摘要
我们报告了基于支架/基质附着区（S / MAR）的游离保留和β-珠蛋白复制子，DNA的活化剂Zif-VP64在其自然位置上针对特定γ-珠蛋白转录激活的游离型载体的发展β-珠蛋白基因座的复制起始区。含有转录盒CMV-Zif-VP64和CMV-eGFP-S / MAR的载体Zif-VP64-Ep1转染了a）K562细胞；b）鼠β-YAC骨髓细胞（BMC）；c）人类造血祖细胞CD34 +细胞，转染效率分别为46.3±5.2％，23.0±2.1％和24.2±2.4％。K562转染可产生稳定的细胞系，无论是否选择均能运行28周，γ-珠蛋白mRNA水平提高3.3±0.13，γ-珠蛋白水平升高6.75±3.25，HbF蛋白水平升高2±0.2倍，而载体仍保留游离的和非整合的。在鼠类β-YACBMC中，该载体介导沉默的人γ-球蛋白基因的激活，而在CD34 +细胞中，尽管只是短暂的，但γ-球蛋白mRNA却增加了。第二个载体Zif-VP64-Ep2，两个携带启动子SFFV而不是CMV的转录盒，并添加β-球蛋白复制子，转移到CD34 +细胞中，产生CD34 + eGFP +细胞，在菌落形成细胞培养物中产生菌落。重要的是，与未转染的细胞相比，这些细胞具有100％的荧光，γ-珠蛋白mRNA增加2.11±0.13倍。我们认为这些附加型载体是病毒载体的有效，更安全的替代品。
真核生物中的附加体是质粒或病毒基因组来源的染色体外封闭环状DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，因此，它们具有将核酸转移到细胞中的巨大载体潜力。复制型附加型载体就是这种情况，它已经被工程化1并用于基因表达的研究和在基因治疗应用中2，但是早期附加型基因转移的有效性受到瞬时基因表达的限制，主要是由于效率低下有丝分裂分离和质粒丢失。稳定维持游离型载体发展的一个里程碑是载体pEPI-1 3的产生，一个6.69 kb的质粒，不编码任何病毒蛋白，并且能够在受体细胞中长期保留核和转基因。载体pEPI-1是基于SV40复制起点的，其中大型T抗原的SV40编码基因被染色体元件支架/基质附着区（S / MAR）取代。的染色体元件称为S /火星，是在基因组的丰富区，即在染色质边界形成发挥作用4，5，它们结合于支架附着因子A（ SAF-A）蛋白6，他们介导pEPI-1质粒与核基质的束缚，从而促进其核保留。质粒pEPI-1中存在的S / MAR元素源自人β-干扰素基因的5'端，必须转录才能发挥其核保留功能。由于转录的S / MAR元件的锚定功能，载体pEPI-1在每个细胞周期内一次以游离形式与细胞DNA进行游离复制，并与细胞DNA同步复制，并具有很高的有丝分裂稳定性7。质粒pEPI-1及其衍生物在体外，细胞系8和原代细胞培养物中9以及在体内，在小鼠肝脏10中均起着有效的附加型载体的作用。和在转基因生物11并显示，以支持在基因治疗应用的细胞的安全和可重现的基因修饰能力12，13，14。因此，已证明设计用于游离持续性的基于S / MAR的pEPito质粒在体外和体内研究中均有效15，而最近，S / MAR稳定的质粒编码了囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR）基因，已添加到长期寻求的囊性纤维化基因校正的工具中16。游离载体产生的“ S / MAR技术”也已与病毒传递系统结合使用，以产生优于单独任一系统的载体。例如，这些是基于高容量腺病毒载体的杂交载体，可有效递送自主复制子17并通过使用S / MAR长期稳定非整合型慢病毒载体（NILV）18。
游离型载体可能被证明可有效治疗难治性遗传疾病，例如β地中海贫血和镰状细胞病（SCD），两者都是由β-珠蛋白基因突变引起的，为这些疾病的基因治疗提供了新平台。目前，针对这些疾病的最先进的基因治疗方法涉及使用复杂的慢病毒载体，该载体具有功能性β-珠蛋白基因，以修饰患者的造血干细胞19。初始故障，使用自失活（SIN）的那些显著较少遗传毒性的慢病毒载体后20，21导致第一次成功的基因治疗β地中海贫血22。从那时起，许多正在进行的临床试验的继续评估携带β样球蛋白转基因自体β-地中海贫血和SCD HSC的修改的慢病毒载体的功效23，24。
β地中海贫血和SCD基因治疗的第二种策略以及与这项工作相关的目的是通过激活γ珠蛋白基因来增加由两个α珠蛋白和两个γ珠蛋白链组成的胎儿血红蛋白（HbF） ），是β样基因簇的成员。β珠蛋白基因中的大多数β地中海贫血突变或SCD突变都会导致成年血红蛋白（HbA）减少，缺失或功能改变，该血红蛋白由两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链组成。在患者成年阶段，通常在胎儿生命中表达的γ-珠蛋白基因可补偿β-珠蛋白基因表达或功能的丧失，并且是基于临床表型改善的经过充分验证的治疗选择高HbF引起的β地中海贫血和SCD患者25。这些数据对γ珠蛋白基因的转录在患者的HSC的药理学诱导促使研究最初 26，27和稍后分子疗法旨在扭转γ珠蛋白基因转录的内源性阻抑物的作用的制剂 28。
随着“基因组编辑”技术的出现，研究集中于（a）纠正在β-球蛋白基因座29内其自然位置引起β-血红蛋白病的突变，（b）通过沉默使γ-球蛋白基因活化。转录因子抑制其转录的30，31上，推出了HPFH基因型的成造血干细胞，或（c）32。这些潜在的方法应用于临床，目前正在紧张调查33，34。在这种治疗类别中的其他途径，例如，使用没有核酸酶的无启动子基因，也似乎很有希望35。
尽管整合慢病毒载体已成为造血系统疾病基因治疗的首选平台[ 36]，但由于整合了这些载体而残留的致癌潜力引起了人们的关注，因为即使单个插入事件也足以引发一系列事件，从而导致体内白血病转化37，38。事实上，最近的第一明确的联系提出，慢病毒插入诱导的克隆扩增并在灵长类动物临床异常转化表型，在与强启动子与LV人类HSPC的转导之间39。以前使用中等程度的启动子以及存在合成的染色质绝缘子盒并不能减轻载体介导的遗传毒性40，但强大的绝缘体设计恰当 30，以及监测载体整合位点的可能性 41，42可提高其性能。
然而，插入诱变是不与所使用的慢病毒载体的唯一问题，如整合主管LV和非整合LV游离基因以及AAV DNA可以触发在人造血干细胞和祖细胞中的肿瘤抑制基因p53的信令43。
在开发针对血红蛋白病的替代性，附加型，基于S / MAR的载体的概念中，我们利用了另一种染色体元件，即真正的哺乳动物复制起点，即β珠蛋白复制子，即复制起始区（人β-珠蛋白基因座的IR），其中包含代表共有“ IR”区域的1.3 kb。该区域被认为是复制子，因为它具有启动异位部位DNA复制的能力44。此IR元件是在与S / MAR元件沿过去使用两次，以产生附加型载体与阳性结果9，45。在这项工作中，我们结合了游离基因转移与γ-珠蛋白基因的反式激活。我们报告的结构和附加型载体的表征，基于S / MAR元件，具有或不具有IR元件，其承载的人工转录活化剂，GG1-VP64，用于特异性反式激活人类甲 γ珠蛋白基因46在人和鼠造血细胞。在过去，病毒递送的这种人工活化剂的甲 γ珠蛋白基因，GG1-VP64-HA，成多种靶细胞，人的46或鼠来源47，48以及与CD34 +正常祖细胞人类捐赠者和β地中海贫血患者49，50导致与内源的启动子选择性的和直接的相互作用甲其转录的γ珠蛋白基因和上调。因此，该系统可有助于治疗β地中海贫血和镰状细胞疾病的有效基因疗法。
