慢性肾脏病是在流行病学上确定的登革热患者中发生严重登革热的危险因素。然而，有关登革热影响的终末期肾病（ESRD）患者的免疫发病机制的可用数据不足。我们进行了体外这项研究评估了ESRD患者（n = 34）和健康对照（n = 30）在登革病毒2型感染的单核细胞中的顺序免疫反应和病毒载量。白细胞介素（IL）-1受体拮抗剂（Ra），IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），单核细胞趋化因子的浓度在登革热病毒中检测蛋白1（MCP-1），巨噬细胞炎性蛋白1b（MIP-1b），血管内皮生长因子（VEGF），肿瘤坏死因子（TNF）-α和病毒载量循环阈值（Ct）感染后6 h，24 h，48 h和72 h感染2型单核细胞。我们在ESRD组中发现感染后6小时的GM-CSF和IL-2水平明显升高。但是，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP-1，发现MIP-1b和MIP-1b的水平明显低于对照组。感染后24小时，48小时和72小时，IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP-1和MIP-1b的水平明显降低在ESRD组中被检测到。在ESRD组中，VEGF在24 h和48 h的浓度以及GM-CSF在48 h和72 h的浓度也低于对照组。与对照组相比，ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值明显降低。两组在感染后48 h和72 h的病毒载量Ct值之间没有显着差异。我们的研究表明，在ESRD患者中，登革热感染的单核细胞免疫介质的表达受到损害。在ESRD组中检测到MCP-1和MIP-1b。在ESRD组中，VEGF在24 h和48 h的浓度以及GM-CSF在48 h和72 h的浓度也低于对照组。与对照组相比，ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值明显降低。两组在感染后48 h和72 h的病毒载量Ct值之间没有显着差异。我们的研究表明，在ESRD患者中，登革热感染的单核细胞免疫介质的表达受到损害。在ESRD组中检测到MCP-1和MIP-1b。在ESRD组中，VEGF在24 h和48 h的浓度以及GM-CSF在48 h和72 h的浓度也低于对照组。与对照组相比，ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值明显降低。两组在感染后48 h和72 h的病毒载量Ct值之间没有显着差异。我们的研究表明，在ESRD患者中，登革热感染的单核细胞免疫介质的表达受到损害。ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值显着降低两组在感染后48 h和72 h的病毒载量Ct值之间没有显着差异。我们的研究表明，在ESRD患者中，登革热感染的单核细胞免疫介质的表达受到损害。ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值显着降低两组在感染后48 h和72 h的病毒载量Ct值之间没有显着差异。我们的研究表明，在ESRD患者中，登革热感染的单核细胞免疫介质的表达受到损害。

登革热是全球最普遍的节肢动物传播的病毒性疾病之一1。它是在世界各地的热带和亚热带地区广泛的1，2。估计表明，每年发生3.9亿登革热病例，39亿人有感染的危险2。登革热的临床表现范围从轻度非特异性高热疾病和发烧，到严重登革热的潜在灾难性并发症，如2009年世界卫生组织登革热指南1所述。登革热发病机理的复杂性阻碍了抗病毒药物的发展。因此，登革热的管理的基础是早期诊断和识别的严重登革热病例，并及时补液1，3。严重登革热的特征是毛细血管通透性增加，导致大量血浆渗漏，大量出血和/或器官受累，可能导致休克和死亡1。抗体增强4，免疫应答系统异常激活以及细胞因子产生5和宿主合并症6是严重登革热的假定发病机制之一。细胞因子级联反应起着登革热的严重形式的发病机制中起主要作用，并且涉及亲和抗炎细胞因子和趋化因子引起血管渗透性增加，导致大的流体损失和随后的电击之间复杂的相互作用5，7。

在1950和1960年代，登革热被普遍认为是儿科疾病8，9。然而，近几十年来，年龄的增长已经报道是重症患者登革热的危险因素，如与衰老有关的合并症造成的老年患者死亡率的重大风险10，11，12。慢性肾脏病已牵涉到严重的登革热发展13，14，15，16。Thein 等人在对108名登革热患者的研究中报告说，肾脏疾病会增加成年人的死亡几率17。郭等。报道慢性肾脏疾病患者的死亡率高于没有慢性肾脏疾病的患者13。在对304名登革热成人的研究中，发现慢性肾脏病是导致急性肾损伤发展的危险因素，这与患病患者的高发病率和高死亡率有关18。Wong 等。发现在感染登革热的成年人中，晚期肾脏疾病（ESRD）是急性呼吸衰竭的危险因素19。ESRD还是登革热成年患者胃肠道出血的重要临床预测指标20。实际上，与普通人群相比，ESRD患者更容易受到感染（例如细菌性败血症），临床效果较差21。尽管ESRD是一种越来越常见的疾病，但缺乏有关登革热ESRD患者免疫发病机制的足够数据。因此，迫切需要彻底研究以更好地了解登革热感染的ESRD患者的免疫反应。在本研究中，我们旨在通过调查ESRD成人的登革热病毒感染的单核细胞来探索体外的顺序免疫反应和病毒载量，这最终将有可能针对性地制定干预措施，以改善登革热感染的治疗计划。

