摘要
预计人类微生物组将以可再现和有序的方式组装，但对构成口腔微生物组的复杂细菌群落的发展知之甚少。口腔微生物组在许多口腔疾病中起主要作用，包括幼儿龋齿（ECC），在某些国家中，这种疾病困扰着70％的儿童。唾液中含有表明整个口腔微生物组的口腔细菌，并且可能具有反映龈上菌斑群落中的营养不良的能力，从而引发ECC的临床表现。这项研究的目的是确定生命的头四年中口腔微生物组的组装，并将其与ECC的临床发展进行比较。确定了参加出生队列研究的134名儿童的口腔微生物组，其年龄范围为两个月至4岁之间的六个年龄，并在单个时间点确定了母亲的口腔微生物组。我们通过对细菌16S RNA基因的V4区域进行测序，确定并量化了唾液中细菌的356个操作分类单位（OTU）。细菌α多样性从1.9个月大的婴儿唾液中的平均31 OTUs增加到39个月大的84 OTUs。随着孩子的成长，口腔微生物组的成分发生了明显变化。根据ICDAS-II评估，将微生物组数据与该年龄组39、48和60个月内ECC的临床发展进行了比较。我们通过对细菌16S RNA基因的V4区域进行测序，确定并量化了唾液中细菌的356个操作分类单位（OTU）。细菌α多样性从1.9个月大的婴儿唾液中的平均31 OTUs增加到39个月大的84 OTUs。随着孩子的成长，口腔微生物组的成分发生了明显变化。根据ICDAS-II评估，将微生物组数据与该年龄组39、48和60个月内ECC的临床发展进行了比较。我们通过对细菌16S RNA基因的V4区域进行测序，确定并量化了唾液中细菌的356个操作分类单位（OTU）。细菌α多样性从1.9个月大的婴儿唾液中的平均31 OTUs增加到39个月大的84 OTUs。随着孩子的成长，口腔微生物组的成分发生了明显变化。根据ICDAS-II评估，将微生物组数据与该年龄组39、48和60个月内ECC的临床发展进行了比较。随着孩子的成长，口腔微生物组的成分发生了明显变化。根据ICDAS-II评估，将微生物组数据与该年龄组39、48和60个月内ECC的临床发展进行了比较。随着孩子的成长，口腔微生物组的成分发生了明显变化。根据ICDAS-II评估，将微生物组数据与该年龄组39、48和60个月内ECC的临床发展进行了比较。变形链球菌是健康与当前疾病之间最有区别的口腔细菌，其疾病丰富度不断增加。总的来说，我们的研究表明口腔微生物组有序的暂时性发育，描述了有限的核心口腔微生物组，并表明婴儿的唾液检测可能有助于预测ECC风险。
幼儿龋齿（ECC）是一种复杂的，多方面的疾病，涉及口腔微生物区系，牙齿，口腔和人的宿主易感性以及环境因素之间的相互作用，尤其是与早期喂养方法，摄入游离糖和口腔卫生有关的行为1，2，3。ECC的定义是，六岁以下儿童的任何一颗乳牙中存在一种或多种蛀牙（非空洞或空洞的病变），缺失（由于龋齿）或牙齿表面（dmfs）4。澳大利亚四岁儿童的平均龋齿（dmft）得分为1.94 5。但是，该评分掩盖了疾病的真实模式和负担，因为接受检查的患者中有60％没有龋齿。此外，来自弱势和弱势家庭6的儿童过多地承担了与ECC相关的疾病负担。
尽管很大程度上可预防的ECC可能很难在其早期阶段进行诊断。空化是疾病过程的晚期阶段，最初表现为在从共生菌斑生物膜群落的菌斑微生物群的物种组合物是由产酸和耐酸物种主导的dysbiotic社区的变化7，8。虽然变形链球菌和在较小的程度远缘链球菌在历史上被链接到龋齿萌生最近基于微生物组研究已经牵连宽得多的范围的其它产酸和耐酸细菌种，包括其它链球菌，的放线菌属。和双歧杆菌，如Scardovia wiggsiae与疾病9，10，11。在横断面研究中，龈上菌斑中大量这些物种与龋齿活动有关12。因此，龈上菌斑微生物群组成变化的检测是在龋齿临床表现之前检测ECC风险的方法，并且提供了在早期阶段治疗龋齿的机会，以防止不可逆的空化。
