摘要
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是一种由针对患者红细胞的抗体介导的获得性自身免疫性疾病。但是，抗体产生的潜在机制尚未完全了解。先前对AIHA的病因和发病机制的研究主要集中在逃避了耐受机制的自身反应性B细胞。很少有研究报道在AIHA过程中T FH和T FR细胞的功能。本研究旨在探讨T FH和T FR细胞在AIHA发病中的潜在机制。使用鼠类AIHA模型，T FH：T FR的比例增加据报道，血清IL-21和IL-6水平升高，Bcl-6和c-Maf表达上调。同样，从免疫小鼠中纯化的CD4 + CXCR5 + CD25 - T细胞的过继转移促进了AIHA小鼠模型中自身抗体的诱导。总之，我们的数据证明了T FH细胞在控制和诱导AIHA中的重要作用。鉴于T FH细胞对AIHA免疫应答的关键作用，应强调旨在抑制T FH发育或功能的策略。
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是导致产生针对病人的红血细胞（红细胞）的抗体的获得性自身免疫性疾病引起缩短寿命红细胞1，2，3。AIHA的最常见的形式是温暖AIHA特征在于预热类型的存在的自身抗体-免疫球蛋白G（IgG）所在37℃下最优地进行反应，由组织巨噬细胞引起RBC血管外破坏4，5。AIHA的主要治疗方法包括RBC输血和免疫系统抑制剂，例如皮质类固醇。在AIHA患者中输注RBC具有挑战性，因为患者中的自身抗体通常对输注的RBC具有反应性，从而使每个单位的血液都不相容。此外，复发率高达50％难治性患者的类固醇6，7，8。因此，迫切需要了解AIHA中自身抗体产生的机制，以便可以设计更好的疗法。
AIHA的病因和发病机制的先前研究集中在逃避耐受机制和调节性T细胞（Treg）9的自身反应性B细胞。很少有研究报道在AIHA的过程中T卵泡辅助细胞（T FH）和T卵泡调节细胞（T FR）的功能。高度专业化的CD4 + T细胞亚群T FH最近受到了广泛的关注，因为它们在生发中心（GC）反应和抗体产生的调节中起着重要作用。Ť FH细胞的特征在于转录因子的表达，核转录抑制因子B细胞淋巴瘤6（Bcl-6），趋化因子受体趋化因子（CXC基序）受体5（CXCR5），诱导型共刺激物（ICOS），程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1），并产生高水平白细胞介素21（IL-21）的10，11，12，13。在细胞因子信号传导中，白介素6（IL-6）和IL-21在T FH分化和功能维持中起关键作用，这是由于Bcl-6和CXCR5表达通过信号转导子和转录激活子3（STAT3）上调14，15，16，17。T的主要功能FH细胞是支持GC形成和反应，提供B细胞与必要的成熟信号，驱动抗体类别转换，支配高亲和力抗体的产生，并促进记忆形成13，18，19，20。
T FR细胞代表Foxp3 + Treg 的高度专业化的亚群，共表达T FH功能，例如Bcl-6，CXCR5，ICOS，PD-1和Treg功能CD25和Foxp3 21。T FR细胞具有抑制T FH活化和细胞因子生成的能力，并通过高表达细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）抑制GC中发生的B细胞GL7和B7-1表达以及有限的类别转换重组。和产生抑制细胞因子白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGFβ）的22，23。T FR的参与细胞在人类自身免疫性疾病发病机理中仍是推测性的，但是在患有几种自身免疫性疾病（例如儿童免疫性血小板减少症24和类风湿性关节炎25）的患者的血液中观察到T FR：T FH比的变化。
考虑到B细胞的过度激活和自身抗体的过度产生，我们假设T FH和T FR细胞在AIHA的过程中起着至关重要的作用。在这里，我们利用小鼠AIHA模型来确定T FH和T FR在诱导AIHA中的作用。我们的研究表明，在自身抗体阳性AIHA小鼠中，转录因子T FH：T FR的比例增加，血清IL-21和IL-6水平升高，Bcl-6和c-Maf表达上调。此外，纯化的CD4的过继转移+ CXCR5 + CD25 - T细胞，但不是CD4 + CXCR5 -来自免疫小鼠的CD25 - T细胞在AIHA小鼠模型中促进了自身抗体的诱导。总之，我们的数据证明了T FH细胞在AIHA的控制和诱导中的重要作用。鉴于T FH细胞对AIHA免疫应答的关键作用，应强调旨在抑制T FH发育或功能的策略来治疗AIHA。
