毛蛋白与斑马鱼TLR5 7。使用Modeller 9.16 37进行建模。使用Swiss-Model 38和RasMol 39进行结构分析和可视化。
将四组患者的活检（未感染对照组，n = 11，中度感染，n = 9，高等级感染，n = 10，通过常规三联疗法根除幽门螺杆菌，n = 6）固定在4％中性福尔马林缓冲液中在越来越多的酒精和二甲苯中石蜡化。在手动定向活检以允许垂直切割后，将石蜡块切成4微米厚的玻片，并用苏木精和曙红染色。为了检测幽门螺杆菌，进行了Warthin-Starry Sliver染色。FAU伦理委员会办公室（德国埃尔兰根的执照344至16 SB）对所有人体活检分析进行了审查和批准。
使用α-TLR5抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号36-3900）对细胞质上皮和炎性细胞进行特异性染色。为了回收抗原，用微波在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中将脱蜡的切片加热20分钟。此外，将内源过氧化物酶与在无水甲醇中的0.3％过氧化氢酶一起孵育20分钟，将其封闭。用洗涤缓冲液冲洗切片，并通过使用正常血清（Nichirei，东京，日本）封闭非特异性结合。在4℃下过夜孵育以结合α-TLR5一抗。然后，用生物素化的二抗孵育30分钟，然后使用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶方法进行底物结合。在所有情况下，均需用haemalaun复染。对于所有污渍，进行肾阳性对照，并且只有在对照的可评估结果显示预期结果时才接受染色。如果不是，则重复染色直到内部对照显示适当的结果。两名病理学家根据免疫反应评分（IRS）系统对阳性进行评分21。阳性细胞的百分比分为五个等级：0-4（0％，<10％，10-50％，51-80％，> 80％）乘以强度等级（从0到3）。免疫组织化学反应。图 4a-d中的图片 以40倍的放大倍数显示。
C57BL / 6 WT和tlr5 -/-小鼠（由卖方回交到C57BL / 6背景的时间超过10代）从杰克逊实验室（美国巴港）获得。在苏黎世大学认可的动物设施中，将动物饲养和饲养在无特定病原体的条件下。所有动物实验均由苏黎世州兽医局审查并批准（许可证ZH24 / 2013授予AM）。在连续的两天对小鼠于6周龄时用10 8 CFU的幽门螺杆菌 PMSS1进行口服感染，并在感染后3个月进行分析。未感染的小鼠作为对照。WT和tlr5感染-/-将雌性共同饲养，以最大程度地减少这些动物微生物区系中假定的差异可能造成的混杂影响；不幸的是，这对于男性来说是不可能的。图4f中的数据 来自三个独立的研究，图4g-j中的数据 来自这三个研究中的两个。图 4k，1中的数据来自一项大型的独立研究。仅对共同寄居的雌性进行单独分析（其中9种是野生型，5种是tlr5 -/-）证实了整个（混合）队列中观察到的所有趋势，但是一些比较（组织学，Th1浸润）没有统计学意义由于样本量较小。共同饲养的WT和tlr5 -//的定植水平的差异女性具有统计学意义。的幽门螺旋杆菌在这项研究中，使用PMSS1应变，是用十二指肠溃疡和小鼠-衍生物悉尼株1（SS1）的亲本菌株的患者的临床分离物22。如上所述，幽门螺杆菌在马血琼脂平板上培养，并在微需氧条件下在厌氧罐中进行液体培养27。通过相差显微镜常规评估培养物的污染，形态和运动性。为了对小鼠组织进行胃组织病理学分析，在石蜡包埋和Giemsa染色之前，将胃切片用10％中性缓冲福尔马林固定。基于四个组织病理学参数（慢性炎症，胃萎缩，肠化生，粘液坑细胞/上皮增生），对每只小鼠的两个纵切面进行划分，它们的胃长度从前胃部/ corp体连接部到胃窦/十二指肠连接部关于最新悉尼分类20中描述的功能。具体而言，对于慢性炎症，得分的定义如下：0，无； 0，无； 0，无。1，有些渗透；2，轻度（粘膜下层和粘膜很少聚集）；3，中度（黏膜下层和黏膜有几个聚集体）；4，标记（黏膜下层和黏膜上有许多大的聚集体）；5，几乎整个粘膜都含有致密的浸润；6，整个粘膜均含有致密的浸润和增生：0，无；1，单腺体（浸润旁）；2，一个重点领域/ 1–4地穴（轻度）；3; 1-3个病灶；4，多个病灶；5，> 50％的腺体受到感染；6，只有少数小的非增生性区域。使用Prism 6.0（GraphPad软件）对所有鼠标的工作进行统计分析。非参数Mann-Whitney U检验用于所有统计比较。当p < 0.05。* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。