ECC的细菌病因更加复杂，因为在牙齿萌出且易脱矿质的时候，细菌正在孩子的口腔中繁殖13。我们目前对细菌在人口腔中定植的时机和婴儿口腔微生物组的发育方面的信息有限14。唾液是一种容易获得的体液，其中包含大量可检测的口腔细菌，这些细菌有可能作为龈上菌斑中细菌营养不良的生物标记物，从而导致临床龋齿表现13。唾液的细菌组合物，而在表示那些细菌呈现口腔，特别是舌和颊上皮的粘膜表面上，已经被常规地用于描述口腔微生物14，15。通过更好地了解健康和疾病婴儿的口腔微生物组随时间的发展和行为，我们也许能够识别出患疾病风险最高的儿童，并在关键时间点制定干预措施，以更有效地预防疾病的发展和进展。
在这项研究中，我们使用纵向队列研究模型来表征134名儿童在两个月大至四个月的六个时间点的口腔微生物群，以及其母亲的微生物群。确定这些儿童中ECC的发病和进展情况，直至5岁。然后将口腔微生物组与临床结果进行比较。
成立于2008年婴幼儿/儿童的VicGen纵向队列研究，以遵循自然历史和检查婴幼儿龋（ECC）的致病因素16，17。参加者是通过其母亲从澳大利亚维多利亚州六个地方政府地区的妇幼保健中心招募的。在七个平均年龄（±标准偏差）下进行儿童的临床口腔检查，问卷调查和唾液收集-1.9±0.8、7.7±1.3、13.2±1.2、19.7±2.0、39.0±3.2、48.6±1.6和60± 1.8个月16，17。
墨尔本大学人类研究伦理委员会（HREC 0722543和HREC 1137124）提供了进行此项研究的伦理学批准，并且该研究得到了维多利亚州教育和幼儿发展部的批准（Ref：2008/202）。本手稿中描述的所有研究均根据相关准则和法规进行，并获得了所有参与者或其父母或法定监护人的知情同意。
在目前的嵌套研究中，对来自VicGen队列的134个儿童/母亲二联体的唾液样本进行了测序，以进行微生物学测定。他们是根据疾病发展情况选择的，并包括一定数量的健康对照。描述性统计数据用于比较完成较大的VicGen研究的259名儿童/母亲二元组的全部队列与该分析中的134组。134个儿童/母亲二元组在所有参数上都是相似的，只是较大的VicGen组的大城市居民所占比例较低，因此，在队列研究开始时，居住在氟化区域的人较少（补充表 1）。
修改后的国际龋齿检测和评估系统（ICDAS II）标准用于龋齿评估。ICDAS II被开发用于龋齿管理和流行病学的临床研究，因为该测量将病变的临床外观与其组织学深度或严重程度相关联。与流行病学调查中的标准标准18相比，ICDAS II经过验证可与儿童一起使用，并且当与乳牙磨牙一起使用时，对于所有规范具有可接受的有效性和可重复性19。由于需要在现场而不是牙科诊所收集数据，因此无法使用压缩空气，因此，除非代码1病灶位于凹坑或裂缝中，否则无法记录。龋齿评估是由三名牙科医生进行的，他们经过培训，校准并熟悉临床数据收集之前的筛查方法17。修复后的ICDAS II评分为5，第六次就诊共有9名儿童，第七次就诊共有20名儿童，其中至少有一次牙齿修复。据报因龋齿而拔牙的ICDAS II评分为6。第六次就诊的一名儿童和第七次就诊的一名儿童均因龋齿而拔牙。
使用移液器从婴儿中收集高达5 mL的未刺激唾液，并通过向无菌管中被动流口水收集儿童的唾液。在7.7个月大的婴儿进行第二次临床评估的同时，收集母亲的唾液。将样品在-20°C下快速冷冻，保存并定期运输到墨尔本牙科学校，在此将它们在-80°C下保存在安全的冰柜中，直至进行进一步分析。
总共对来自134名儿童及其母亲的唾液样本进行了微生物分析。在最初的六个平均年龄（1.9、7.7、13.2、19.7、39.0和48.6个月）对儿童的唾液进行了分析。从收集的每个时间点的唾液样本中提取总DNA。16S rRNA系统发生标记基因的V4区的靶向扩增是使用PCR与定制条形码引物进行的，基本上如先前所述20。