这项工作的具体目的是研究基于S / MAR和IR元件的新设计的游离型载体通过合成激活剂VP64激活γ-珠蛋白基因在其天然位置的转录的潜力。造血细胞。为此，所述载体进行了测试：（ⅰ）在红白血病细胞系K562中，为了集合转染参数和附加型长期保留，表达维护和载体拷贝数依赖性表达测试的能力，（ⅱ）在从细胞中携带人β-YAC的转基因小鼠，其中γ-珠蛋白基因已被沉默，以测试载体从异染色质区域和（iii）人CD34 +中激活该基因的能力为了确定转染的效力以及载体的功能潜力，这些细胞是这些疾病中治疗性基因转移的目标。
质粒pcDNA3-Zif-VP64（图 1a）46和pEPI-eGFP（图 1b）51提供了基本的转录单位，即分别为γ-珠蛋白激活物Zif-VP64和报告基因eGFP的一个。包含在新构建的向量中。具体来说，这项工作中用于激活γ-珠蛋白的附加型载体有两种：第一种构建的载体Zif-VP64-Ep1（图 1c）携带两个转录盒，一个用于特定的γ珠蛋白激活剂CMV-Zif-VP64，一个用于报告基因CMV-eGFP-S / MAR，均由启动子CMV驱动。盒式CMV-Zif-VP64携带结构域VP64，即单纯疱疹蛋白VP16最小激活结构域的四聚体重复序列，而该激活剂的锌指（Zif）部分是DNA结合结构域，可特异性结合启动子上的启动子。的甲 γ珠蛋白基因中，在17个核苷酸长的区域，指定GG1，围绕-117位置46，该港口的天然存在的位点HPFH 52，53。盒式CMV-eGFP-S / MAR携带报告基因eGFP基因，后接S / MAR元件，其来自人β-干扰素基因的5'位置，因此转录贯穿S / MAR，这是实现S / MAR的必要条件质粒的核保留元件由S / MAR元件决定。
质粒构建体。（a）质粒pcDNA3-Zif-VP64（6.1 kb），（b）对照质粒pEPI-eGFP（6.7 kb），（c）新开发的质粒Zif-VP64-Ep1（10.5 kb），其中包含两个单独的表达盒pCMV- eGFP-S / MAR和pCMV-Zif-VP64（d）控制质粒Zif-VP64-eGFP（8.1 kb）缺少S / MAR序列，（e）新开发的质粒Zif-VP64-Ep2（11.1 kb）两个单独的表达盒IR-pSFFV-eGFP-S / MAR和pSFFV-Zif-VP64。
构建的第二个载体Zif-VP64-Ep2（图 1d）携带Zif-VP64-Ep1载体的两个相同的转录盒，但在两种情况下启动子CMV均被启动子SFFV取代，以确保CD34 +细胞。此外，此载体还携带新的染色体元素，即β-珠蛋白复制子，即“ IR”，它是源自人β-珠蛋白簇的复制起始区（IR），并且为了增强DNA的完整性而添加了它。质粒的复制能力9，45。
构建的载体Zif-VP64-eGFP（图 1e）不含S / MAR和IR元素，在K562转染中与载体Zif-VP64-Ep1一起用作对照。
为了产生稳定转染的细胞池，质粒Zif-VP64-Ep1用于从人骨髓性白血病细胞株K562的生长细胞培养物中转染细胞。K562细胞组成性表达胚胎ε-和胎儿γ-珠蛋白，但不表达成人β-珠蛋白基因54。因此，目的是测试转染的长期培养物中胎儿γ-珠蛋白的增加。
用载体Zif-VP64-Ep1和对照质粒Zif-VP64-eGFP进行三重转染，转染效率分别平均为46.3±5.2％（图 2a）和48.1±1.3％。转染后二十四小时，应用遗传霉素（G418）进行选择，两周后获得Zif-VP64-Ep1和对照载体的转染培养物。此时，将培养物分为两部分，一部分保持连续选择（G418 +），而另一部分保持不选择（G418-）。平行培养未选择和未选择的未转染细胞。在没有选择的情况下生长的细胞培养物中添加了G418，并再培养一周，以测试G418的抗性。
在转染的K562细胞中，载体Zif-VP64-Ep1的eGFP表达和游离状态的文献记录。所有实验均重复三次。（a）转染后19周未转染的K562细胞（上图），转染Zif-VP64-eGFP对照载体转染的K562细胞，转染后6周（中间图片）和转染Zif-VP64-Ep1的K562细胞转染后19周的质粒（-G418）（下图）。结果显示于荧光显微镜检查（左栏），相差（中间栏）和流式细胞仪，给出了估计的荧光转染细胞百分比（右栏）。y轴记录细胞计数，x轴记录FL1-eGFP荧光。（b）直方图显示基于流式细胞仪测量的eGFP表达。（Ep1）K562细胞转染了实验载体Zif-VP64-Ep1，在转染后的不同时间（第2,6、19、22、25周，用（+）或（-）在没有选择压力（G418）的条件下培养的K562细胞， 28）; （否）表示未转染的K562细胞和（ct）用Zif-VP64-eGFP对照载体转染的K562细胞。（c）PCR检测K562细胞DNA提取物（转染后6周）（M）噬菌体Lambda DNA- Pst I; 所有四个1、2、3和4运行均涉及使用eGFP引物（扩增片段大小为350 bp）的PCR反应，所有四个5、6、7和8运行均涉及使用β-珠蛋白引物的PCR对照反应（扩增片段大小为453） bp）；（1，5）未转染的K562细胞；（2，6）和（4，8）从Zif-VP64-eGFP转染的K562细胞，来自两个不同的PCR反应；（3，7）用Zif-VP64-Ep1转染的K562细胞。（d）具有限制性分析的质粒拯救实验。Zif-VP64-Ep1 DNA载体用作转染的输入载体（7、8、9），以及从转染后19周的Zif-VP64-Ep1拯救质粒的HIRT提取物转化的大肠杆菌菌落中制备的DNA （1、2、3、4、5、6）。使用的限制酶是NotI，PciI，NheI。（1、4、7）表示对NotI的限制，（2、5、8）表示同时对NotI和PciI的限制，（3、6、9）的NheI（M）表示在两种情况下的λHindIIIDNA标记。（e）在补充了G418的连续培养22周后，通过荧光原位杂交（FISH）分析了用载体Zif-VP64-Ep1转染的K562细胞。显示了代表性的相间（左）和中期（中间）的扩散。绿色箭头显示Zif-VP64-Ep1质粒为游离状态的游离体，红色箭头显示内源的13q14对照基因座，给出双绿色和红色信号。
