ATP结合物（ABC）和溶质载体（SLC）转运蛋白可在细胞膜上转移多种物质，它们的失调可能引起癌症的耐药性。这项研究调查了胰腺癌患者中先前建议的预后标志物ABCC2和SLC22A3的蛋白表达和细胞定位的意义。在65例胰腺癌患者的肿瘤组织块中评估了ABCC2和SLC22A3的蛋白质定位和刷状边界染色强度，并与临床数据和患者生存率相关联。在单因素分析中，胰腺肿瘤中阴性的SLC22A3刷状边界染色显着增加了疾病进展和患者死亡的风险。多变量分析证实了SLC22A3表达与患者无进展生存相关。对基于核苷类似物的方案进行治疗的患者的亚组分析表明，在肿瘤细胞中刷状边界染色阴性或SLC22A3根尖定位的患者总体生存期较差。阳性ABCC2和阴性SLC22A3刷缘染色的组合预示了最差的总体存活率，并且两种蛋白的刷缘染色均为阳性的患者的总体和无进展生存期最佳。本研究首次表明，在未分层和化疗后的患者中，SLC22A3的蛋白存在以及某种程度上的定位也与胰腺癌的预后密切相关。

胰腺导管腺癌（PDAC，OMIM：260350）发病率居12 个癌症诊断中的全球，但其死亡率预计成为下一个十年内，在美国癌症死亡的第二大原因1，2。PDAC的临床表现为诊断晚，预后差以及对全身化疗长期缺乏总体反应。

ATP结合盒（ABC）转运蛋白和溶质载体（SLC）转运体的下调的过表达被怀疑影响抗癌化学治疗剂包括一些靶向药物的有效的细胞内浓度3，4。有很多不同的证实这种效果许多实例在体外模型系统5，6。所产生的肿瘤细胞的化学抗性导致疾病发展到更晚期。因此，迫切需要发现指示这种情况的高风险的预后因素，并开发减少化学抗药性或使化学抗性细胞再敏感的机会的工具。

在先前的研究中，我们发现与配对的相邻非肿瘤对照组织相比，PDAC患者的肿瘤组织中几种ABC和SLC转运蛋白的转录水平异常。此外，肿瘤内水平的数目与患者临床特征相关联显著转运的7，8。最有趣的是，ABCC2（OMIM：601107）的高转录水平与SLC22A3（OMIM：604842）的低水平的结合显着预测了患者的整体生存率（OS）较差9。

本研究的主要目的是在蛋白质水平上验证该组合在独立系列的PDAC患者中的先前建议的预后作用。因此，我们确定了较大人群的PDAC患者中这些生物标志物的蛋白质含量，并将其与患者生存期进行比较，以证实这种关联背后的进一步机制研究。

耐心

该研究共纳入了65例经手术治疗且经组织学确诊为PDAC的患者，并进行了临床随访。在2002年至2016年之间，所有患者均被招募并在比尔森的教学医院和医学院的外科和肿瘤学系接受了手术和肿瘤治疗。

从病历中检索出以下患者数据：年龄，性别，诊断日期，手术日期，切除范围，肿瘤大小（pT），淋巴结转移（pN），远处转移（cM），临床分期，组织学等级，辅助治疗方案和生存率。患者的临床特征在表1中描述   。所有患者均未接受新辅助化疗。无进展生存期（PFS）可作为治疗结果的衡量指标。PFS定义为手术切除与疾病复发或死亡之间的时间。OS被定义为从手术切除到任何原因死亡之间经过的时间。

这项研究中执行的所有程序均符合捷克共和国比尔森市医学院和教学医院伦理委员会的道德标准（批准参考号301/2019）以及1964年赫尔辛基宣言及其后续修正案或类似规定道德标准。捷克共和国比尔森市医学院和教学医院伦理委员会还批准了本研究的实验方案（批准书号为301/2019）。从研究中包括的所有个体参与者获得知情同意。