从唾液中提取DNA的方法基于NIH人类微生物组项目程序手册（www.ncbi.nlm.nih.gov）。使用PowerLyzer®PowerSoil®DNA分离试剂盒（Qiagen）从唾液中提取总DNA。遵循制造商的“真空规程”说明，进行了如下细微修改：对于给定的唾液量，成年人可提取的总DNA量要比儿童高得多。因此，对于DNA提取，将多达400μL来自儿童的唾液和200μL来自成人的唾液添加到珠管中。然后添加珠溶液至最终体积为750μL，以及4μL100 mM RNase A（Sigma Aldrich）以消除RNA。使用Precellys 24 Homogeniser（Bertin Technologies）以5000的速度裂解样品45 s。均质后添加含洗涤剂的溶液C1，以避免过度发泡，并通过倒置混合。然后将样品在室温下孵育5分钟，在执行Mo Bio Laboratories方案中指定的抑制剂去除，结合和洗涤步骤之前，要留出一定时间进行RNA消化。使用40μL2 mM Tris缓冲液（pH 8）洗脱DNA，将其预热至70°C。纯化的DNA储存在-80°C。
离子扩增子文库制备融合方法（Thermo Fisher Scientific）适用于从口腔细菌中扩增16S rRNA基因的V4区。实验对照一致显示，白金® PCR超混合液高保真在协议，未能扩增指定放线naeslundii DNA，所以Q5 ®替换了热启动高保真DNA聚合酶（Genesearch）。使用50μL反应体积进行PCR，其中包含6 ng的总DNA作为模板（约3 ng细菌DNA），1X Q5反应缓冲液，0.3μMPAGE纯化的定制条形码引物（Thermo Fisher Scientific），0.2 mM dNTP（ Thermo Fisher Scientific）和1个单位的Q5 Hot Start高保真DNA聚合酶。将反应在98°C保持3分钟以使DNA变性，然后在98°C进行10 s，48°C进行10 s，在72°C进行15 s的17个扩增循环。本研究中使用的62条条形码正向引物和单个反向引物的序列显示在引物表中（补充表 2）。）。根据离子扩增子文库制备融合方法规程中提供的说明，使用AMPure XP试剂（贝克曼库尔特公司）纯化扩增子文库。使用LabChip GX Touch 24核酸分离系统和DNA高灵敏度试剂盒（Perkin Elmer）对纯化的条形码扩增子文库进行定量。使用具有400 bp规程的Ion OneTouch™2系统执行合并的扩增子文库的乳液PCR，并在Ion Torrent个人基因组机上进行多重测序，利用Hi-Q化学方法每次运行525种试剂流（Thermo Fisher Scientific）。
Torrent Suite Software用于解复用样品并修剪测序适配器和条形码。Galaxy / GVL 4.1.0工作台和FROGS 21用于过滤和聚类序列，基本如先前所述20。修剪引物序列，并除去不包含正向和反向引物，长度小于220 bp或大于350 bp，包含歧义性，包含大小> 7 nt的均聚物或包含两个不良质量评分（< 10）相距<= 10 nt。使用Swarm方法进行聚类22检测并去除了嵌合DNA序列，以及仅包含单个序列的任何簇。修剪和过滤后，总共保留了31,714,787个扩增子序列，平均读取长度为255 nt。
使用R CRAN版本3.4.3和特定的R包23进行统计分析。Phyloseq软件包24用于比较社区结构和DESeq。2用于微分丰度分析。HOMD数据库用于分配聚类分类法25。多元纵向分析如下进行：使用总和比例换算将OTU计数表转换为相对比例，然后进行中心对数比转换26。使用mixOmics R软件包27进行主成分分析。由于每个婴儿的采样不均匀，因此使用带有平滑参数0.4的平滑样条对每个OTU和每个婴儿的时间轨迹进行建模。这个过程使我们能够插值每个婴儿的匹配时间点。对于细菌生物标志物鉴定，我们应用了稀疏的偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）28，其中我们考虑了特定的关注时间点（例如，年龄的39和48.6个月）来区分ECC，定义为一个或多个ICDAS II评分2岁或以上与健康。