为了研究T的作用FH在AIHA，一个AIHA小鼠模型根据该方法构建的先前所描述的26，27。在我们的模型中，可在5-6周内检测到红细胞自身抗体，并在接下来的6周内不断增加。在第十二周，几乎所有的小鼠都产生了大鼠RBC特异性异种抗体，大约40％的小鼠产生了AIHA，这可以通过其RBC上存在红细胞特异性自身抗体，增加的输血小鼠RBC破坏性和水平来证明。循环网织红细胞的分布（图 1A–E）。
AIHA小鼠模型的开发。每周用大鼠RBC免疫8-10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠，持续12周。（A）在小鼠RBC注射前一天通过流式细胞术测量了小鼠RBC上的IgG特异性自身抗体的水平，并表示为背景未染色细胞的百分比。将该实验重复三遍，每次每组至少10只小鼠。（B）血浆中IgG特异性抗大鼠异种抗体的水平是通过首先将大鼠红细胞与稀释的小鼠血浆一起孵育，然后用FITC偶联的抗小鼠IgG染色来测量的。通过流式细胞术进行分析，并且在其Y轴上显示了具有与其结合的抗体的大鼠RBC的百分比。（C）在第12周时，小鼠RBC上IgG特异性自身抗体的表达。每个图代表每组中的一只小鼠。椭圆框代表最高水平的自身抗体人群，而方形框代表具有背景水平的自身抗体人群。（D）以PKH-26标记的C57BL / 6J小鼠红细胞作为阴性对照，将其注射到用大鼠RBC或PBS免疫的小鼠中作为阴性对照进行红细胞存活研究。在指定的时间，对静脉血进行采样并通过流式细胞仪分析荧光RBC的比例。为了显示RBC清除动力学，将注射后1分钟可检测到的RBC定义为100％，并通过除以总RBC来计算不同时间点的剩余RBC。每组两只小鼠重复该实验3次。（E）小鼠中循环网织红细胞的数量以百分比表示。所示数据为平均值±SEM。水平线显示中位数。
为了研究AIHA小鼠模型中与T FH相关的潜在差异，将输血的受体分为无反应者（无自身抗体）或有反应者（超过75％的红细胞与红细胞特异性自身抗体）.CD4 + CXCR5 + CD25 -的Foxp3 - Ť FH细胞是通过在这些基团流式细胞术分析。如图2A–C所示 ，CD4 + CXCR5 + CD25 - Foxp3 - T FH的百分比和数量与无反应组和对照组相比，有反应组中的细胞明显增加。应答者组中ICOS hi PD-1 hi细胞的比例也高于非应答者和对照组（图 2D，E）。进一步的分析发现，应答者组中CD4 + CXCR5 + CD25 - Foxp3 - T FH细胞的百分比与自身抗体荧光强度之间存在中等正相关（图 2F）。
自身抗体阳性AIHA小鼠的T FH细胞增加。（A）来自应答者，非应答者和对照组的脾CD4 + CD25 - FoxP3 - T细胞中CXCR5的表达。（乙）CXCR5的百分比+在CD4细胞+ CD25 -的FoxP3 -细胞在这三组。（C）这三组中脾脏中的CD4 + CXCR5 + CD25 - FoxP3 - T FH细胞的数量。（D）ICOS和PD-1在CD4 +中的表达CXCR5 + CD25 - FoxP3的-牛逼FH来自这三组细胞。（Ë）ICOS的百分比。在 PD-1 。在细胞中脾CXCR5 + CD4 + CD25 -的FoxP3 - T细胞在这三组。（F）CXCR5 + CD4 + CD25 - FoxP3 - T FH的百分比关系应答者组中的IgG细胞和IgG特异性自身抗体的荧光单位。每组用6-7只小鼠重复该实验3次，每张图代表每组一只小鼠。所示数据为平均值±SEM。* p <0.05；*** p <0.001；ns，没有意义。