免疫组织化学分析

用常规方法将用于光学显微镜的组织固定在4％甲醛中并包埋在石蜡中。从组织块上切下五个微米厚的切片，并用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学（IHC）研究，首先使用Novocastra™Epitope Retrieval Solutions（ABCC2的pH 6和SLC22A3的pH 9）（Leica Biosystems Inc.，Buffalo Grove，IL，美国）通过热诱导抗原决定簇（HIER）处理样品。然后，使用Dako REAL过氧化物酶封闭溶液（Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA）封闭内源过氧化物酶活性，将5％正常山羊血清用于背景封闭（SLC22A3的玻片），并将玻片与以下一级抗体：ABCC2（稀释度1：100，目录号ab3373，Abcam，英国剑桥）和SLC22A3（1：100，目录号ab124826，Abcam）。带有反小鼠的聚合报告酶染色系统（通用免疫过氧化物酶聚合物）和RabbitN-Histofine®Simple Stain MAX PO（MULTI）（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Cosmo Bio USA）用于可视化。载玻片用吉尔的苏木精复染色。使用适当的阳性和阴性对照。首先，主要定位被评估为基础或根尖。然后将刷子边缘的染色评估为阴性或阳性。模棱两可的样本被排除在进一步的统计分析之外（n = 5）。主要定位为基部或根尖。然后将刷子边缘的染色评估为阴性或阳性。模棱两可的样本被排除在进一步的统计分析之外（n = 5）。主要定位为基部或根尖。然后将刷子边缘的染色评估为阴性或阳性。模棱两可的样本被排除在进一步的统计分析之外（n = 5）。

数据分析

所有统计分析均使用SPSS v16.0软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州）进行。通过ANOVA和Pearson检验评估了按临床数据分层的两组患者之间的差异。生存功能通过Kaplan-Meier方法绘制，对数秩和Breslow检验用于评估比较患者组。通过Cox回归进行适应临床因素的多变量分析，该因素显着改变了患者的生存率，即切除切缘和淋巴结转移。

所有P值均通过双面测试计算得出。低于0.05的P值被认为具有统计学意义。

在65例PDAC患者的福尔马林固定石蜡包埋的切片中，通过IHC对ABCC2和SLC22A3蛋白进行了染色（表1中的临床数据   ）。代表性的IHC载玻片如图1所示   。ABCC2和SLC22A3主要位于49％和45％样品的质膜基底侧。对于ABCC2和SLC22A3，分别在45％和29％的患者中观察到阳性的IHC刷缘染色。然后将两个遵循的特征进行组合。

ABCC2和SLC22A3转运蛋白的免疫组织化学。（A）ABCC2阴性和阳性刷缘染色，根尖和基底染色以及阴性和阳性对照的例子。阴性对照：肿瘤组织染色，无一抗。阳性对照：人肾皮质。（B）SLC22A3阴性和阳性刷边界IHC染色，根尖和基底染色以及阳性和阴性对照的例子。阴性对照：肿瘤组织染色，无一抗。阳性对照：人肝。箭头使结果的视觉控制更加容易。比例尺50 µm。

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没有观察到ABCC2和SLC22A3 IHC刷缘染色或定位与患者的性别和年龄，分期，肿瘤大小，是否存在局部和远处转移，肿瘤等级和切除范围有显着相关性。所有患者的中位PFS和OS分别为14±7个月和28±9个月。五名患者失去随访，没有进一步评估。与 完全切除（R0）的患者相比，R1切除的患者的PFS（P  = 0.038，对数秩）和OS（P = 0.001）明显较差。肿瘤细胞侵犯了局部淋巴结的患者（pN1-2）的PFS明显恶化（P = 0.039，对数秩），但没有OS的患者没有这种侵袭（pN0）。因此，随后的多变量分析被调整至淋巴结转移和切除切缘。

然后，我们对患者组的生存功能进行了单变量分析，除以定位或IHC刷缘染色。ILC刷状边界SLC22A3阴性的PDAC患者的PFS（P  = 0.041，Log Rank和P  = 0.024，Breslow;图   2A）和OS（P  = 0.007，Log Rank和P  = 0.020，Breslow ）显着较短。   2B）比患者的肿瘤细胞染色阳性。ABCC2刷缘染色或定位以及SLC22A3定位与患者的存活率无关。

SLC22A3刷缘染色与所有患者的生存之间的关联。绘制了分为阴性和阳性染色组的患者的PFS或OS的Kaplan-Meier生存曲线。虚线表示阴性染色的组，实线表示阳性染色的组。曲线（A）示出了PFS分析的结果以及OS分析的曲线（B）。

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调整至切除切缘和淋巴结转移的多变量分析证实，SLC22A3 IHC刷缘染色阴性代表疾病进展（PFS）的高风险因素（P  = 0.049，危险比= 2.3，95％置信区间= 1.0-5.1），但不是为了死亡（OS）。