为了确定空化开始之前口腔微生物组的组成是否发生变化，根据首次空化的临床检测时间将队列分为四组，该时间由一个或多个ICDAS II评分为3或更高来确定。这四组由年龄在39个月大的儿童组成，包括12个人；33个人，年龄48.6个月；以及20个在60个月大的时候患病的人；以及在生命的最初60个月内没有临床可检测疾病的持久健康人群，包括69个人。然后在稍后的时间点将口腔微生物组组成与疾病状况进行比较。
在两个月至四年大的六个时间点对134名儿童的口腔微生物组进行了表征。在可能的804个样本中，有762个提供了可用的序列数据。在一个时间点确定了134位母亲中132位母亲的口腔微生物组。经测序的唾液样品产生了3200万个16S DNA序列，每个唾液样品平均鉴定出约35,000个16S DNA序列，共鉴定出356个操作分类单位（OTU）。
随着时间的流逝，婴儿唾液中细菌OTU的平均数量有所增加。1.9个月大的儿童唾液中的细菌多样性较低，平均为31±11 OTU。随着年龄的增长，细菌多样性在39个月时达到平均84±16 OTU，然后保持稳定，直到48.6个月（图 1）。这些孩子的母亲的唾液平均为124±25 OTU。口腔微生物组随时间变化的主成分分析表明，微生物组的组成随时间发生了明显变化（图 2a）。）。为了帮助我们了解口腔微生物组的发展方式，我们将“核心口腔微生物组”定义为包含在一个或多个时间点患病率达到90％或更高的所有分类单元。在1.9个月的年龄只有七个细菌的OTU，缓症链球菌组（100％），Gemella酒店haemolysans（100％），唾液链球菌组（98％），Rothia mucilaginosa（93％），葡萄球菌caprae（93％），嗜血杆菌在90％以上的儿童唾液样本中发现副流感病毒（92％）和结膜弯曲杆菌（92％）（图 3）。在7.7个月大的年龄组中，有90％或以上的人群在唾液中检测到的物种数量已增加到14个。其中包括以前的七个物种中的六个，只有卡普拉氏葡萄球菌降至患病率低于90％。在年龄为13.2个月时，唾液的核心微生物组已增加至28种，而在年龄的19.7个月时为32种（图 3）。核心微生物组中的物种总数直到48.6个月大都保持相对稳定，尽管其组成有所不同。母亲有一个与孩子不同的口腔微生物组（图 2b），其核心微生物组有54种，其中图3列出的40种中有32种。 在场。与儿童相比，成年人核心微生物组的显着添加包括五种普罗沃氏菌（P. denticola，P。salivae，P。pallens，P。oris和P. nigrescens），S。mutans和T. socranskii。有趣的是，许多物种包括卟啉单胞菌。口服分类单元930（64％），贝尔吉拉菌种。与儿童相比，成年人中的口服分类群931（50％）和血红糖链球菌（40％）的患病率均明显降低。
在这项研究中调查的134名儿童及其母亲唾液中细菌α多样性的缺口图。该图显示了儿童的口腔细菌群落发展，这是随着六个时间点（从1.9个月到48.6个月大）的分类单元数目的增加。为了比较，显示了孩子在7.7个月大时所摄取的母亲唾液中细菌分类群的数量。方框表示四分位数（数据的50％），方框中的水平线表示中位数，“缺口”表示中位数的95％置信区间，“晶须”表示最大值和最小值。
口腔微生物组从1.9个月到48.6个月大的主要成分分析显示了细菌群落的暂时发育。（A）将母亲的口腔微生物组（蓝色）包括到数据中，表明儿童的微生物组与母亲的微生物组之间的关系。（B）没有母亲，仍然观察到纵向趋势。每个孩子的微生物组的年龄分别为1.9（橙色），7.7（灰色），13.2（绿色），19.7（粉红色），39（黄色）和48.6（黑色）个月。每个平均年龄组的置信椭圆图以95％的水平表示。