T FR细胞共享T FH和Treg细胞的特征，定位于B细胞滤泡，并在体内调节T FH细胞群体的大小和抗体反应。因此，我们测试了AIHA小鼠模型中T FH群体的增加和自身免疫反应是否是由于T FR亚群的收缩引起的。如示于图 3A和B，CD25的百分比+和Foxp3 +细胞中的CD4内+ CXCR5 + T细胞亚群是应答组比T的非反应者和控制groups.The比率的下FH： Ť FR在应答者组中，该比率更高，并且，该比率与应答者组中的自身抗体荧光强度具有适度且正相关（图 3C，D）。进一步的分析指出，在应答者组中，T FR细胞的数量略有减少（图 3E），这表明T FR细胞的比例下降是由于T FH细胞扩增所致。
自身抗体阳性AIHA小鼠的T FR细胞减少。（A）在应答者，无应答者和对照组的小鼠的CXCR5 + CD4 + T细胞中CD25和Foxp3的表达。（B）这三组中CXCR5 + CD4 + T细胞中CD25 + Foxp3 +细胞的百分比。（C）这三组中的T FH：T FR之比。（D）应答者中T FH：T FR与IgG特异性自身抗体的荧光单位的关系。（E）这三组脾脏中CD4 + CXCR5 + CD25 + FoxP3 + T FR细胞的数量。每组3-4只小鼠重复实验3次。所示数据为平均值±SEM。* p <0.05；ns，没有意义。
最近的研究16，28已表明，在T的分化和功能细胞因子IL-6和IL-21中起重要作用FH细胞以及响应于抗体生产。无论是否存在RBC自身抗体，与对照组相比，有反应者和无反应者组的血清IL-6水平都较高（图 4A）。对于血清IL-21水平，响应者组其血清IL-21水平比对照组高2倍（图 4B）。以前的研究29，30已经说明，IL-21和IL-6的水平显著与T的频率相关联FH细胞自身免疫疾病。在本研究中，应答者组血清IL-21水平与CXCR5 + CD4 + CD25 - Foxp3 - T FH细胞的百分比密切相关（图 4C）。此外，存在IL-21水平和CXCR5之间的中度和正相关+ CD4 + CD25 -的Foxp3 - 。细胞非应答组和无显著相关对照组中被发现（图 4D，E）。在所有三组中均未发现血清IL-6水平与该参数之间有预测关系（数据未显示）。除了IL-21，IL-4是用T分泌另一种细胞因子FH细胞和无差异三组（图中发现 4F）。
AIHA小鼠模型中的相对细胞因子水平。（A）在第一次免疫后的12周中，反应者，非反应者和对照组中的血清IL-6水平。（B）在第一次免疫后的12周中，这三组的血清IL-21水平。（C – E）这三组患者的血清IL-21水平和CXCR5 + CD4 + CD25 - T FH细胞百分比的关系。（F）初次免疫后的12周内，这三个组的血清IL-4水平。每个图代表每个组中的一只鼠标。每组对6-7只小鼠重复此实验3次。所示数据为平均值±SEM。* p <0.05；** p <0.01；*** p <0.001；ns，没有意义。
Bcl-6和c-Maf以及细胞因子IL-21的转录因子在T FH细胞的产生，分化和功能中起着至关重要的作用11。在这三组中分别评估了Bcl-6，c-Maf和IL-21的mRNA表达，在响应者组中其显着高于对照组（图 5）。
Bcl-6，c-Maf和IL-21 mRNA在AIHA小鼠模型的T细胞中的表达。（A）在应答者，无应答者和对照组中来自小鼠的T细胞的Bcl-6 mRNA的相对表达水平。（B）这三组CD4 + T细胞的c-Maf mRNA的相对表达水平。（C）这三组CD4 + T细胞的IL-21 mRNA的相对表达水平。每组3-4只小鼠重复实验3次。所示数据为平均值±SEM。* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。
为了研究CXCR5 + CD4 + CD25 - T FH细胞比例增加是否在AIHA小鼠模型促进活性中起作用，如先前所述31，对体外 B细胞类别开关重组测定进行了研究。从应答小鼠中分选出CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH和CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞。这些细胞用CD19 +培养B细胞（也从应答者组中分离）与抗IgM和抗CD3分开。如所预期的，发现与CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞相比，CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH细胞对类转换IgG B细胞的促进显着增加（图 6A）。接下来，在这些测定中检查了GL7的表达，因为它是GC中B细胞活化的敏感标志物32。用T FH细胞培养的B细胞的GL7表达比用CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞培养的B细胞增加3-4倍（图。 6B）。