结果显示在图 2中，首先，确定了未转染的细胞在G418存在下不生长（图 2a，b）。通过使用G418选择携带控制质粒Zif-VP64-eGFP的细胞（有关详细信息，请参见“方法”），但是在分离培养物后，保留在选择中的部分将不会产生稳定转染的长期细胞培养物。取而代之的是，它逐渐消失，并在第6周有效地灭绝。在没有G418的情况下生长的部分培养物继续生长，但在第6周时其荧光消失了。第6周，由于没有质粒，这些培养物消失了（图 S1在补充信息中）。同时，使用eGFP的引物，对在不存在G418的情况下生长的细胞的DNA进行PCR，未检测到载体质粒（图2c），这表明该细胞不具有荧光性，因为它们缺少 载体和不是因为转基因沉默。
相比之下，携带质粒Zif-VP64-Ep1的细胞形成完全生长的，稳定转染的培养物，无论是否选择G418（图 2b），这证明S / MAR元件是载体的必要和充足部分。在K562细胞中形成稳定的长期培养。
在培养的第28周时，发现长时间未选择生长的细胞仍然对G418具有抗性（图 2b），这些数据表明基于S / MAR的质粒Zif-VP64-Ep1能够支持转染的K562细胞稳定，长期的培养，这是开发反式γ-珠蛋白激活剂VP64附加型载体的第一步。
用载体Zif-VP64-Ep1稳定转染的K562细胞用于确定该载体作为附加体在转染细胞中的状态。使用由Hirt提取物从重复培养物中培养5、19和28周的质粒DNA进行质粒拯救测定以检测游离载体质粒。Hirt提取物的DNA用于转染感受态大肠杆菌细胞，并出现菌落（每种情况下为3-5个），这表明Hirt提取物中包含完整的环状质粒分子。转染K562培养物第 19 周的结果（图 2c）显示，大肠杆菌中的DNA克隆与用于转染K562细胞的载体Zif-VP64-Ep1的输入DNA具有相同的限制模式，因此它是同一质粒。这表明载体Zif-VP64-Ep1保持为游离的环状DNA分子，能够在各自转染的K562细胞培养物中稳定复制并具有稳定的有丝分裂分离。
应用荧光原位杂交（FISH）研究将载体Zif-VP64-Ep1整合入K562细胞内源遗传物质的可能性。结果显示（补充信息中的图 2d和S2），在检测到的50多个中期细胞中，没有检测到整合事件，该事件被检测为同一染色体中质粒的双信号克隆，仅检测到一两个细胞。在随机位置检测到每个细胞的拷贝数。这得出结论，基于eGFP荧光的数据来自自由的环状DNA分子，而不是来自整合质粒拷贝的克隆。
这很重要，因为它提供了向量电势的度量。对于这种估计，我们施加的绝对定量分析（见材料和方法）和质粒拷贝数被发现为每细胞2.4±0.2用于在16 G418 +条件生长培养第培养一周。这在质粒9的大小的预期范围内。此外，根据该结果，FISH分析（补充信息中的图 2e和S2）显示每个细胞存在一个或两个质粒拷贝。
在稳定转染的K562细胞中研究了Zif-VP64-Ep1载体中γ-珠蛋白激活物VP64的转基因表达。
结果是肯定的这种活化剂的存在，如mRNA的对于ZIF-VP64在从转染的细胞从转染，每3周中分离的总RNA中检测到，通过一步RT-PCR，并且被示出为21的代表性实验ST周（图 3a）。此外，ZIF-VP64肽结合其目标位置的能力，在启动子即“GG1”位点甲 γ珠蛋白基因，在K562细胞（3周后转染），通过染色质免疫沉淀在两个独立的转染测试分析（ChIP）（图 3b）。这是通过使用针对Zif-VP64的特异性抗体，随后进行PCR反应，使用针对A处结合DNA序列的特异性引物进行的γ基因启动子。在本文中记载的是，ZIF-VP64肽，通过附加型载体产生的，结合于甲 γ珠蛋白启动子，从而实现了必要的先决条件γ球蛋白活化。
K562细胞中转基因的表达和γ珠蛋白基因的诱导。所有实验均重复三次。在转染的K562细胞中Zif-VP64转基因表达的文献：（a）在巢式PCR中用TF3 / TF4引物对RT-PCR反应产物（TF3 / TF4）进行电泳。（1）K562细胞，（2）用载体Zif-VP64-Ep1 + G418转染的K562，（3）用载体Zif-VP64-Ep1-G418转染的K562，（4）Zif-VP64-Ep1 + G418无逆转转录酶，（5）没有逆转录酶的Zif-VP64-Ep1-G418，（6）Zif-VP64-Ep1，（7）和（8）H 2O.（GAPDH）用GAPDH-F / R引物对RT-PCR反应产物进行电泳（9）K562细胞，（10）用载体Zif-VP64-Ep1 + G418转染的K562，（11）用载体转染的K562 Zif-VP64-Ep1-G418。（M）两种情况下的FX / HaeIII摘要。Zif-VP64转录因子与γ-珠蛋白启动子的特异性结合的证明：（b）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：（抗Zif-VP64 IgG）用抗Zif-VP64 IgG免疫沉淀的染色质，并用Chip_F / R引物扩增部分γ-珠蛋白启动子，用Zif-VP64转染的K562细胞-Ep1载体，转染后3周（1）+ G418和（2）–G418，（3）未转染的K562细胞；（抗乙酰基H3 IgG）染色质用抗乙酰基Histine H3 IgG免疫沉淀，并用转染后3周的Zif-VP64-Ep1载体从转染的K562细胞中用GAPDH_F / R引物扩增GAPDH基因。（4）+ G418和（5）-G418，（6）无DNA基质的PCR，（7）非穿透的K562细胞和（M）PCR标记NEB。Zif-VP64-Ep1转染的K562细胞中的γ-珠蛋白诱导：（c（RT-qPCR估计）在连续培养4至10周内，用Zif-VP64-Ep1质粒（K562 Zif-VP64-Ep1）转染的K562细胞中γ-珠蛋白mRNA表达。值针对未转染的K562细胞（K562）进行归一化，取1。（d）用Western印迹分析法分析了用Zif-VP64-Ep1质粒转染的来自K562细胞的γ-珠蛋白。（1、2）K562未转染的细胞，用Zif-VP64-Ep1转染的K562细胞（3）5周和（4）15周连续培养。（e在连续培养的第15周，通过流式细胞术通过细胞内染色估计了从Zif-VP64-Ep1质粒转染的K562细胞（K562 Zif-VP64-Ep1）（左栏）获得的HbF蛋白。对未转染的K562细胞进行了标准化（K562）（中栏）。第15周，转染的K562细胞Zif-VP64-Ep1中eGFP的表达，如流式细胞术所记录，给出了荧光eGFP +转染细胞的估计百分比（右列）。y轴记录细胞计数，x轴记录FL1-eGFP荧光。
K562 54细胞对于11号染色体而言一式三份，并表达γ-珠蛋白。预期质粒Zif-VP64-Ep1的转移可能会导致γ-球蛋白的诱导，从而导致这些细胞中稳态γ-球蛋白mRNA的数量增加。所获得的数据清楚地表明，在所有测试的情况下，转染细胞与未转染细胞中的γ-珠蛋白表达均明显增加。通过RT-qPCR评估产生的γ-珠蛋白mRNA增加3.3±0.13倍（图 3c）；通过蛋白质印迹分析（第 14 周）检测到的γ-珠蛋白肽（图 3d和S3补充信息中的HbF蛋白增加了6.75±3.25倍（通过Image J应用的Western blot胶片定量结果），第15周通过细胞内染色估计的HbF蛋白（图 3e）增加了2±0.2倍。