对于固有层（LP）白细胞分离，纵向打开胃肠道组织，清洗并切成片。将片段在含10％FCS和5 mM EDTA的汉克斯平衡盐溶液中于37°C孵育，以去除上皮细胞。将组织在装有15 mM HEPES，500 U / mL IV型胶原酶（Sigma-Aldrich）和0.05 mg / mL DNase I的摇动培养箱中于37°C消化50％RPMI-1640培养基中补充10％胎牛血清和100 U / mL青霉素/链霉素。然后将细胞铺在40/80％Percoll梯度上，离心，并在含0.5％BSA的PBS中轻轻洗涤细胞层表面。通过用RPMI-1640培养基中的500 U / mL IV型胶原酶消化组织15分钟，然后使用注射器柱塞推动细胞过滤器来制备MLN细胞悬液。
为了进行表面染色，将细胞在含有0.5％牛血清白蛋白的PBS中染色，该蛋白具有可固定的活力染料和以下抗体的组合：抗小鼠CD45（30-F11），Ly6G（1A8），CD4（RM4-5）和TCRβ（H57–597）（均来自美国圣地亚哥的BioLegend，补充表 4）。包含Fc阻断剂（抗CD16 / CD32，Affymetrix，圣塔克拉拉，美国）以最小化非特异性抗体结合。为了对T细胞进行细胞内细胞因子染色，将细胞在含有0.1μM佛波醇12肉豆蔻酸酯13乙酸酯和1μM离子霉素与1：1,000 Brefeldin A（eBioscience，Vienna，Austria）和GolgiStop溶液（BD）的完全IMDM培养基中孵育3.5小时生物科学，美国富兰克林湖（Franklin Lakes，USA）），温度为37°C，湿度为5％的CO 2。表面染色后，根据制造商的说明，将细胞固定并用Cytofix / Cytoperm固定/通透溶液试剂盒（BD Biosciences）进行通透。用针对IL-17A（TC11-18H10.1）和IFNγ（XMG1.2，Biolegend，补充表4）的抗体将细胞染色50分钟 。通过在分析之前向每个样品中添加countBright绝对计数珠（Life Technologies），确定总白细胞计数。在LSRII Fortessa（BD Biosciences）上分析样品，或在FACSAriaIII（BD Biosciences）上分选，纯度> 95％。使用FlowJo软件（美国亚什兰的Tree Star）进行分析。
用冷PBS洗涤1×10 7的HEK293 TLR5 +细胞（模拟对照，感染幽门螺杆菌或用rFliC处理），并在4°C的裂解缓冲液（20 mmol / L Tris pH 7.2，150）中裂解30分钟。如已建立的标准规程33所示，mmol / L NaCl，5 mmol / L乙二胺四乙酸，1％Triton X-100、10％甘油，1 mmol / L Na 3 VO 4，已完成）。裂解液在4°C下用蛋白G-琼脂糖（GE Healthcare）预净化2 h。多克隆α-TLR5（每个样品2μg，补充表 4）加入上清液中并在4°C下孵育过夜。通过添加蛋白质G-Sepharose 2 h沉淀免疫复合物，并用裂解缓冲液洗涤一次，再用0.5x PBS洗涤3次。然后，如下所述对样品进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。
收集感染细胞和对照细胞，并与等量的2x SDS-PAGE缓冲液混合，煮沸5分钟，在6-12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后将其印迹在PVDF膜上（Immobilon-P，Merck Millipore，德国达姆施塔特）。在添加抗体之前，将膜在含有3％BSA或5％脱脂乳的TBS-T（140 mM NaCl，25 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1％Tween-20）中于室温封闭1 h。通过用1：1,000稀释的小鼠单克隆α-磷酸酪氨酸抗体PY99（Santa Cruz，美国，目录号sc-7020）和兔多克隆α-CagA抗体孵育膜来检测磷酸化和非磷酸化的CagA蛋白。 