T FH细胞在AIHA抗体产生和发病中的作用。（甲，乙）CXCR5 + CD4 + CD25 - Ť FH细胞和CXCR5 - CD4 + CD25 - T细胞（非T FH）从在week12应答组排序用CD19培养+ B细胞与抗沿着从类似免疫的小鼠CD3和抗IgM持续六天。B细胞在细胞内被IgG1（A）染色，表面被GL7（B）染色。剧情在CD19 +上进行了预选通B细胞。每个地块代表一个井。数据来自四个独立实验，并显示了平均值±SEM。*** p ＜0.001。（Ç）分选的CXCR5 + CD4 + CD25 - Ť FH细胞和CXCR5 - CD4 - CD25 - T细胞应答组大鼠RBC注射前每周过继转移到C57BL / 6J小鼠一天。通过流式细胞术测量小鼠RBC上IgG特异性自身抗体的水平，并表示为在第2、5、8和12周时本底未染色细胞的百分比。显示的数据是每组五只小鼠的三个独立实验。
此外，在体内研究了TFH细胞功能。将来自应答者组的CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH或CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞过继转移到幼稚C57BL / 6J小鼠中。转移后第二天，每周连续用大鼠RBC免疫小鼠12周。如图6C所示 ，在过继转移的T FH细胞的小鼠中，最早可以在第二周检测到自身抗体，而在转移的CD4 + CXCR5- 的小鼠中几乎没有检测到自身抗体阳性的红细胞。CD25 - T细胞。这种升高的自身抗体水平持续到12周。
此外，我们通过将这两组中的CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH细胞与CD19 + B细胞以及抗IgM和抗CD3 共同培养，比较了应答者和非应答者中的T FH细胞的能力。如图7所示， 这两组中IgG1和GL7的表达相似。因此，在应答者和非应答者组中，T FH细胞的促进能力没有显着改变（图 7）。
响应者和非响应者之间的T FH单元具有相同的功能。在第12周从应答者组和非应答者组中分选出的CXCR5 + CD4 + CD25 - T FH细胞与来自应答者组的CD19 + B细胞以及抗CD3和抗IgM一起培养6天。B细胞在细胞内被IgG1染色，表面被GL7染色。计算CD19 + B细胞中IgG1 +（A）和GL7 +（B）细胞的百分比。数据来自三个独立实验，并显示了平均值±SEM。ns，没有意义
在此，自身抗体阳性AIHA小鼠中CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH细胞的数量增加，导致T FH： T FR的比例很高。此外，Bcl-6和c-Maf的转录水平以及血清IL-21也随之升高。此外，增加的TFH细胞活性与针对用RBC连续免疫的应答有关。两者合计，结果对T FH细胞在AIHA发病机理中的作用具有重要意义。
AIHA是一种严重的疾病，有时甚至是致命的疾病。尽管在AIHA中病原性自身抗体的破坏作用的产生方面已广为人知，但是关于抗体产生的影响因素仍有很多知识要学习。几种机制已经研究了，以有助于AIHA，包括中枢和外周耐受机制的失调，细胞因子轴的破坏，和分子模拟自身抗原和病原体之间33，34，35，36，37。
