摘要
微管是真核细胞骨架的重要组成部分。它们的结构组织受到核苷酸结合和许多微管相关蛋白（MAPs）的调节。尽管低温EM和X射线晶体学已提供了MAP与微管晶格之间相互作用的详细视图，但对MAP及其固有的无序区如何与动态微管表面相互作用的了解甚少。NMR具有直接探测此类相互作用的潜力，但迄今为止，微管蛋白产量低已被排除在外。我们提出了一种产生[ 13 C，15来自人细胞的N]标记功能性微管（MT），用于固态NMR研究。这种方法使我们能够证明MAP可以不同地调节C末端微管蛋白尾巴的快速时标动力学，暗示了不同的相互作用模式。我们的研究结果为深入的NMR研究参与MT组装及其与其他细胞成分相互作用的蛋白质动力学铺平了道路。
在真核细胞中，微管（MTs）是许多生物学过程必不可少的细胞骨架聚合物，包括细胞分裂，迁移，极化和细胞内运输。的MT是从α/β微管蛋白异源二聚体组装并有内在极化，具有高动态，β微管蛋白暴露加结束时，在处理的生长和收缩之间从而迅速切换称为“动力不稳定性” 1。MT的动态不稳定性是由GTP结合和微管蛋白二聚体上的水解引起的。
许多MT相关蛋白（MAPS），通过MT晶格和/或MT端部相互作用调节MT的结构和功能2，3。低温电子显微镜（EM）有了长足的进步，以阐明图和MT之间的相互作用晶格4，5，包括冷冻电镜重建MAP tau结合到MT的6。然而，由于其固有的柔韧性，直接观察微管蛋白的动态区域，包括对结合不同的MT相关蛋白（例如tau 6）至关重要的非结构化C末端尾巴，仍然具有挑战性。为了模拟这样的微管蛋白区域，使用了计算方法，例如在tau结合MT 6的情况下或者，最近要确定α-微管蛋白乙酰化对MT结构和稳定性的影响7。考虑到蛋白质动力学与MT功能的广泛相关性，尤其是微管蛋白尾巴与细胞过程和人类疾病的相关性8，因此对MT与MAPs的动态相互作用的直接实验见解引起了极大的兴趣。
核磁共振（NMR）光谱已经显示出在原子分辨率和在不同的时间尺度（例如，参见参考文献提供了独特的结构见解异构和动力系统9，10，11，12）。此前，固和溶液状态NMR已被用于研究MTS和同位素标记的地图或小药物之间的相互作用13，14，15，16，17，18，19。但是，这些研究仅限于研究可以使用细菌表达系统进行同位素标记的配体。到目前为止，由于蛋白质量不足，无法直接研究带有NMR活性标记的人类细胞的功能MT。另外，对完整MT的溶液状态NMR研究因蛋白质大小和分子翻转不足而受阻。在下文中，我们描述了一种固态NMR（ssNMR）方法来直接研究标记MT与它们的结合伴侣的相互作用。特别是，这种方法使我们能够探查完整MT的动力学。此外，我们检查了两种不同的MT相关蛋白对C末端尾部动力学的影响。15，19。此外，我们研究MAP7家族蛋白，从而起到调节基于驱动蛋白的胞内运输和其重要作用的微管结合域（MTBD）的影响MT结合的结构细节目前还尚不清楚 20，21，22，23。我们的结果表明，MAP-微管蛋白尾巴相互作用既可能涉及移动链之间的快速尺度相互作用，也可能涉及稳定MT-MAP配合物中的缓慢时间尺度结合/解离事件。
为了获得毫克量的人类MT，我们使用了HeLa S3细胞，该细胞不仅可以作为贴壁培养物生长，而且可以悬浮培养，从而提高了大规模培养物的效率24。此外，将HeLa S3细胞表达只有少数微管蛋白同种型25，26产生的比较均匀的样品英寸 通过使用聚合和解聚循环去除污染物，我们从细胞裂解物中分离出微管蛋白（图 1a，b）。随后，我们将微管蛋白聚合成高浓度1,4-哌嗪二乙烷磺酸（PIPES）的MT，以除去MAPs结合并用紫杉醇27稳定MT。。