核心口腔微生物组的时间发育。值表示在测试的六个平均年龄中具有每个分类单元可检测水平的同类人群的百分比。如果在一个或多个时间点，队列中超过90％的儿童的唾液中存在分类单元，则认为分类单元是核心微生物组的一部分。图中的粗体显示这些值超过90％。从早期到晚期定殖者排列分类单元，根据它们何时成为核心微生物组的一部分，将阴影簇分类。金黄色葡萄球菌由于其异常的定殖模式而被放置在该图的末端。最后一行显示了该时间点儿童核心微生物组中的分类单元总数。
五个最丰富的OTU，缓症链球菌群，G. haemolysans，唾液链球菌群，H.副流感和Granulicatella线虫，对细菌总数的平均90％由在唾液中发现1.9个月的年龄。到四年岁时，这一总比例下降到70％，这主要是由链球菌炎组和唾液链球菌组中两个OTU的下降所致（图 4）。在任何时间点，链球菌该组是迄今为止唾液中OTU最丰富的。但是，随着唾液物种丰富度的增加，该分类单元的丰度在生命的最初19.7个月中大幅下降，然后保持相对稳定，直到48.6个月大。在这个年龄，儿童链球菌中的唾液丰富量仍然是母亲的两倍（图 4）。
根据二十种最丰富的分类单元，儿童唾液的细菌组成从1.9个月的年龄变化到48.6个月的年龄。为了比较，显示了孩子在7.7个月大时母亲唾液的细菌组成。
G. haemolysans在生命的前四年中是第二丰富的细菌物种。在两个月至四年的年龄之间，该物种的丰度相对较小的增加。有趣的是，成人唾液平均含有的儿童血中溶血G.的数量少于一半（图 4）。副流感嗜血杆菌在出生后的头三年显示出稳定的丰度增加，但在四岁时略有下降，降至与成年人相似的水平。秀丽线虫在1.9个月大的婴儿唾液中基本不存在，但到8个月大时相对丰富，在以后的40个月中其丰度没有明显变化。的唾液链球菌是成年人唾液的主要成分，两个月大的婴儿的唾液丰度相似。在两个月大的时候，它的丰度显着下降，然后随着时间的推移，它的丰度仅略微增加到了四年的年龄（图 4）。
在这项研究中检查的所有婴儿均具有健康的牙列，平均年龄可达19.7个月。在接下来的39个月大的临床评估中，有12名儿童出现气穴现象，其定义为至少一项ICDAS II得分为3或更高。到平均48.6个月大时，共有45名儿童出现了可检测到的空化现象，其中33名儿童出现了39至48.6个月大的空洞。在259岁的儿童中平均有5岁，其中有65岁的儿童有蛀牙，其中20名儿童的牙釉质蛀牙在48.6至60个月大之间。使用更敏感的ICDAS II评分2（牙釉质有明显的视觉变化）作为临床上可检测到的ECC的确定，在259岁的儿童中，有106名（41％）在五岁时患病。
可以预期，这65名患病儿童的ECC严重程度各不相同。为了量化这种可变性，通过将患病牙齿的数量乘以其ICDAS II分数，然后求和，得出ECC严重性分数。在年龄39个月时首次检测到ECC的儿童的ECC严重程度平均评分为20.5±11.4，在60个月时的中位数为17.0。首次在年龄为48.6个月时检测到ECC的儿童，平均ECC严重程度评分为17.3±9.0，在60个月大时的中位数为15.0。这表明，在年龄在39到48.6个月之间发展为ECC的儿童在60个月大时获得了相似的疾病结局。年龄在60个月大时首次检测到ECC的儿童的ECC严重程度平均评分较低，为11.6±5.8，中位数为10.0。在疾病谱的严重末期，到60个月大时，有11名儿童的ICDAS II评分为6（广泛的可见牙本质腔）。一名儿童有10颗可检出ECC的牙齿，其中5颗ICDAS II评分为5（可见牙本质的明显腔），另一颗则得分为6（表） 1）。在患有ECC的儿童中，患病最严重的10％的ECC严重性评分为25或更高，而排名前20％的ECC严重性评分为23或更高（表 1）。