AIHA的大多数研究都集中在红细胞特异性自身反应性B细胞上，而T细胞耐受性被认为是自身免疫的权宜之计38。2005年，在Playfair和Marshall-Clarke模型下，Amina 39发现CD25 +调节性T亚群在控制C57BL / 6J小鼠AIHA中的重要性。免疫前用抗CD25抗体治疗将AIHA的发生率从30％增加到90％。有趣的是，理查兹AL 40证明Treg是HOD RBC自身抗原耐受性的非必需成分。不同的结果可能归因于不同的小鼠模型和基因背景。此外，据报道T辅助17（Th17）细胞可能通过增强AIHA患者和小鼠模型中的适应性体液反应来影响AIHA的发展41。但是直到现在，关于AIHA发病机理中的T FH和T FR细胞的报道很少。
通过每周腹腔注射大鼠RBC到小鼠，在免疫后5-6周内可检测到红细胞自身抗体。红细胞自身抗体的数量在10至12周达到峰值，并与网织红细胞水平显着增加和RBC寿命缩短相关。这些指标参数表明我们的AIHA小鼠模型构造良好。根据我们的结果，CD4 + CXCR5 + CD25 − T FH的数量响应者组的细胞明显高于无反应者和对照组，并相应地增加了ICOS和PD-1的表达。一致地，转录因子Bcl-6和c-Maf在应答者组中高表达。此外，增加的TFH细胞与抗RBC IgG荧光单位呈正相关。众所周知，GC中T FH细胞与B细胞的相互作用在浆细胞的分化和高亲和力抗体的产生中起着基本作用11。从共培养实验中，CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH细胞，而不是CD4+ CXCR5 - CD25 - T细胞可促进B细胞活化和抗体分泌。过继转移测定法也证实了T FH细胞的促进功能，因为过继转移CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH细胞的AIHA小鼠中红细胞自身抗体的发作更早，水平也更高。尽管无应答的T FH细胞数量增加，但与无应答的组相比，应答组的T FH细胞功能并未改变。
自分泌或旁分泌细胞因子与受体的相互作用为T FH细胞的分化和功能提供了重要的信号。其中，IL-6和IL-21是最著名和研究最多的。IL-6，主要是由巨噬细胞分泌的，可以瞬时诱导转录因子Bcl-6和IL-21的表达，从而形成一个正反馈回路，以加强T FH细胞的命运16。因此，在没有IL-6的情况下，T FH细胞的早期编程被减轻。尽管缺乏IL-21或IL-21受体并不影响T FH细胞的初始分化和扩增，但那些T FH细胞未能支持GC反应，导致浆细胞和血清IgG水平降低。如此，IL-21，需要于T FH细胞的持久性和功能17，28，42。需要注意的是IL-21，主要和重要的细胞因子的T分泌FH细胞，也影响B细胞增殖，存活和同种型转换，提供了两个B细胞和T双向促进作用FH细胞15，43。根据我们的研究，响应者组的血清IL-6和IL-21水平明显高于对照组，而且更为显着的是，血清IL-21水平与CXCR5 +的百分比呈强正相关应答者组中的CD4 + CD25 - T FH细胞。因此，升高的IL-21水平有利于TFH细胞增殖和功能，导致过度的GC应答和抗体分泌。除IL-21外，IL-4是T FH细胞产生的另一个主要帮助分子，可保持GC B细胞存活和类别转换重组。然而，在应答者和对照组之间没有发现血清IL-4水平的差异。两者合计，血清IL-21水平起着在T重要作用FH AIHA的功能。
新近报道的Treg亚群T FR细胞可通过抑制细胞因子IL-4 / IL-21的产生，阻止GL7和B7-1在B细胞上的表达以及有限的开关重组22来抑制T FH细胞和GC B细胞的功能。因此，我们怀疑T FH细胞比例的增加和自身抗体的分泌是由T FR细胞引起的。在我们的研究中，发现应答者组中的T FR细胞比例缩小，这是CD4 + CXCR5 +细胞中CD25 + FoxP3 +亚群减少所证明的。因此，T FH：T FR之比增大，导致T FR和T FH细胞失衡。此外，三组之间的细胞计数几乎没有变化，表明TFR可能不是AIHA中自身抗体水平升高的原因（图 3E）。此外，在应答者和非应答者组之间的T FR功能在体外没有发现差异（数据未显示）。