如十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳所证实，紫杉醇稳定的MT的纯度为90％（图 1b）。为了检查功能，我们将制备的MT与含有MAP7域的蛋白质3（MAP7D3，以下简称MAP7的荧光标记MTBD）一起孵育，该MTBD用作MT结合探针，并发现纯化的MT由该蛋白质片段（补充图 1A，B，左）。值得注意的是，MAP7的结合诱导了MT的一些结合（补充图 1A，B）。但是，MT捆绑不会影响每个单独的MT 28的微管蛋白C末端尾巴的结构和动力学，因此不会干扰我们在下面介绍的ssNMR实验。我们还研究了HeLa S3衍生的微管蛋白是否可以在不使用紫杉醇的情况下进行聚合，并通过在不使用紫杉醇的情况下制备其他样品来显示动态不稳定性，从而导致随后的解聚反应产生可溶性微管蛋白。所得的微管蛋白用于体外重组测定，其中MTs是由稳定的MT种子聚合而成的，其中GFP标记的末端结合蛋白3（EB3）作为末端的标记。我们准备的微管蛋白聚合成MT并显示出生长和缩短的阶段（图 1c和补充图 1C，电影 1），表明使用我们的方案纯化的微管蛋白仍具有聚合能力。综上所述，该方案使我们能够从可能形成MT的哺乳动物细胞中纯化功能性微管蛋白，从而为下文所述的NMR实验提供了基础。
样品制备的示意图。b每个纯化步骤的SDS-PAGE分析。M：蛋白质标记；S：上清液；P：颗粒；第一聚合：第一聚合；解聚：解聚；紫杉醇聚：与紫杉醇聚合。未裁剪的凝胶作为源数据文件提供。c纯化的HeLa S3微管蛋白的功能表征。在TIRF显微镜上成像10分钟的体外聚合MT的活动记录仪（左）和电影静止图像（右）对应于图 S1C。显示了时间点以及MT的正号（+）和负号（-）。d EM进行MAS NMR实验之前和之后HeLa MT的形态表征。
为了获得用于ssNMR研究的同位素标记的MT，我们使用上述方法在2L [ 13 C，15 N]标记的培养基中培养了HeLa S3细胞，并获得了同位素标记的紫杉醇MTs（以下简称MTs）。然后将样品装入1.3 mm MAS NMR转子中，并使用快速MAS速率进行延长的测量时间。为了确保在这种条件下的样品完整性，我们使用透射EM和TIRF显微镜检查，证实我们的MT样品保持完整（图 1d和补充图 1B）。
为了评价样品的质量，我们首先记录在2D 13 C- 13使用射频驱动的再偶联（RFDR）基于偶极Ç相关频谱29再偶联和比较我们的数据到化学位移预测为MTS（PDB ID：5SYF）使用FANDAS 2.0 30。总体而言，光谱与计算机估计相吻合（图 2a，左）。例如，在丝氨酸，苏氨酸和丙氨酸残基的Cα–Cβ区域，观察到的信号与α-螺旋和β-链构象的预测在质量上吻合（图 2a，右）。有趣的是，未观察到丙氨酸信号（图 2a）。，右上角）位于随机螺旋结构中，并与微管蛋白环中的残基有关。后者的观察结果与我们在基于偶极子的实验中在实验温度（〜298 K）下在其他地方讨论的循环运动的发生是一致的7 尽管对此类效应的残基特异性分析将需要扩展至3D ssNMR光谱学，可能还需要结合氨基酸特异性标记11，但图2中观察到的此类大分子配合物的光谱分辨率 有利于聚合的均质样品MTs。
源自与MTs结合的核苷酸的31 P NMR信号进一步证实了这一观点。通常，α/β-微管蛋白二聚体包含两个核苷酸结合位点。与α-微管蛋白结合的GTP分子是不可水解的，而与β-微管蛋白结合的核苷酸是可交换的，并且MT聚合31时GTP被水解为GDP （图 2b，左）。确实，我们观察到1D信号SSNMR来自GTP和GDP 31 P CPMAS光谱（图 2b中，右），相对于上冻干的MT以前的结果很好地分辨32。观察到的光谱分辨率使我们能够区分这两种分子的NMR信号（补充表 1）32，33。积分峰强度（补充表 1 GTP为1：1：1，这是在协议与先前的研究）用的概念，即GDP的摩尔比密切相关4，31进一步支持的想法，我们的SSNMR制备物以及折叠和功能。有趣的是，我们还观察到了在-2.7 ppm处的另一个宽峰，这可能是由于共纯化脂质34所致。