进行了sPLS-DA分析，以鉴定出将健康儿童与年龄在39或48.6个月时临床上可检测到疾病的儿童（定义为一项或多项ICDAS II得分为2或更高）相区分的儿童的口腔微生物组的关键分类。在两组之间观察到重叠（图 5a和6a），但分析一致地将变形链球菌确定为与疾病相关的最具歧视性的分类群。48.6个月的年龄纤毛shahii，Scardovia wiggsiae和纤毛 IK040也与疾病（图相关 5A和6A）。有健康特定类群在这两个年龄段有不太一致协会梭杆菌periodonticum，Stomatobaculum茇和Bergeyella 602D02在39个月的年龄和健康被关联普雷沃shahii，普氏菌蚊，Stomatobaculum茇，卟啉单胞 CW034和Capnocytophaga AM20030在年龄为48.6个月时与健康有关（图 5b和6b）。
年龄平均39个月与健康（无龋齿）或疾病（ECC的定义为存在一个或多个ICDAS II得分为两个或以上）相关的口腔微生物组分类群的判别分析。（A）sPLS-DA图显示了对样品组的某些区分，代表了95％的置信椭圆图。（B）最重要的分类单元，选自sPLS-DA，与无龋或ECC相关。x轴表示sPLS-DA中每个OTU的重要性，y轴表示OTU及其属|的重要性。物种分类学分类。颜色表示OTU中位数最大的样本组。蓝色=健康；橙色=疾病。
对与健康（无龋齿）或疾病（ECC定义为存在一个或多个ICDAS II得分为两个或以上）相关的平均年龄为48.6个月的口腔微生物组分类的判别分析。（A）sPLS-DA图显示了对样品组的某些区分，代表了95％的置信椭圆图。（B）最重要的分类单元，选自sPLS-DA，与无龋或ECC相关。x轴表示sPLS-DA中每个OTU的重要性，y轴表示OTU及其属|的重要性。物种分类学分类。颜色表示OTU中位数最大的样本组。蓝色=健康；橙色=疾病。
与保持健康的儿童相比，在较晚时间点患病的儿童在年龄分别为1.9、7.7和19.7个月时口腔微生物群差异不大（数据未显示）。然而，在39个月大时，患病儿童的口腔微生物组中特定分类群的丰度与在48.6个月大时保持健康的儿童相比有所不同（图 7）。特别是变形链球菌，远缘链球菌和V.球菌水平都在谁开发病患儿升高。相反普氏菌变黑，三个品种的Leptotricia和Actinobaculum 患病儿童的12B759水平降低。
年龄在48.6个月时患病的儿童与保持健康的儿童相比，在39个月大时的唾液中细菌类群丰富度的差异。
正如我们的数据表明，变形链球菌是目前和未来临床疾病预测中最具区分性的分类单元，我们将重点放在该物种上。在1.9个月大的婴儿中，唾液中可检测到变形链球菌的水平仅为24％。有趣的是，这一流行率在7.7个月大时降至17％，然后在13.2个月大时降至25％，在19.7个月大时为42％，在39个月大时为58％。然后在年龄为48.6个月时，变形链球菌的患病率略降至51％。截至48.6个月的样本（包括48.6个月），有9名儿童在任何时间点均未检测到变形链球菌，其中8名儿童保持健康，其中一名儿童在60个月大时可检测到疾病。
将成人中单个时间点的变形链球菌和年龄在1.9个月至48.6个月之间的六个时间点的儿童唾液中的丰度与首次临床检测出龋齿的时间进行了比较。如上所示，该队列在39个月大时首次在临床上检测到ECC。在母亲仍然健康的母亲和年龄在39、48.6或60个月时出现临床疾病迹象的母亲的唾液中，变形链球菌的丰度没有显着差异（图 8A）。同样，变形链球菌与研究期间发生临床ECC的儿童相比，保持健康的儿童唾液中1.9、7.7和13.2个月的水平没有显着差异（图 8B–D）。相比之下，在年龄分别为39（p = 0.017）和48.6（p = 0.015）个月的ECC患儿中，变形链球菌唾液水平在19.7个月时显着升高，而在18 个月的ECC患儿中唾液变形链球菌的唾液水平显着升高。与保持健康组相比，年龄为60个月。（图 8E）。变形链球菌在39个月大时的唾液水平在年龄分别为39（p = 0.000）和48.6（p = 0.000）个月的临床上首次被检测出ECC的儿童中，其水平显着升高，但首次被诊断为60个月的儿童（p = 0.073）则显着升高），相对于保持健康的组（图 8F）。年龄为48.6（p = 0.000）和60（p = 0.009）个月的首次临床诊断为龋齿的儿童的唾液中变形链球菌水平相对于保持健康的水平显着升高组（图 8G）。在48.6个月大时，经临床确定在39个月大时患有ECC的儿童唾液变异链球菌仍升高。