伦理声明

该研究得到台湾高雄长庚纪念医院医疗中心机构审查委员会的批准（文件编号102-5046B）。获得了参与者的书面知情同意。这项研究遵守了《赫尔辛基宣言》的原则。

学习期间和参加者

该研究于2017年1月1日至2017年12月30日在高雄长庚纪念医院进行。志愿者是从患有ESRD的人和健康对照者中招募的。在研究中控制年龄。受ESRD影响的志愿者是指每周进行三次血液透析治疗的慢性肾脏病患者。从每个参与者（ESRD和健康个体）获得10毫升血液样本。为了避免透析器对免疫介质表达的影响，在开始透析之前，应收集来自ESRD志愿者的血样。使用登革热印迹检测试剂盒（Gene Labs Diagnostics，新加坡）对所有参与者的血液样本进行登革热病毒特异性免疫球蛋白IgM和IgG抗体测试，以确定以前是否有登革热感染22。完成人口统计数据收集后，对血液样本进行匿名处理。

制备单核细胞

通过以2500 rpm（150×g）离心20分钟，将所有参与者（ESRD和健康个体）的全血分离为血浆和血细胞（即白细胞和红细胞）。通过4.5％右旋糖酐沉淀从血细胞中除去红细胞。去除红细胞后，根据其他地方23所述的程序，使用密度梯度离心法（Ficoll-Paque PLUS，Amersham Biosciences Corp.，350 g / 30 min）将白细胞进一步分离为单核细胞和中性粒细胞。此后，将来自ESRD和健康个体的单核细胞悬浮在RPMI培养基（Gibco）中，并以每孔1.0×10 6个细胞的密度接种到24孔培养板中，在37°C下放置1天。

登革热病毒血清型2（DENV2）的制备

台湾南部2002年，2014年和2015年爆发了三起大型登革热暴发，其中DENV2是这些暴发中的主要血清型24。在我们的系列中，设计了一个体外模型，该模型具有被DENV2感染的单核细胞。DENV2（新几内亚C株，ATCC）获自台北国防医学中心预防医学研究所。该病毒在Eagle的基本必需培养基（Gibco BRL，Grand Island，NY，美国）中的白纹伊蚊C6 / 36细胞中于28°C繁殖5天。如先前所描述基于在幼仓鼠肾-21的细胞的标准空斑形成单位（PFU）试验的病毒滴度进行测定25。病毒效价调整为5.0×10 6RPMI 1640（Gibco BRL）培养基中的PFU / mL。为了获得足够的病毒感染的单核细胞并避免过度的细胞凋亡，我们使用5的感染复数（MOI），先前已被证明是适当的26。

ESRD和健康个体单核细胞的DENV2感染

用MOI为5的DENV2接种来自24孔培养板的单核细胞（密度为每孔1.0×10 6个细胞），并在37°C下孵育2小时。洗涤感染的单核细胞以去除细胞外病毒，并在5％CO2培养箱中于37°C的RPMI 1640培养基中进行培养。在感染后（感染后6小时，24小时，48小时和72小时）的各个时间点收集上清液和细胞并进行分析，以测量响应性免疫介质和病毒载量。

免疫介质的测定

在这项研究中，促炎介质由白介素（IL）-2，IL-6，IL-12p40和肿瘤坏死因子（TNF）-α证明。抗炎介质由IL-1受体拮抗剂证明。 （Ra）和IL-10。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-8证实了白细胞衍生的生长和趋化因子，而单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和巨噬细胞炎症表明了单核细胞和巨噬细胞趋化因子。蛋白1b（MIP-1b）。血管内皮生长因子（VEGF）证明了血管渗漏介质。根据生产商的说明，使用FlowMetrix系统（Luminex Corporation，奥斯汀，德克萨斯州，美国）测量来自被感染单核细胞的培养上清液中免疫介质的浓度。27.