因此，证明游离型载体Zif-VP64-Ep1具有长期支持K562细胞中γ-珠蛋白基因的功能性诱导物的产生的能力。
在下一轮实验中，我们使用了包含整个人类β-珠蛋白基因位点（248 kb）的小鼠原代造血祖细胞作为酵母人工染色体47。这是一种多能细胞系，通过添加适当的生长因子，可以产生单核细胞，嗜中性粒细胞和类红细胞，而培养可以维持一年或更长时间。鼠类β-YAC转基因细胞具有成年人类β-球蛋白基因座基因表达的特征，因为它们表达β-球蛋白基因，但不表达γ-球蛋白基因。这项研究还通过RT-qPCR证明了这些细胞中γ-珠蛋白mRNA的缺乏（图 S4在补充信息中）。因此，它们是测试沉默的γ-珠蛋白基因重新激活的良好模型。为了这个目的，这里仅在最长7天的时间里研究了鼠β-YAC转基因细胞中的转染，因此不能用于评估S / MAR在这些载体-细胞状况中的作用。
用质粒Zif-VP64-Ep1进行了鼠β-YAC转基因细胞4次复制的转染，转染效率为23.0±2.1％（图 4a）。多重RT-PCR用于定性研究的第一个定性文献：（a）转染细胞中的γ-球蛋白再活化以及人β-和小鼠α-球蛋白mRNA，以及（b）缺少γ-球蛋白mRNA非转染细胞。在第2、4和7天后，在这些细胞中检测到γ-珠蛋白mRNA的重新激活（图 4b）。
Zif-VP64-Ep1转染的β-YAC细胞中eGFP表达和人类γ-珠蛋白激活的文献。（a）转染后4天未转染的β-YAC细胞（上图）和用Zif-VP64-Ep1质粒转染的β-YAC细胞（下图）。结果显示于相差（右列），荧光显微镜（左列）和流式细胞仪中，给出了估计的荧光转染细胞百分比（右列）；y轴记录细胞计数，x轴记录FL1-eGFP荧光；（b）针对人γ-球蛋白（γ-Hu），人β-球蛋白（β-Hu）和小鼠α-球蛋白（α-Mo）mRN的多重RT-PCR；（1）未转染的β-YAC细胞，（2、3、4）在培养2、4和7天后用Zif-VP64-Ep1和（M）PCR标记NEB转染的β-YAC细胞；（c用Zif-VP64-Ep1转染7天的人γ-球蛋白（γ-Hu），人β-球蛋白（β-Hu）和小鼠α-球蛋白（α-Mo）mRNA表达的RT-qPCR转染后的培养物（β-YACZif-VP64-Ep1）相对于未转染的β-YAC（β-YAC）标准化。显示了统计显着性的结果（所有<0.05值）。
为了估计转染的鼠B-YAC转基因细胞中γ-球蛋白的表达，应用RT-qPCR并确定γ-球蛋白mRNA相对于人β-球蛋白和小鼠α-球蛋白之一的相对量。结果表明，这些细胞中产生的γ-珠蛋白mRNA的水平分别比人β-珠蛋白mRNA或小鼠α-珠蛋白mRNA的水平分别高出约21.9±8.4％和25.6±3.9％，这些值具有统计学意义（图 4c）。人β-珠蛋白mRNA和小鼠α-珠蛋白mRNA的mRNA产生量相当相等（图 4c）。这些结果表明，附加型载体Zif-VP64-Ep1可以支持沉默的γ-珠蛋白基因的重新激活，其程度可以表明所产生的γ-珠蛋白肽的治疗水平。
人类造血祖细胞CD34 +细胞正在产生γ-珠蛋白mRNA。它们从总的单核细胞，脐带血中分离出来，并通过核转染用于转染。每个载体在CD34 + 细胞中的转染 均进行4次重复。对照载体Zif-VP64-eGFP能够以转染后48小时测得的效率转染CD34 +细胞，效率为21.8±4.0％，但与在K562细胞中转染相反，细胞在24小时后无荧光，共72小时转染（表 1）。因此，该载体不能用作CD34 + 细胞集落形成试验（CFC）的对照。
在转染后48小时内测得的载体Zif-VP64-Ep1转染的CD34 +细胞的转染效率为24.2±2.4％（表 1）（图 5a）。转染后72小时，将这些转染细胞的总RNA用于通过RT-qPCR估算相对γ-珠蛋白mRNA，发现与γ-珠蛋白mRNA相比，其统计学上显着增加2.7±0.6％。未转染的CD34 +细胞（图 5b）。CD34 + / eGFP +将通过荧光激活细胞分选（FACS）分选的细胞置于菌落形成细胞培养物（CFC）中，以研究其形成菌落的能力以及质粒在产生的菌落中的保留程度。在这些培养物中出现菌落，但是它们都是非荧光的（图 6b和表 1）。这是相当可预期的，因为在CD34 +细胞中，启动子CMV不支持eGFP基因的转录，也不支持通过S / MAR元件的转录，这是S / MAR元件发挥其质粒保留功能的必要条件，如图所示在以前的研究中8。因此，在CFC培养物中，载体Zif-VP64-EP1不能用作估计CD34 +细胞中γ-球蛋白诱导的对照。
Zif-VP64-Ep1转染的CD34 +细胞中eGFP表达和γ-珠蛋白诱导的文献。实验一式四份进行。（a）转染后48小时和FACS分选之前的eGFP表达；荧光显微镜（左列）和相差（中间列）以及流式细胞仪检测得到的荧光CD34 + / eGFP +转染细胞的估计百分比（右列）。y轴记录细胞计数，x轴记录FL1-eGFP荧光；（b）γ珠蛋白mRNA表达的CD34 +转染的细胞与ZIF-VP64-EP1质粒（CD34 +Zif-VP64-Ep1）转染后72小时-FACS分选后24小时-通过RT-qPCR估算。值针对未转染的CD34 +细胞进行标准化，绘制为1。
将载体Zif_VP64-eGFP，Zif-VP64-Ep1和Zif-VP64-Ep2转染到CD34 +细胞中的结果。转染后48小时，通过FACS分选转染的CD34 +细胞。（a）在转染后72小时，携带Zif-VP64-Ep2（右）和Zif VP64-eGFP载体（左）的CD34 +细胞中记录的eGFP表达。从相差（上列）和荧光显微镜（下列）显示结果。（b）在FACS分选的CD34 + / eGFP +细胞从CD34 +的半固态培养（14天）中，通过CFC分析得出的菌落中eGFP表达的记录Zif-VP64-Ep1对照载体（左）或Zif-VP64-Ep2载体（右）转染72小时后的细胞。上排：来源于CFC分析的菌落，Zif-VP64-Ep1和Zif- VP64-Ep2向量。下排：荧光显微镜显示仅用Zif-VP64-Ep2载体转染的菌落。（c）在用Zif-VP64-Ep2 转染的CD34 + / eGFP +细胞的CFC测定中得到的菌落中eGFP表达的文献。从FAC分选的CD34 + / eGFP +转染Zif-VP64-Ep2细胞的CFC培养菌落（14天）的mRNA提取物中的RT-qPCR（用于克隆γ-珠蛋白mRNA）（CD34 +Zif-VP64-Ep2）。针对未转染的CD34 +细胞的菌落（未转染的CD34 +的菌落），将值标准化。