两种蛋白的IHC特性组合分析表明，ABCC2和SLC22A3刷缘染色阳性的患者的PFS最好，但其他组合的效果相同（P  = 0.035，Log Rank和P  = 0.092，Breslow；图。   图3A）。阳性ABCC2和SLC22A3刷缘染色相结合也可预测最佳OS，但此外，阳性ABCC2和阴性SLC22A3瘤内刷缘染色相结合的患者显然具有最差的OS（P  = 0.048，Log Rank和P  = 0.013， Breslow；图   3B）。本地化的组合不会影响操作系统以及PFS。由于在比较的患者亚组中观察次数太少，因此未进行多变量分析。

SLC22A3和ABCC2刷缘染色组合在所有患者中的生存分析。绘制患者的PFS或OS的Kaplan-Meier生存曲线，分为ABCC2阴性/ SLC22A3阴性（虚线），ABCC2阴性/ SLC22A3阳性（阴影线），ABCC2阳性/ SLC22A3阴性（虚线）行）和ABCC2阳性/ SLC22A3阳性（实线）。曲线（A）示出了PFS分析的结果以及OS分析的曲线（B）。

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对基于核苷类似物（吉西他滨和5-氟尿嘧啶，N = 27）治疗方案的患者进行的分层分析再次表明，SLC22A3的IHC刷缘染色阴性的患者的PFS明显较差（P  = 0.010，对数秩和P  = 0.013， Breslow；图   4A）和OS（P  = 0.030，对数秩，P  = 0.040，Breslow；图   4B）。此外，顶端SLC22A3定位的患者的OS明显比基底定位的患者差（P  = 0.021，Log Rank和P  = 0.029，Breslow；图   4C））。由于在所比较的患者亚组中观察值太少，因此未进行组合分析和多变量分析。

SLC22A3刷缘染色和定位与化疗患者的生存相关。绘制了患者的PFS或OS的Kaplan-Meier生存曲线，分为阴性和阳性或根尖和基础定位组。虚线表示阴性染色的组，实线表示阳性染色的组。曲线A示出了PFS分析的结果以及OS分析的曲线（B）。在图（C）中，实线表示与患者的OS相比具有质膜上的SLC22A3蛋白的基端定位的基团，而虚线表示基膜的根尖定位的基团。

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基于先前观察到PDAC患者的生存率是两个不经常研究膜转运蛋白的转录水平的协会7，8，9，我们在一个更大的研究分析其蛋白质染色强度显着预后因子和细胞定位的IHC。我们的数据清楚地表明，SLC22A3蛋白的存在与PDAC患者的预后相关。

SLC22A3蛋白表达在胰腺癌中的作用迄今尚未解决。目前的研究表明，在肿瘤细胞中可检测到SLC22A3刷状边界IHC染色的患者的OS和PFS明显长于没有它的患者。SLC22A3在广泛的人体组织中表达，主要在细胞质膜中表达，其中它主动摄取大量的内源性底物和包括抗肿瘤药在内的异种生物。SLC22A3的基因表达在遗传和表观遗传上均受到调控10。关于SLC22A3在癌症中的作用的当前观点有两个方面。

首先，SLC22A3表达先前与几种癌症的发生和发展有关。具体地，遗传变异SLC22A3易患结肠癌和前列腺癌的11，12，13。在基因变异rs2504938协会SLC22A3与胰腺癌患者的总生存期最近公布的14。肝细胞癌表达较低SLC22A3蛋白水平比非肿瘤组织15相比野生型小鼠和更大的尺寸和在SLC22A3基因敲除小鼠模型中观察到化学诱导的肝肿瘤的数目16。与这些观察结果一致，SLC22A3被报道为在家族性食管鳞状细胞癌中的转移抑制因子，它直接抑制ACTN4（αactin 4，OMIM：604638）17。最近，描述了SLC22A3启动子高甲基化与中国人发生家族性食管鳞状细胞癌的较高风险之间的相关性，以及SLC22A3在热应激诱导的氧化性DNA损伤中的新功能18。另一方面，SLC22A3的过表达促进细胞增殖，并刺激结直肠癌细胞系模型的迁移和侵袭，而表达的抑制则逆转了这些作用13。综上，先前的研究表明，SLC22A3的遗传，表观遗传或表型性质可作为癌症的假定风险预测或预后生物标志物。