为了探测移动MT蛋白区段包括C-末端微管蛋白尾部（图 3A）中，我们进行了一系列的基于标量（基于J）的SSNMR实验35以前大生物分子内揭示柔性部件36，37，38，39。如其他地方所讨论36，40在10的范围内，与显著相关时间分子运动-9至10 -7 s必须是存在以产生在这样的SSNMR相关实验的NMR信号。另一方面，较慢的运动（在毫秒或更慢的范围内）将导致信号丢失（见下文）。在当前情况下，二维15N-HSQC光谱包含几个具有有限光谱分散度的信号（图 3b），这与可移动的非结构化蛋白区域的存在一致。使用附加的2D 13 C-HSQC（图 3c，d）15 N编辑的1 H – 1 H自旋扩散光谱（图 3d），我们可以确认在15 N-HSQC光谱中观察到的相关性主要归因于甘氨酸，谷氨酸和丙氨酸是微管蛋白尾巴中最丰富的残基（图 3a）。此外，在2D 13中看到的相应共振频率C-HSQC反映了这些氨基酸的随机螺旋化学位移。请注意，后一光谱包含来自流动侧链的其他信号，以及源自残留脂质（图 2b）和缓冲液的相关性。
a微管蛋白的N和C末端序列。带下划线的残基在我们的ssNMR数据集中显示出顺序相关性。根据先前的结果，使用α1和β1微管蛋白同种型的蛋白质序列进行分析26。b [ 13 C，15 N]标记的MT的2D 15 N-HSQC 显示了柔韧性的微管蛋白尾巴。[ 13 C，15 N]标记的MT的c 2D 13 C-HSQC 显示微管蛋白尾巴中存在的残基。由于具有很高的灵活性，还观察到了来自亮氨酸，赖氨酸以及缓冲液化合物和脂质的侧链的信号。d 3D条带15经N编辑的1 H – 1 H自旋扩散实验，显示了13 C-HSQC和15 N-HSQC之间的联系。
通过追踪HN与Hβ或Hγ相关性，我们可以进一步确定源自谷氨酸和丙氨酸残基的相关性。有趣的是，一个谷氨酸NH信号显示与甘氨酸的Hα相关，表明相应的谷氨酸残基紧邻甘氨酸残基（图 3d，第二条）。仅对α-微管蛋白C-末端尾巴具有这种相关性（图 3a）。另一方面，另一个谷氨酸峰显示没有与甘氨酸Hα接触（图 3d，第三个条带），表明这些相关性很可能反映了β-微管蛋白C末端尾巴的谷氨酸残基（图 3a）。）。另外，我们检测到强度比约为3：1的两个甘氨酸信号，与α-微管蛋白尾巴的EGE基序中的三个甘氨酸残基和一个代表β-微管蛋白的FGE基序的甘氨酸相符。这些暂定分配与先前包含肽段的解决方案状态NMR研究41一致，该肽包含人α-微管蛋白的C末端残基，使我们能够暂定分配α-微管蛋白的最大C末端残基，即Tyr451（图 3a）。此外，基于其高15值，我们可以鉴定出一种最可能反映β-微管蛋白最后残基的丙氨酸相关性。N化学位移值，及其酰胺质子与Ala和Glu的Hβ的相关性。最后，由于3D光谱中缺乏交叉峰（图3b，由星号表示的峰），可能至少部分源于N-末端残基的两个相关性（图 3a）仍未分配 。相应的共振频率将反对在四膜虫嗜热小管蛋白42的先前溶液状态NMR中看到的翻译后修饰（PTM）。实际上，早期的研究表明，HeLa微管蛋白在微管蛋白尾巴上大多缺乏PTMs 43。两者合计，我们的研究结果表明，α-和β-微管蛋白尾巴都是无序的，并且在纳秒级的时间内具有很高的移动性。