在指定时间点在整个60个月内保持健康的母亲和儿童唾液中的变形链球菌数量丰富（紫色，n = 69），在39个月（红色，n = 12），48.6个月时出现可临床检测的疾病（绿色，n = 33）或60个月（蓝色，n = 20）。框线图显示中位数（框内的线），第一和第三四分位数（框），非离群值范围（晶须）和离群值（点）。星号表示与其余健康对照组显着不同的值。
目前只提供关于口腔微生物的攻坚生命最初几年的发展非常有限的信息14，29。这是第一项在接近出生到四岁的六个时间点表征100多个儿童口腔微生物组特征的研究。在生命的最初两年中，有限数量的早期定殖细菌类群在口腔中迅速定殖，这表明这是口腔微生物组有序发展的关键年龄。殖民化和细菌群落发育的时机可能受到一系列环境因素的影响，包括其母亲的微生物组，饮食，健康状况和抗生素的摄入，并且可能对口腔微生物群的正常发育和疾病风险产生影响29。
将核心口腔微生物组定义为由该队列中至少90％的儿童检测到的物种组成，而不论细菌的丰度如何，都可以确定口腔的定殖模式。核心口腔微生物组在大约2至39个月大时增加了5倍，而最初的核心微生物组主要由粘附并定居在粘膜上皮表面的物种组成，例如黏膜粘菌R. mucilaginosa，G。haemolysans和S. salivarius和葡萄球菌组。鉴于两个月大的婴儿的口腔中没有牙齿，这是可以预期的。坚硬，不脱落的牙齿表面的出现和饮食变化，从而创造了新的生态位，可能是导致核心唾液微生物组快速膨胀的原因。细菌斑块组成的细菌生物膜群落的发展已显示出以有序的方式进行，特定的分类单元完成了特定的生态作用30。因此，定殖时间可能会影响正常斑块的形成，并可能影响疾病的易感性。
该缓症链球菌群和G. haemolysans是唾液中的两个最丰富的类群前四年的生活，已经两个月十六岁的前殖民所有儿童，表明这些品种的口腔定植初期牙齿萌出。该缓症链球菌群被广泛看作是与口腔健康相关的共生物种31。这组物质具有在遗传和生理水平高度相似的32和包含物种，包括缓症链球菌，口腔链球菌，肺炎链球菌，peroris和S. dentisani使用16s RNA基因的V4区域分类不一致，难以区分33。因此，在这项研究中使用V4区域可能会导致低估口腔微生物组内的总生物多样性。随着越来越多的细菌在口腔中繁殖，S。mitis组的优势随着时间的流逝而减少。在四年的年龄中，这两种物种的儿童唾液含量是成年人的两倍。这与Dzidic 等人的研究一致。29谁发现了链球菌。在三个月大的时候，约占唾液微生物组的80％，到了7岁大的时候，下降到约60％，而双歧杆菌spp。同时从大约6％增加到8％。Sulyanto 等。14还发现，米氏链球菌组，溶血性链球菌，粘液性拟杆菌和唾液链球菌组是一岁以下婴幼儿中最丰富的分类单元。
在大多数情况下，核心微生物组分类的患病率随年龄增长而增加。随着时间的流逝，卡普拉链霉菌的流行率反而下降。该细菌被认为是人类皮肤的一种代名词，它在早期的流行可能反映出唾液污染是由于与婴儿或母亲的皮肤接触而引起的，或者这种细菌可能在生命早期就移居到口腔中，然后被置换。其他三个物种贝吉拉菌。口服分类单元931，Leptotrichia sp.。口服分类单元221和Sneathia sanguinegens的患病率均升高至13.2个月大，然后下降。少数种类如Tannerella sp。口服分类单元286，L. shahii和C. morbi发病率相对缓慢地上升，在39个月大时成为核心口腔微生物组的组成部分。但是，新物种在口腔中的定植在四年后仍很容易发生，因为他们母亲的唾液中含有更多的物种，并且组成明显不同。