通过实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）确定DENV2循环阈值（Ct）值

从培养的单核细胞（ESRD和健康个体）中提取病毒RNA，以通过实时RT-PCR测量Ct值，如先前所述28。用于检测DENV2的正向引物，反向引物和TaqMan探针序列分别为5'-GGCTTAGCGCTCACATCCA-3'，5'-GCTGGCCACCCTCTCTTCTCTT-3'和5'-FAM-CGCCCACCACTATAGCTGCCGGA-TAMRA-3'。

数据和统计分析

免疫介质的测量值表示为平均值和标准偏差（pg / mL）。通过RT-PCR的Ct值确定病毒载量。使用Mann–Whitney U检验分析ESRD组和对照组在不同时间点（感染后6小时，24小时，48小时和72小时）的免疫介质和病毒载量的差异。甲P的<0.05值被认为是统计学显著。所有分析均使用SPSS 13.0（美国伊利诺伊州芝加哥）进行。

参加者的人口特征

这些细胞来自64位参与者，包括34位ESRD患者（14位男性和20位女性；中位年龄59.7岁）和30位健康对照（12位男性和18位女性；中位年龄58.8岁）。在受ESRD影响的参与者中，高血压（61.7％）是最常见的合并症，其次是2型糖尿病（41.2％）。对照组的参与者均无基础疾病。所有参与者的登革热病毒特异性免疫球蛋白IgM和IgG抗体测试均为阴性，如登革热印迹检测试剂盒22所确定。

总体ESRD感染者和控制者的免疫状况

图   1显示了感染后6小时，24小时，48小时和72小时，ESRD组和对照组之间的免疫特征。在某个时间点研究未检测到某些免疫介质。对照组中未检测到IL-1Ra，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，GM-CSF，MCP-1，MIP-1b，VEGF和TNF-α。分别在感染后24 h和72 h的4和7个标本中。在1个样本中未检测到IL-1Ra，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，GM-CSF，MCP-1，MIP-1b，VEGF和TNF-α ESRD组在感染后48小时和72小时。

终末期肾脏病（ESRD）组和对照组在感染后6 h，24 h，48 h和72 h感染DENV2的单核细胞的免疫特征。数据表示为平均值和标准偏差（pg / mL）。

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感染后6 h，ESRD组的GM-CSF和IL-2明显高于对照组，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP-1的水平在ESRD组中发现MIP-1b较低。感染后24小时，ESRD组的IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，VEGF，MCP-1和MIP-1b的水平显着降低，与对照组相比。再次在感染后48小时，IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，GM-CSF，TNF-α，VEGF，MCP-1和MIP-1b的水平明显降低在ESRD组中观察到。在感染后期（感染后72小时），IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，GM-CSF，TNF-α，MCP-1和MIP的水平与对照组相比，ESRD组的-1b仍显着较低。

ESRD的免疫状况影响没有糖尿病的参与者

除病毒因素外，目前的证据表明，糖尿病是可能影响登革热感染结果的潜在重要辅助因素29。为了消除糖尿病对ESRD患者免疫介质产生的影响，在没有糖尿病的ESRD参与者（n = 19）和对照组（n = 30）之间进行了亚组分析（图2）。 ）。感染后6小时，检测到较高浓度的IL-2和GM-CSF，但刺激的IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP- 1，无糖尿病的ESRD组MIP-1b高于对照组。感染后24小时，48小时和72小时，IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP-1和MIP-1b的水平仍然没有糖尿病的ESRD患者的血糖水平低于对照组。另外，与对照组相比，在没有糖尿病组的ESRD中，感染后48小时VEGF的浓度显着降低。

DENV2感染的终末期肾病（ESRD）单个核细胞（无糖尿病组和对照组）在感染后的各个时间点产生的细胞因子/趋化因子。数据表示为平均值和标准偏差（pg / mL）。

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ESRD和对照组的DENV2病毒载量

感染后72 h，ESRD组中的1个标本和对照组中的1个标本中，在感染后24 h，48 h和72 h未检测到病毒载量Ct值。与对照组相比，ESRD组在感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值显着降低。在感染后48小时和72小时，两组培养的单核细胞之间的病毒载量Ct值均无显着差异（图   3）。

在感染后各个时间点，感染DENV2的终末期肾脏病（ESRD）组和对照组的登革热病毒载量阈值循环值。

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慢性肾脏病已发现登革热患者中的出血性登革热的发展确定的流行病学危险因素，13，14，15，16，17，18，19，20。但是，先前关于登革热免疫发病机制的大多数研究都涉及普通人群，而不涉及具有特定潜在疾病（例如ESRD 30）的人群。在本研究中，在患有ESRD的成年人和健康参与者中，被DENV2感染的单核细胞中测量了11种免疫介质和病毒载量Ct值。尿毒症本身表现出复杂的多维炎症状况31。先前的研究表明，ESRD患者的T淋巴细胞失调，血浆IL-18，IL-6，TNF-α和C反应蛋白的浓度明显高于透析前的对照 31。在我们的系列中，除了在感染后6 h观察到高水平的GM-CSF和IL-2外，在ESRD组中在感染后后期还观察到免疫介质的产生受损。这一发现对于理解免疫病理反应的基础可能具有宝贵的价值，并为管理登革热病毒感染的ESRD患者提供新的见解。