第二个附加型载体Zif-VP64-Ep2，带有“ IR”元件以及转录盒SFFV-eGFP-S / MAR，带有允许CD34 +细胞启动子SFFV，用于转染相似的CD34 +细胞，并进行转染效率为23.3±1.7％（图 6a）。FACS分选的CD34 + / eGFP +细胞置于菌落形成细胞（CFC）分析中，该细胞是具有细胞因子的半液体培养物，从CD34 +造血祖细胞中产生BFU-E和CFU-GM分化的菌落（表 1）。
分选后14天的C FC培养物给出的菌落在所研究的所有四个重复培养物中均具有荧光（图 6b和表 1）（表 1）。与未转染的CD34 +细胞相比，这些菌落中γ-珠蛋白mRNA的估计值统计上显着增加了2.11±0.13倍（图 6c）。
这些数据再次表明，必须存在S / MAR元件，并且还必须将其转录以便执行其质粒保留功能。具体而言，它们显示包含两种元素（即转录的S / MAR和IR元素）的附加型载体能够从转染的造血祖细胞衍生的集落形成细胞（总共17天）产生100％转化的，荧光的集落。 CD34 +细胞。
基于S / MAR和IR染色体元件的载体已被开发，能够转染的K562细胞，鼠β-YAC细胞和人造血细胞CD34 +与是令人满意的，预期它们的大小的范围内的效率55，56。这些载体（a）描绘了附加型载体的所有特性，并且（b）介导了所有测试细胞中合成，特异性和功能性γ珠蛋白活化剂的有效生产。
（一种）
能够介导质粒的长期核保留和转基因表达并在细胞中以游离，环状分子形式存在而没有可检测到的整合到细胞染色体中的游离体被认为是有能力的游离体，因为它们已经获得了地位自主复制子的该期间的连续有丝分裂复制与每有丝分裂稳定性的细胞周期，分离到子代细胞一旦6，7。质粒保留的效率各不相同，并可能取决于通过S / MAR元件57的转录水平。所描述的载体是感受态附加体的证据来自其转移入K562和CD34 +细胞的实验。
用载体Zif-VP64-Ep1在K562细胞中进行稳定转染表明，S / MAR元件是感受态载体的必要部分，因为缺少S / MAR元件的对照载体Zif-VP64-eGFP无法产生稳定的转染。质粒拯救试验和FISH分析的组合数据表明，在整个培养的28周中，载体Zif-VP64-Ep1在转染的K562细胞中保持游离环状分子的游离状态，未检测到整合。质粒整合到真核细胞基因组中是罕见的事件，认为是由双链断裂引发的，导致形成多聚体级联体，可以通过“合成依赖性，微同源介导的末端连接”插入基因组中。 （SD-MMEJ）修复机制，目前尚不了解58，59。在这种情况下，缺乏对载体Zif-VP64-Ep1整合的检测表明该载体的DNA不能促进这一过程。在相同的稳定转染中，计算得出每个细胞有2.4±0.2个质粒拷贝。在图 2d所示的此类细胞的FISH分析中 ，在补充信息中，仅检测到一个质粒拷贝，而在图 S2中每个细胞检测到2个质粒拷贝 。该拷贝数值在基于S / MAR的向量的预期范围内，估计每个单元2到12个拷贝之间 56，较低的百分比表示较大的向量。此处估算的值是指用G418选择的稳定转染的K562培养物。但是，在有和没有G418的培养物中，每细胞的拷贝数没有明显的差异，主要是基于连续28周培养过程中eGFP的表达（图 2b）。
这些数据得出的结论是，在人类造血K562细胞中，记录的荧光水平和转基因表达水平以及计算出的每细胞载体拷贝数代表了功能性，自主复制的环状附加体的结果。这是特别重要的，因为这两个特性的结合，即非整合和在游离环状质粒中的存在，构成了附加体必须满足的基本要求，才能成为病毒载体的有效替代品。
用载体Zif-VP64-Ep1 转染CD34 +细胞是短暂的，因为FACS分选的CD34 + / eGFP +细胞在CFC分析中产生了菌落，但培养14天后它们都没有荧光。非荧光菌落不携带载体拷贝，大概是因为转录通过盒CMV-EGFP-S / MAR已经逐渐减少，其结果，S / MAR不再执行其质粒保持功能8，9。
第二个载体Zif-VP64-Ep2包含转录盒SFFV-eGFP-S / MAR，其中SFFV启动子可确保CD34 +中的转录。来源于CD34 +转染的CD34 + / eGFP +细胞，来自用载体Zif-VP64-Ep2进行的CD34 +转染，在CFC分析中产生了集落，这些集落全部是荧光的。这个重要的结果，即CFC培养物中的100％荧光菌落，也已经在先前的研究中得到了证明9，特别是CD34 +携带相同转录盒SFFV-eGFP-S / MAR的载体（pEPI-SFFV，不带IR元件）的转染，支持在CFC分析中产生菌落，其中只有50％具有荧光，证明S / MAR不仅应存在，而且还应转录以支持质粒的核保留。在同一工作中，包含相同转录盒SFFV-eGFP-S / MAR以及IR元件的另一种载体（pEP-IR）支持在CFC培养物中产生全部（100％）荧光的菌落9。确切地，该结果也记录在本文报道的工作中，其中100％的荧光菌落是由携带Zif-VP64-Ep2载体的细胞产生的。在这两种情况下，转录的S / MAR元件与IR元件在同一载体中共存，伴随着载体的完全保留和转基因在100％源自转染的CD34 +的菌落中的完整表达。
严格来讲，CFC培养物中菌落的出现本身并不意味着该载体的长期保留，需要在长期培养中进行验证。然而，这表明该载体已经达到自主复制子的状态，这通过很大程度上未知且仍在研究中的过程促进了载体的建立，从而导致稳定的转化。
因此，据证明，在确保通过S / MAR元件转录的条件下，载体Zif-VP64-Ep1和Zif-VP64-Ep2是感受态附加体。此外，带有IR元件的载体Zif-VP64-Ep2还能够在CFC培养物中产生全部发荧光的菌落，这表明它完全有能力将基因转移到CD34 +中。
（b）
所描述的载体介导合成，特异性和功能性γ-珠蛋白激活剂有效生产的证据来自于它们对所有三种类型细胞的转移。
载体Zif-VP64-Ep1支持反式作用因子VP64产生的能力在K562细胞的mRNA和肽水平稳定转染中得到了证明。该载体在K562细胞和鼠β-YAC细胞中充当特异性的γ-球蛋白激活剂（图 3和4）。三次重复，实时定量PCR检测β-YAC细胞中γ-球蛋白mRNA的产量，并确定相对于同一细胞中人β-球蛋白和小鼠α-球蛋白的相对量，表明该估计水平可用于治疗意义。此外，该实验验证了先前报道的病毒转移47对相同细胞和相同活化剂作用于沉默的异染色质状态所获得的结果。
Zif-VP64-Ep1和Zif-VP64-Ep2这两种载体都可以分别激活CD34 +细胞，处于瞬时状态和来自CD34 + / eGFP +细胞的CFC集落中的γ-球蛋白。在所有情况下，与未转染的细胞相比，这种活化导致γ-珠蛋白mRNA的增加2倍以上，可以认为具有治疗意义。
有两点值得关注，即载体结合的特异性和所用载体可能引起的毒性。
首先，通过理论分析设计和开发了gg1-VP64反作用因子，使其在CD34 +细胞46中进行病毒转移后具有与靶标底物的高特异性结合。这被记录在这里为矢量ZIF-VP64-EP1在稳定转染的K562细胞中通过ChIP分析，并且发现该肽VP64被选择性地结合到靶序列GG1，在甲 γ启动子。