在该平均年龄为5岁的队列中，该队列中的259名儿童中有105名（41％）有早期ECC的临床体征，这是由ICDAS II得分为2或更高确定的，其中65名儿童（25％）患有ECC蛀牙龋齿，定义为一颗或多颗ICDAS II分数为3或更高的牙齿。这种疾病的水平与可比人群34相似。但是，很少有针对5岁以下儿童的流行病学研究，因此很难在人群中进行概括35。ECC是一种在不同时间被发现并且在个体中以不同速率发展的疾病。如本研究所示，在39个月的检查中有12名儿童（4.6％）表现出疾病的首例临床证据，在48.6个月的检查中有33名（12.7％）表现出疾病的首例临床证据，在20个月的检查中有20例（7.7％）。五年考试。可以预期，在39个月大时首次显示ECC的临床体征的儿童比60个月时才出现临床疾病的儿童更晚或更广泛地患疾病，直到使用累计ICDAS II分数。
ECC从牙釉质表面下脱矿质化和疾病的临床症状发生之前的口腔中特定部位的菌斑生物膜细菌种类组成变化开始。因此，龈上菌斑微生物群组成变化的检测可能是在疾病临床表现之前检测出ECC的一种方法，并提供了介入以尽早处理疾病过程并防止不可逆空化的机会。在横断面研究中，龈上菌斑中大量细菌物种与龋齿活动有关12。在本研究中，我们表明，与在39和48.6个月龄时均健康的儿童相比，具有临床可检测疾病的儿童的口腔微生物组组成发生了变化。但是，这种变化的程度不足以在个体水平上充分区分临床健康和疾病。在这两个年龄段，与ECC相关的最具歧视性的物种是变形链球菌。
许多研究调查了口腔微生物组预测未来疾病的潜力。在最近的一项队列研究中，年龄在9岁以下的儿童与没有龋齿的29岁儿童相比，唾液中链球菌的丰度在3和24个月时显着更高。在三年期间的两个时间点对儿童进行采样Holgerson及其同事[ 36]确定，除了较高的乳酸菌水平外，年龄3个月时唾液的细菌组成与年龄3岁时龋齿的发展无关。乳酸菌的发生spp。在我们的队列中，该人群普遍偏低，通常只有2-5名儿童在任何给定时间点均具有可检测的水平，而这些物种的检测与疾病没有相关性。在ECC患病率高的人群中，Chaffee 等。37显示孕妇唾液中干酪乳杆菌和变形链球菌的高水平预示着ECC发生率增加。但是，在当前的队列中，尽管所有母亲的唾液中都有可检测到的变形链球菌水平，但该物种的丰富度不能预示其子女的ECC。
大多数孩子都报以获取变形链球菌乳牙萌出后不久38，39。在ECC发生率很高的美国人口中，该队列中有50％的儿童在两年大的唾液中可检测到变形链球菌或sobrinus 链球菌，而在四年大的时候其阳性率为〜79％40。在本研究中，变形链球菌在年龄为1.9个月时的大约四分之一人群中可以检测到，很早就在牙齿萌出之前，但是这种流行率在7.7个月时下降，然后在年龄13.2个月时恢复到四分之一。 。到四岁时，所有儿童中有一半可检测到变形链球菌在他们的唾液中。这种定植模式可能表明从母亲或其他来源进行早期接种，然后无法在某些儿童中建立良好的繁殖能力，直到生命的后期。
在39个月的年龄变形链球菌，远缘链球菌和五球菌在儿童谁48.6个月的年龄发展疾病的唾液水平都升高了与那些保持健康比较。在健康状况良好的儿童中，其唾液变形链球菌水平在随后的检查中与临床上健康的儿童相比，分别在19.7、39和48.6个月时显着升高。在活动性疾病期间，唾液变形链球菌的水平也保持较高。很可能因此认为唾液水平变形链球菌，以及其他包括远缘链球菌和V.球菌，是18个月至4岁儿童即将发生釉质脱矿质的有用的预后生物标志物。虽然这种关联已经显示使用PCR或培养先前大多数研究专门针对变形链球菌，分别为横截面或两者41，42。我们的研究使用前瞻性队列研究设计和相对公正，开放的方法，能够检查唾液中大多数细菌物种与疾病之间的关联。水平升高变形链球菌，远缘链球菌和V.球菌唾液中的糖可能是儿童频繁饮食中碳水化合物摄入量的替代指标。这种摄入导致微生物群落的营养不良，导致龈上菌斑11中产酸和酸性尿菌增加。
总之，口腔微生物组在生命的头四年中显示出有序的生态演替，唾液的细菌组成，尤其是某些物种的丰富性可能具有作为ECC的生物标记物的潜力。
|
|