登革热病毒感染患者可能会经历三个临床阶段，即发热阶段，危重阶段和恢复阶段1。我们的报告描述了一种模拟登革热病毒感染的单核细胞的体外实验，以及在感染后不同时间的免疫介质分析，这种环境模仿了人类的感染和随后的免疫反应。

感染后6 h，总体ESRD人群以及非糖尿病ESRD参与者的GM-CSF和IL-2水平均显着升高。GM-CSF在介导先天免疫反应中起着重要作用，后者会刺激干细胞产生粒细胞，并促进免疫系统的发展来对抗感染32。据报道，与轻度登革热相比，重症登革热患者的GM-CSF明显增加33。IL-2是一种重要的促炎细胞因子，可确定T辅助1应答的激活以刺激细胞介导的免疫34。Kurane 等。一项针对69名儿童的研究显示，登革出血热患者去铁前一天IL-2的水平最高35。尽管在ESRD组中，感染后6 h GM-CSF和IL-2的浓度较高，但仍会产生大量促炎和抗炎细胞因子以及趋化因子，包括IL-8，IL-12p40 ，TNF-α，MCP-1，MIP-1b和IL-10明显降低。这些结果表明在登革热疾病早期，ESRD患者的促炎和抗炎细胞因子/趋化因子之间的免疫反应紊乱。

严重登革热的特点是在血管完整性的瞬时扰动，导致血管通透性增加的结果在血浆渗漏1，3。这种变化很可能是由于生物介质为登革热病毒与宿主天然免疫和适应性免疫应答之间复杂的相互作用的结果的影响4，5，7。例如，增加的TNF-α和可溶性TNF-α受体的水平，以及VEGF在出血性登革热病例报告36，37。具有抗炎特性的IL-10可以反调节促炎性细胞因子的级联反应，据报道与疾病严重程度相关38值得注意的是，本研究结果显示，在24小时内IL-1Ra，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p40，TNF-α，MCP-1和MIP-1b的表达明显受损感染后48小时和72小时。ESRD组在24 h和48 h的VEGF水平以及48 h和72 h的GM-CSF水平也据报道较低。在没有糖尿病组的ESRD中也发现细胞因子/趋化因子表达受损。我们的结果有些不符合铺天盖地报道了与登革热疾病严重程度相关的免疫激活 5，7 ; 然而，我们的发现清楚地反映了ESRD患者体外受DENV2感染的单核细胞免疫研究的损害。尿毒症本身也可以改变ESRD患者的免疫系统39。在我们的系列中不进行全血细胞计数。然而，先前的研究表明，ESRD患者的单核细胞和单核细胞衍生的树突状细胞损害了内吞作用和成熟 40。Lisowska等。报告说，终末期肾病患者具有CD4 +和CD8 + T细胞的百分比较低，以及在外周血B细胞 41。实际上，有几个因素ESRD患者免疫力影响，诸如尿毒症毒素，营养不良，慢性炎症，和治疗透析 39，40，41，42。在这方面，我们的发现和以前的报道表明，在登革热病毒感染的情况下，ESRD患者存在免疫功能异常，免疫介质表达受损。

尽管在我们的系列中尚不确定促炎和抗炎细胞因子/趋化因子在登革热影响的ESRD患者血管通透性的发病机制中的作用，但免疫应答的损害表明登革热影响的ESRD的免疫系统激活减少在继发细菌感染的情况下可能导致发病率和死亡率增加的患者。值得注意的是，在对22名同时患有菌血症的重症登革热患者的研究中，其中18.2％的患者患有ESRD 43。在25名受登革热感染的成人菌血症患者中，有16％被发现患有ESRD 44。

这项研究中认可的另一个发现是，ESRD组感染后6 h和24 h的病毒载量Ct值明显低于对照组。但是，在感染后48小时和72小时，两组之间的病毒载量Ct值均无显着差异。登革热病毒载量和疾病的严重程度之间的关系仍然是有争议45，46。Murgue 等。曾有报道称高水平的病毒载量可能导致登革出血热的发病机理[ 45]。Chen 等 [128]在另一项研究中证实了128例成人登革热确诊病例。发现登革热和登革出血热患者的病毒载量无显着差异46。需要进一步的研究来确定病毒载量在ESRD患者严重登革热的发病机理中的作用。

本研究的局限性是不清楚在受登革热影响的ESRD患者的继发登革热感染中是否会发生类似的免疫反应。尽管有局限性，但这是第一项为了解免疫介质在登革热感染的ESRD人群中的作用提供基础的研究。

总之，我们的研究结果表明，ESRD个体中单核细胞对DENV2感染的免疫反应受损。这意味着在ESRD人群的免疫失调中需要谨慎行事，当治疗受登革热影响的ESRD患者时，它可能是临床结果的关键决定因素。我们的研究强调，需要进行体外研究以外的进一步临床研究，以证实这一重要发现。