其次，据报道轻度的毒性反应是gg1-VP64慢病毒转导的成年幼细胞CD34 +细胞的成年细胞生长的适度降低，这种细胞来源于正常人和地中海贫血患者50。这归因于在转导的培养开始时gg1-VP64的转录盒的高表达，导致存在过量的肽。使用较温和的类红细胞特异性β-血影蛋白促进剂可降低毒性而不影响HbF的诱导。在我们的研究中，未观察到用含有转录盒CMV-Zif-VP64的载体Zif-VP64-Ep1转染的K562细胞的生长减少。此外，这些培养物中每个细胞的拷贝数估计为2.4±0.2每个细胞的每一个都处于光谱的低端，并且预计不会导致转基因的非常高的表达。
因此，表明游离型载体Zif-VP64-EP1和Zif-VP64-EP2能够介导有效激活剂VP64的胞内产生，然后激活天然位置的γ-珠蛋白基因。三种类型的测试电池。这些结果再现忠实先前与使用病毒载体获得的那些3，46，47，50。
这些数据可能来自附加型载体中S / MAR和β-珠蛋白复制子之间可能存在的协同作用，因为这两种源自人类基因组的染色体元素S / MAR和β-珠蛋白复制子（IR）带来了附加型载体的特定特性。
S / MAR，已被广泛研究的一种元素，已知介导附加体与核基质蛋白SAF-A的结合，促进附加体的保留，从而可能获得自主复制子的状态，随后是矢量建立60，61。最近，使用基于S / MAR的复制子62绘制了HeLa细胞基因组中外源性游离DNA的接触位点并进行了表征。据证明，基因组接触位点受复制子中掺入的基因组顺式作用序列的影响，并且靠近潜在的复制起点。
另一方面，IR是真正的哺乳动物复制起点，是一种新近使用的染色体元件，到目前为止，作为三个不同的附加型载体的一部分，它们都带有S / MAR元件，已被研究。首先，发现载体pCEP4 / CNV-eGFP-S / MAR向Jurkat细胞的转移未能产生稳定转染的细胞池，但通过将IR元件插入该载体，可以通过转染形成稳定的转染。发挥强大的染色质开放活性促进DNA复制45。其次，将IR插入用于转染造血CD34 +细胞的载体pEP-IR（SFFV-eGFP-S / MAR）中，在FACS分选的CD34 + / eGFP +的 CFC检测中增加了荧光菌落的数量从没有IR 9的 50％增加到100％。第三，在本研究中，携带相同转录盒SFFV-eGFP-S / MAR和IR元件的载体Zif-VP64-Ep2，再次在CFC分析中的所有菌落都是荧光的（100％）。
显然，在相同的附加体中存在强烈的复制起点IR和质粒的强保留元件S / MAR，对载体的功能产生了积极的影响。根据Hagedorn 等人提供的数据。最近，我们认为IR可能是基因组，顺式-复制子中包含S-MAR元件的作用序列，其可以积极影响同一复制子中S / MAR元件的功能。好像同一复制子中S / MAR和IR的共存在两个元件之间产生了协同作用，这增加了复制子在特定核区中建立的可能性，转染后载体落在该核区上。因此，IR是一种染色体元件，在将基因转移到造血细胞中后，它肯定会促进基于S / MAR的附加型载体的功能。
载体Zif-VP64-Ep2的许多进一步研究的可能性。首先，令人感兴趣的是看看载体Zif-VP64-Ep2是否可以转染β-地中海贫血和/或SCD患者的iPS细胞，因为iPS细胞适合培养，并且目前已用于许多临床前研究中。 。
其次，将这种载体转移到疾病小鼠模型中以确定其临床翻译潜力的临床前研究至关重要。但是，存在递送问题，因为质粒转移到小鼠祖细胞中的转染效率水平低下9。解决此问题的有效选择是将游离型质粒克隆到非整合型病毒载体的基因组中，其中已经证明S / MAR可赋予载体18长期核保留。此外，通过促进通过核孔的运输或通过细胞周期同步，可以在增强电转染的环境中促进质粒DNA的转移，从而改善核的进入。63。最后，重新设计当前向量的结构以产生较短但同样有效的向量可能是第一步，也是必要步骤。
总之，已经获得了用于人工γ-球蛋白基因激活剂的游离型载体，其能够介导具有允许产生γ-球蛋白肽的基因表达程序的造血细胞起源的细胞中的γ-球蛋白基因激活。 K562细胞和祖细胞CD34 +以及其中γ-珠蛋白基因失活的细胞，例如鼠类β-YAC细胞。与病毒载体一样，每种情况下的γ-珠蛋白活化都达到治疗水平。所使用的载体表现了安全有效的基因转移所必需的附加型载体的性质，例如作为游离环状质粒的长期核保留，长期表达和无整合检测。重要的是，CD34 +中的转染细胞显示出异常阳性的结果，支持CFC培养物中菌落的100％荧光。认为这些性质是由在各自载体内协同存在的染色体元件S / MAR和β-珠蛋白复制子赋予的。这些特性以及附加型载体易于生产和成本效益的考虑，使其成为开发用于基因治疗目的的下一代载体的极佳候选者。
脐带血中的CD34 +细胞来自雅典生物医学研究基金会的希腊脐带血库（BRFAA）。该方案已由BRFAA机构审查委员会（IRB）和机构伦理委员会审查和批准。
质粒Zif-VP64-Ep1（10.5 kb）（图 1c）是通过用NciI限制酶消化pEPI-eGFP载体（6.7 kb）（图 1b）创建的，该酶消化了CMV启动子上游和下游的质粒S / MAR元件，以释放带有粘性末端的pCMV-eGFP-S / MAR盒。使用限制性内切酶NciI将衍生的pCMV-eGFP-S / MAR盒连接到线性化质粒pcDNA3-Zif-VP64（6.1 kb）（图 1a），该酶消化pSV40 ori上游的质粒。
质粒Zif-VP64-Ep2（11.1 kb）（图 1d）的创建如下。首先，通过用SFFV启动子替换CMV启动子（SFFV-Zif-VP64-Ep1），从Zif-VP64-Ep1载体获得了一个新的中间质粒。通过DraIII将质粒SFFV-Zif-VP64-Ep1线性化，并且通过用Klenow酶处理使所得分子成为平末端，并且通过DNA磷酸酶（南极磷酸酶，NEB）将其脱磷酸化。然后，在限制性内切酶Mlu I和Pci的作用下，从pEP-IR载体9中去除具有“ IR-SFFV-eGFP-S / MAR-SV40 polyA”转录盒的片段。我，并通过用克列诺酶处理使末端变钝。最后，将两个片段SFFV-Zif-VP64-Ep1和IR-SFFV-eGFP-S / MAR-SV40 polyA连接起来，用于细菌转化（DH5-α 大肠杆菌）。分离得到的菌落并分析以获得载体Zif-VP64-Ep2。
控制质粒Zif-VP64-eGFP（8.1 kb）（图 1e）通过删除带有AccI限制酶的S / MAR元件而从Zif-VP64-Ep1（10.5 kb）衍生，该酶具有在S /上游和下游的识别位点MAR元素。