关于CD4 + CXCR5 + CD25 - T FR细胞的一些报道被认为是终末分化T FR细胞，并保留Foxp3 +和抑制性分子CTLA-4 44的表达。当前的研究表明CD25的下调是T FR发育的标志。CD25 + T FR调节结核边界的相互作用并穿过卵泡，而CD25 - T FR负责直接抑制GC本身。与CD25 + T FR相比，CD25 - TFR细胞移动其基因表达签名更类似于T FH细胞，显示高水平的Bcl-6，CXCR5和PD-1和低水平的Foxp3，Blimp1，PSGL1 45。在这项研究中，AIHA小鼠的CD25 - T FR仅为3-5％（图 3A）。与CD25 + T FR细胞相似，应答者和非应答者中CD25 - T FR细胞的比例低于对照组。但是，三组之间的绝对数没有差异（数据未显示）。因此，CD25 - T FR 可能不是AIHA中产生红细胞自身抗体的关键。
截至目前，大量的研究已经证明T的关键作用FH和T FR细胞在自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮（SLE），类风湿性关节炎（RA），和特发性血小板减少性紫癜（ITP）46，47。与AIHA相似，ITP的特征在于针对血小板糖蛋白的自身抗体对血小板的破坏作用增加。据报道，在ITP患者中，特别是在抗血小板抗体阳性的患者中，循环T FH细胞和脾T FH细胞的比例增加。血浆IL-21水平也显著在活性ITP患者中增加29，30，48。以上临床发现与我们的结果一致。应该强调的是，在新诊断的ITP患者中，治疗后循环T FH细胞的频率恢复正常，而患有慢性ITP的儿童的循环T FH细胞和血清IL-21水平持续升高 48。
这项研究存在局限性。T FH和T FR细胞在区分抗大鼠抗体与抗小鼠自身抗体反应中的作用需要进一步研究。AIHA患者中T FH和T FR细胞的情况也应在未来进行深入研究。总体而言，首次研究揭示了T FH细胞在AIHA发病过程中在调节抗RBC自身抗体产生中的重要作用。尽管不能完全排除炎症环境在T FH频率增加中的作用，但我们的数据强烈表明T FH细胞参与B细胞分化和抗RBC抗体的生产。希望对T FH和T FR细胞有更多的了解可以导致有希望的针对AIHA的治疗方法。
这些研究是按照北京大学第二医院批准的指南进行的。所有研究方法和实验方案均经北京大学第二医院批准。
C57BL / 6J（B6）小鼠购自北京生命河实验动物技术有限公司，并饲养在无障碍的特定无病原体隔离设施中。对动物的所有照料和处理均按照北京大学第二医院对动物进行照料和使用的标准指南进行。
大鼠红细胞购自郑州贝斯特基因生物技术公司（中国河南），并调节至10 9细胞/ mL。通过在200μLRPMI中腹膜内注射2×10 8只大鼠RBC，对8至10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠每周免疫12周。
每周一次，每次免疫后五天，通过眼眶后窦出血获取血样（25μL）。使用FITC偶联的抗小鼠IgG（Invitrogen，Life Technologies，Grand Island，NY）通过流式细胞仪测定RBC上的IgG致敏自身抗体水平。为了分析大鼠RBC特异性异种抗体，将大鼠RBC与稀释的小鼠血浆在37°C下孵育1小时，并在洗涤几次后，如先前所述39用FITC偶联的抗小鼠IgG染色。
小鼠红细胞（1×10 9）从幼稚的雌性C57BL / 6J小鼠中获得，用PKH-26（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）标记，并通过尾静脉注射入对照小鼠和已患AIHA的小鼠。如前所述，在输注后的指定时间点通过眼眶后窦出血获取血样，并通过流式细胞术测量荧光红细胞的清除率49。网状细胞计数使用Advia 120血液学系统（Bayer，Tarrytown，NY）进行。
从脾脏制备单细胞悬液，并用ACK裂解缓冲液去除红细胞。对于表面染色，将细胞与荧光标记的单克隆抗体Ab在4°C下孵育30分钟，该单克隆抗体对小鼠CD4，CD8，CXCR5，CD25，GL7，B220（BD Biosciences，San Jose，CA），PD-1和ICOS（ Invitrogen）。对于Foxp3的细胞内染色，将固定有表面标记抗体的细胞固定，用Cytofix / Cytoperm（BD Biosciences，San Jose，CA）透化，并根据制造商的规程与APC偶联的抗小鼠Foxp3（BD Biosciences）孵育。