1：2,000（Austral Biologicals，美国圣拉蒙，目录号HPP-5003–9）。先前已报道了兔多克隆α-Flagellin抗体40。兔抗蛋白衍生肽的免疫反应产生了兔多克隆α-CagL，α-CagM，α-CagN，α-Cag3和人GAPDH抗体（补充表 4） 11。根据德国Tierschutzgesetz和Tierschutz-Versuchsverordnung实施的欧盟2010/63 / EU指令进行了免疫接种。该协议已由LandesamtfürLandwirtschaft，Lebensmittelsicherheit和Fischerei Mecklenburg-Vorpommern（LALLF MV，德国罗斯托克）注册并批准。所有抗体均经亲和纯化，并按照Biogenes GmbH（德国柏林）的标准方案制备。识别TLR5的多克隆抗体购自Santa Cruz（USA）。作为二抗，分别使用了辣根过氧化物酶偶联的α-小鼠或α-兔多价山羊免疫球蛋白（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）。抗体检测使用ECL Plus化学发光Western Blot系统进行免疫染色（GE Healthcare）。
如上所述，在马血清GC琼脂平板上培养幽门螺杆菌 G27 WT及其等基因ΔcagL突变体。为了标记，收集细菌并将其重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中。如标准方案17所述，用异硫氰酸荧光素（FITC）（Sigma-Aldrich）标记细菌。标记过程后，将细菌在-80°C的BHI培养基（类毒素）中储存20％甘油（卡尔·罗斯，卡尔斯鲁厄，德国），直至使用。
LigandTracer Green仪器（Ridgeview Instruments AB，Uppsala /瑞典）用于实时定量和在活细胞条件下量化幽门螺杆菌与HEK293 TLR5 +和亲代细胞的相互作用。为了将实验条件保持在37°C和5％CO 2下，将LigandTracer置于Hera Cell 150i CO 2培养箱（Thermo Fisher）中。实验前24小时，2×10 6的新鲜分离的HEK293细胞在聚-接种升-赖氨酸（Sigma-Aldrich）涂覆的Nunclone表面花胶（Nunc A / S，罗斯基勒，丹麦），根据Ridgeview提供的制造商协议进行。如通过光学显微镜确认的，每个细胞单层的汇合为约90％。这些板包含无细胞区域，该区域用作背景参考。在测量之前，丢弃生长培养基，并用新鲜的DMEM和10％FCS将细胞洗涤3次。加入3mL相同的培养基，并将板放入LigandTracer Green仪器中。对于实验，使用LigandTracer Control软件提供的“常规测定”模板。30分钟的背景测量后，用100μLFITC 标记的幽门螺杆菌 G27 WT或OD 600的G27ΔcagL = 1.0已添加到单元格。在90分钟的时间过程中测量旋转培养皿中结合HEK293细胞的细菌细胞的荧光强度，每60 s由荧光检测器记录一次，并将其与培养皿相对的无细胞部分的参考信号进行比较。
亲本和TLR5的感染+在约3.5×10的密度下进行，在约80％汇合的细胞5如前面报道的六孔板的细胞18。在2、4和8小时的时间过程中感染幽门螺杆菌后，将细胞用2mL不含抗生素的预热培养基洗涤3次，以消除未附着的幽门螺杆菌。为了将与细胞结合的细菌计数为总菌落形成单位（CFU），将细胞与1 mL PBS缓冲液和0.1％皂苷在37°C下孵育15分钟。之后，收集细胞悬浮液，并将系列稀释液在GC琼脂平板上孵育。通过使细菌生长4天并进行菌落定量来确定CFU的数量。
所有实验至少进行了3次，结果相似。使用GraphPad Prism统计软件（8.0版）通过单向ANOVA，随后进行Tukey检验或通过双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验对所有体外和人类数据进行评估。显著差异通过*定义p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001和**** p ≤0.0001。
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