在补充有10％FCS，2 mM L-谷氨酰胺，50 U / ml青霉素和50 mg / ml链霉素的DMEM（Gibco）中培养人类红白血病K562细胞。使用GenePulserII（英国BioRad Hemel Hempstead）通过电穿孔转染K562细胞。将至少1×10 6 K562细胞与10–15μg质粒DNA混合，添加到0.4 cm电穿孔比色皿（BioRad，Hemel Hempstead，英国）中，并在220 V，975 mF（t：24.1–26.7）下电穿孔。电穿孔后，立即将细胞添加到10 ml预热的完全培养基中，并在5％CO 2中于37°C孵育转染后24小时，通过以800 mg / ml的浓度在培养基中添加遗传霉素（G418）（Invitrogen，Carlsbad，CA）选择转染的细胞。14-19天后，将稳定转染的细胞和选定的细胞一分为二，然后用G418（浓度为400 mg / ml）或不使用G418进行进一步培养。
β-YAC细胞47在IMDM（Iscove's Modified Dulbeccon培养基）中培养，该培养基中添加了10％热灭活的FCS，2 mM L-谷氨酰胺，1x HEPES，1x MEM（非必需氨基酸）和3.16 mM解聚试剂AP20187（ARIAD）在46前描述。所有试剂均购自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。用GenePulserII（英国BioRad Hemel Hempstead）电穿孔转染β-YAC细胞。将3.75×10 6的细胞悬液（最终体积为500μl）与10–15μg质粒DNA混合，添加到0.4 cm电穿孔比色皿（BioRad，Hemel Hempstead，英国）中，并在250 V，350μF（t ：07.8-09.8毫秒）。电穿孔后，立即将细胞加入5 ml预热的完全IMDM培养基中，并在5％CO中于37°C孵育2.还通过“ 体内转染试剂ExGen500”（Fermentas）转染了β-YAC细胞，使用了2×10 6个 β-YAC细胞和10–15 µg 10–15μg 质粒DNA在150 mM NaCl中。如46所述，终浓度为10μg/ ml 。两种用于β-YAC细胞转染的技术均成功。
通过使用Miltenyi CD34 MultiSort试剂盒（Miltenyi Biotec，Gladbach）的组合通过梯度分离（1.077 g / ml Ficoll-Paque，Biochrom AG，德国）和免疫磁选择从低密度单核细胞（MNC）中分离CD34 +细胞，并按照制造商的说明使用LS色谱柱（Miltenyi Biotec，德国Bergish Gladbach）。在所有制剂中，通过流式细胞术计数，CD34 +细胞频率超过98％。CD34 +细胞的培养浓度为2–5×10 5IMDM中的细胞数/ ml，并添加10％FCS，并补充了重组人（rh）细胞因子：20 ng / ml rh干细胞因子（SCF），50 ng / ml rh血小板生成素（TPO）和50 ng / ml rh Flt-3配体（FL）（完全无血清培养基）。细胞培养试剂购自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德），重组细胞因子购自BioSource（比利时尼维尔斯）。CD34 +细胞通过核转染，使用Amaxa公司NucleofectorII色器件（程序U008）与人CD34 +按照制造商的说明将细胞的Nucleofector溶液（Amaxa公司，科隆，德国）。
使用荧光素异硫氰酸酯二色滤光片作为滤光片，通过荧光显微镜（Nikon eclipse TE 2000）观察报告基因eGFP在转染细胞中的表达（激发在450–490 nm；发射在520 nm）。
用1x PBS洗涤两次后，大约3–5×10 5个细胞在EPICS-XL流式细胞仪（Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国）上进行了分析。洗涤大约5×10 5个细胞，并与抗CD34-藻红蛋白（PE）偶联的单克隆抗体（Pharmingen，BD，Erembodegen，比利时）一起在4°C下孵育30分钟。通过基于碘化丙啶（PI）（Pharmingen，BD）的门控排除了无活力的细胞。转染的细胞与如先前所描述的FACS Vantage的（BD，Erembodegen，比利时）进行分选8，64。在相应的结果部分中提供了每种细胞类型的eGFP和γ珠蛋白表达估计的时间和条件。
用Zif-VP64-Ep1（10.5 kb）稳定转染的K562细胞与pcDNA3-Zif-VP64（6.5 kb）质粒杂交，用作检测游离型和/或整合型转基因的杂交探针，并用荧光素-标记12-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸酯（Roche）。该程序以前有详细报道9。探针标记是根据制造商的说明，由Nick Translation Mix（Roche）进行的。对于内部对照，使用了DLEU（13q14）杂交探针，标记有荧光素-12-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸酯（罗氏）以及检测内源性的四甲基罗丹明-5-dUTP（罗氏） 13q14位点分别给出了双绿色和红色信号，如先前报道的64。总共分析了50个中期和相间的扩散。
如前所述，用改良的HIRT方案8从CFC分析中从90-120个菌落中分离出染色体外DNA，随机收集，合并并用1x PBS洗涤。HIRT提取物根据制造商的说明用于通过电穿孔法转化大肠杆菌 ElectroMax DH5a-ETM细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA），并使用含有30μg/ ml卡那霉素的LB-琼脂平板选择转化的大肠杆菌。 Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）。从单抗性菌落中提取的质粒DNA（QIAprep Spin Miniprep Kit，Qiagen，Hilden，德国）从随机选择的菌落中通过NotI，NotI x PciI和NheI进行限制性酶切分析 限制酶。
用Zif-VP64-Ep1转染并在G418存在下培养的1×10 6 K562细胞的总DNA 用AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit（Qiagen）分离，然后用RNase I（Promega）处理。使用QuantyiFast SYBER Green PCR（Qiagen）和LightCycler2.0（Roche）如下扩增100 ng的总DNA：在95°C下10秒，在60°C下30秒，40个循环。使用的eGFP DNA引物是：eGFP_F 5'-GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC-3'和eGFP_R 5'-GAA CTC CAG CAG GAC CAT G-3'（Invitrogen）。使用绝对定量分析（Light Cycler Software 4.05，Roche）进行拷贝数估算程序，如先前详细报道9。