对于IgG1的细胞内染色，首先将细胞固定并用Cytofix / Cytoperm（BD Biosciences）透化，然后与PE偶联的抗IgG1（Biolegend，San Diego，CA）孵育。在所有流式细胞仪染色程序中均使用了相应的同型匹配对照单克隆抗体。使用CellQuest软件（BD Biosciences）在FACSCalibur上进行流式细胞仪分析。CD4使用FACSAria II分选细胞仪（BD Biosciences）分选来自应答者和非应答者组的小鼠的+ CXCR5 + CD25 - T FH或CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞。
来自对照小鼠和AIHA的血清通过酶联免疫吸附测定（ELISA； BioLegend，San Diego，CA）用于检测细胞因子IL-21，IL-6和IL-4的存在。每个步骤均根据制造商的规程执行。
从新鲜分离的脾CD4 + T细胞（5×10 6）和TRIzol试剂（Invitrogen），并使用随机引物和逆转录系统（Promega，Madison，WI）制备cDNA。对于定量实时PCR，根据制造商的说明使用iQ SYBR Green Supermix（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）。在iCycler（Bio-Rad Laboratories）上进行定量PCR。将IL-21，Bcl-6和c-Maf的量相对于每个样品的管家基因Gapdh标准化。扩增条件如下：在95°C下变性5分钟，然后在95°C进行40循环10 s，在60°C进行40 s。在60℃下收集荧光值。用于PCR的引物对如下：IL-21正义：5-TCATCATTGACCTCGTGGCCC -3； IL-21：5-TCATCATTGACCTCGTGGCCC -3。反向：5- ATCGTACTTCTCCACTTGCAATCCC -3；Bcl-6：义：5-CACACCCGTCCATCATTGAA-3；反向：5-TGTCCTCACGGTGCCTTTTT-3；c-Maf：感：5-AGCAGTTGGTGACCATGTCG-3；反向：5-TGGAGATCTCCTGCTTGAGG-3；Gapdh感知：5-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTAT-3反向：5-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG-3。
对于T FH刺激测定中，2×10 4的CD4 + CXCR5 + CD25 - Ť FH细胞和CD4 + CXCR5 - CD25 -从应答组的小鼠接种5×10个T细胞4个 CD19 + B细胞（全部来自脾脏纯化应答组）和2μg/ mL可溶性抗CD3（BD Biosciences）加5μg/ mL抗IgM（Jackson Immunoresearch，West Grove，PA）。6天后收获细胞并进行分析。
使用FACS Aria II分选细胞仪（Becton Dickinson）从应答者组小鼠中分离CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH或CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞。将大约2×10 4的 CD4 + CXCR5 + CD25 - T FH或CD4 + CXCR5 - CD25 - T细胞在0.1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中静脉内注射到10周龄的雌性C57BL / 6J受体小鼠中一天后每周注射大鼠RBC。
数据表示为平均值±SEM。单方差方差分析用于确定各组之间是否存在具有统计学意义的总体差异。选择未配对和配对的学生t检验来比较两组之间的差异。通过线性回归分析两组之间的相关性。双向重复测量ANOVA用于重复测量变量。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
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