其次，SLC22A3作为多种化学物质（包括抗肿瘤药）的摄取转运蛋白，与癌症的治疗效果和个体化有关。在保养法比在非应答者的结直肠癌患者响应辅助化疗FOLFOX（5-氟尿嘧啶，亚叶酸和奥沙利铂的组合），观察到较高的预处理肿瘤内SLC22A3蛋白表达19表明这个生物标记的潜在预测文字。与我们的发现一致，分类为具有高SLC22A3蛋白水平的头颈部鳞状细胞癌患者在顺铂治疗后总体生存率提高，并且相应地，细胞系模型对该化合物的体外敏感性与SLC22A3表达相关20。除了常用的铂化合物，SLC22A3在二甲双胍 21的治疗作用中也发挥着作用。高SLC22A3表达被测试为几种癌症的二甲双胍潜在生物标志物替代预测响应 22，23。

总体而言，本研究和以前的报告表明，SLC22A3可以作为用于针对PDAC和其他几种（主要是胃肠道）癌症的个性化治疗的随访验证和功能研究的假定的预后和预测生物标志物。IHC是在世界范围内较大的医疗中心的所有病理学部门中建立的常规方法，因此可以快速使用已验证的生物标记物。

最近的遗传研究报道，在疾病早期，ABCC2基因的多个多态性（rs3740067，rs3740073和rs717620）与PDAC患者的OS显着相关，并可能成为预后的生物标志物24。该观察结果补充了先前的研究，提示ABCC2多态性rs2273697与较差的OS和PDAC患者的放化疗反应25相关，并且ABCC2蛋白表达上调导致在体外吉西他滨和伊立替康的敏感性改变26。最近的另一项研究指出，在体外 PANC-1胰腺细胞模型中沉默ABCC2蛋白表达可增加奥沙利铂的积累和细胞毒性27。尽管在各种实验环境中已经很好地证明了ABCC2与PDAC治疗反应与预后之间的关系，但本研究并未证明ABCC2蛋白的表达与PDAC患者的生存相关。

在本研究中检测到的ABCC2和SLC22A3组合的预后潜力代表了一个全新的领域。根据主要功能的定义，即外排转运蛋白和摄取转运蛋白的结合，即通过ABC将药物输出到细胞或地窖之外，通过SLC将药物输入到内部，可能比基于单个生物标记物的预测具有更强的作用。因此，我们假设ABCC2阴性和SLC22A3阳性表达应与患者长期生存相关，而与患者不良生存相关。实际上，阳性ABCC2和阳性SLC22A3的组合可预测最长的生存期（包括PFS和OS），这表明在这种情况下，总蛋白表达失调的程度是预后的。另一方面，阳性ABCC2和阴性SLC22A3蛋白表达的结合确实可以预测患者的总体生存期最短，并且符合基于功能的假设。但是，将队列细分为非常小的子组会带来统计功效的问题，尤其是在很少研究的疾病中，因此，必须重复这些观察结果。

我们知道我们研究的某些局限性。首先，适度的样本量可能会被认为很小。但是，PDAC的发生率虽然迅速上升，但仍然很低，主要是其可切除性的百分比非常有限（10％至15％）。因此，很难对更多的患者进行临床随访。由于疾病的严重特征，导致患者退出研究的比率也很高。其次，发表了许多评估肿瘤细胞中蛋白质外观的系统，尤其是在实验性和研究较少的蛋白质中，决定采用哪种报道的方法是很复杂的。因此，我们选择了半定量和定性两种方法来稳健地评估目标蛋白质的相关性。

另一方面，这项研究也具有一定的优势。所有患者均在一个区域中心招募并随访，因此代表了接受统一治疗和调查的同类患者。此外，本研究是由先前在转录水平上对不同患者组（也是单中心队列）的观察所推动的，因此，现在不能将获得的一致结果归因于产生假说筛查的机会。

综上所述，我们的研究结果证实了SLC22A3蛋白在PDAC中的预后作用，此前有针对性的转录组研究提示了这一点。在这方面，ABCC2转运蛋白似乎起着很小的作用，但是在小规模亚组分析中观察到的两种生物标志物组合的作用应通过独立研究进一步验证。

道德认可

在涉及人类参与者的研究中进行的所有程序均符合捷克共和国比尔森市医学院和教学医院伦理委员会的道德标准（参考编号301/2019）以及1964年赫尔辛基宣言及其后续修正案或可比的道德标准。本文不包含任何作者对动物进行的任何研究。