RNA从1×10提取6 K562 cellswith的RNeasy ® Mini试剂盒（Qiagen）进行。提取的RNA在25℃下用DNA酶I（不含RNA酶的）（TAKARA）温育1个小时，用RNeasy试剂清理®，以清除剩余的DNA MinEluteCleanup试剂盒（Qiagen）。800-1000纳克RNA逆转录成cDNA PrimeScriptTM，1 第一链cDNA合成试剂盒与寡dT引物（Takara公司）。
用于检测Zif-VP64 cDNA的PCR反应中使用的引物是：TF-1：5'-ACTGCCGCGACCTTGCT-3'和TF-2：5'-CGGAACGTCGTACGGGTAGTT-3'（Τm= 55°C），嵌套引物TF-3：5'-TTCTCCCGCAGCGATCAC-3'和TF-4：5'-CCAAAGCACCTGGGTCTGA-3'（Τm= 55°C）。如前文46所述，人内源GAPDH基因GAPDH_F：5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTGA-3'和GAPDH_R：5'-CATGGACTGTGGTCATGAGT-3'（tm = 57°C）的引物。
使用0.25 u Taq聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA），0.5 pmol dNTPs（Fermentas，Hanover，MD）和0.25 pmol每种特异性引物（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行PCR反应。
为了检测γ-珠蛋白ggRNA，使用了一步RT-PCR试剂盒（Qiagen），其引物为ggRT_F：5'-GACAAGCTGCATGTGGATCCT-3'和ggRT_R：5'-CCGAAATGGATTGCCAAAAC-3'（Τm= 56°C）在46前描述。对于实时PCR，使用QuantyiFast SYBER Green PCR（Qiagen）和LightCycler2.0（Roche）扩增1/10和1/100 cDNA稀释液的步骤如下：在95°C下10秒，在60°C下30秒， 40个周期。
（Moa-globin）：5'-GATTCTGACAGACTCAGGAAGAAAC-3'和5'-CCTTTCCAGGGCTTCAGCTCCATAT-3'，人β-globin（Hub-globin）：5'-ACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCA-3'和5'-GGTTGCCCATAACAGCATCATCAGGAGT-3'，人γ珠蛋白（Hug-globin）：5'-GACAAGCTGCATGTGGATCCT-3'和5'-CCGAAATGGATTGCCAAAAC-3'和小鼠GAPDH基因（ΜοGAPDH）：5'-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3'κα15'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。
对于染色质免疫沉淀（ChIP）程序，根据制造商的说明使用EZChIP™染色质免疫沉淀试剂盒（Upstate）。该过程包括以下步骤：i。通过用37％甲醛（SIGMA）处理固定细胞裂解之前与DNA结合的所有转录因子；ii。裂解约1×10 7转染和等量的未转染的K562细胞，并分离纯化的染色质；iii。Sonics＆Materials Inc.的Sonicatoion-振动电池超声波探头电源，平均120 VAC，25 Hz，2安培，功率约为500 bp；iv。使用10μl特异性抗ZIF-VP64抗体对蛋白质/ DNA复合物进行免疫沉淀。作为对照，使用了由Chip kit提供的抗组氨酸抗体。从抗体/蛋白质/ DNA复合物中清除DNA，纯化并用作PCR程序中的模板，使用人类γ-球蛋白启动子的特异性引物：γ-ChIP_F：5'-GACTGAATCGGAACAAGGCAAAG-3'，γ-ChIP_R：5 '-TGTCCTCCTCTGTGAAATGACCC-3'（Tm = 60°C），对于人类GAPDH对照基因：G-ChipF：5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'，G- ChipR：5'-TCGAACAGGAGGGGAGCAGAGAGCGA-3'（Τm= 57°C ）。
通过直接在SDS / PAGE上样缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 6.8、2％SDS，10％甘油，50 mM二硫苏糖醇和0.1％溴酚蓝）中裂解细胞沉淀物并煮沸来制备总细胞裂解物。将所有蛋白质提取物溶解在10％SDS-PAGE凝胶中，然后电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（密理博，贝德福德，马萨诸塞州）上。用抗γ-球蛋白兔抗体1/500（SantaCruz Biotechnology，SantaCruz，CA）检测γ-球蛋白，用抗微管蛋白小鼠抗体1 / 10.000（Sigma-Aldrich Chemical Co.，St.密苏里州的路易斯）。
对于流式细胞术检测HbF（66.7 kDa）（细胞内染色，IS），根据细胞内染色说明，使用了藻红蛋白缀合的单克隆抗HbF-PE抗体（藻红蛋白，PE）抗体（Caltag Laboratories，Burlingame，CA）。在有选择压力和无选择压力的条件下培养后，将转染的K562 5×10 5细胞以及未转染的细胞悬浮于1x PBS中，与Cytofix / Cytoperm化学家（PharMingen）在40°C孵育20分钟，然后在使用BD 1 xPerm / Wash Buffer（BD Biosciences）复制。因此，加入了抗HbF单克隆抗体，并将细胞在40°C下孵育30分钟，然后用BD 1x Perm / Wash Buffer洗涤，并通过流式细胞术（使用FACS）对细胞悬浮液和HbF进行了分析65岁，66。
使用Student's t检验进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计学意义。
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