在我们以前的工作中，我们可以破译分子特性，使该CAMSAP蛋白家族的CKK域优先与弯曲原丝和MT负结束常规MT晶格之间的过渡区副15，19。我们发现，由折叠的蛋白核心和无序的末端组成的CKK域与两个侧向连接的微管蛋白二聚体之间的凹槽相关联，并发现CKKs可以巧妙地区分特定的微管蛋白构象，以实现MT负端识别19。但是，这些研究并未揭示微管蛋白尾巴如何对CKK结合很重要15参与这些事件。使用我们的ssNMR方案，以下我们研究了CKK结合对C末端微管蛋白尾巴的影响。为了这个目的，我们纯化未标记CAMSAP1 CKK N1492A突变体，相比于野生型CKK表现出降低的负端和选择性结合具有更高的亲和性的MT 15，19。然后，我们将未标记的CKK添加到[ 13 C，15 N]标记的MT中，并重复了15 N-HSQC实验。与游离的[ 13 C，15 N]标记的MT相比，我们观察到了二维相关光谱的强烈变化（图 4a）与MT的精氨酸残基以及α-微管蛋白和β-微管蛋白的C端残基有关。在下文中，我们将讨论这三个方面的ssNMR光谱发现及其与先前结果的关系。
从[ 13 C，15 N]标记的MT（黑色）和未标记的CAMSAP1 CKK N1492A与[ 13 C，15 N]标记的MT（品红色）形成的2D 15 N-HSQC光谱的比较。b放大CKK-MT冷冻EM结构（PDB 5M5C）中发现的精氨酸残基，参考编号。15）位于α-微管蛋白（黄色）和β-微管蛋白（灰色）上，并且在距CKK域6Å之内（洋红色）。C上图：CKK末端的氨基酸序列，在星标指示的冷冻EM结构（PDB 5M5C）中观察到最后一个残基。底部：黄色和黑色星号分别表示检测到的冷冻EM结构（PDB 5M5C）的α-微管蛋白和β-微管蛋白的C末端尾巴。d动态的（用双头箭头指示）C末端微管蛋白（黑色和黄色虚线）和CKK（品红色）尾巴。蓝线表示在微管蛋白尾部的冷冻-EM结构中观察到的最后一个残基（由黑色和黄色星号表示）与在冷冻-EM中观察到的最后一个CKK C末端残基（品红色星）之间的距离。Ë动态（由双向箭头指示）CKK N末端（品红色虚线）和β-微管蛋白C末端（黑色虚线）。蓝线表示在cryo-EM结构中检测到的β-微管蛋白的最后一个残基与CKK的第一个残基之间的距离。
首先，与游离MTs相比，精氨酸残基侧链的信号大大降低。该观察结果证实了我们先前的发现，即α-微管蛋白和β-微管蛋白微管蛋白的精氨酸残基均位于CKK结构域15的结合区域中（图 4b）。此外，我们最近的研究也显示CKK的是，结合诱导原丝偏斜，导致微管蛋白二聚体之间的减小横向空间15，19。位于距CKK结合表位较远的区域但参与微管蛋白之间的这些侧向相互作用的精氨酸残基也可能因此变得不太动态44。
其次，在CKK结合MTs后，包括β-微管蛋白的最后一个C末端残基A444在内的一些相关性消失，并且在丙氨酸，甘氨酸和酪氨酸区域中出现了相关性（图 4a）。这些光谱变化将与CKK结合时在快速时间尺度9上的构象交换一致。有趣的是，FGE段中的甘氨酸和丙氨酸残基仅在β-微管蛋白的C末端尾巴中发现，这表明β-微管蛋白的尾巴参与了这种动态相互作用。值得注意的是，在先前的冷冻EM结构15中未观察到β-微管蛋白（17个残基，图4c）和CKK域（13个残基，图 4c）的C末端。 。因此，最有可能的是，CKK C末端在结合MT后保留构象变异性。假设完全扩展主链构象，CKK和微管蛋白的C端尾二者可以采样至少60和45埃的距离范围45，分别，这将容易地允许两个移动尾部之间，例如动态相互作用如图8中所示。 4D。值得注意的是，先前的EM和ssNMR实验表明CKK的N末端（9个残基）可以与β-微管蛋白的C末端部分相互作用（图 4c，e），这与我们的NMR数据是一致的。
第三，我们还观察到EKK片段和残基Y451中的甘氨酸分别经CKK结合后，ssNMR信号频率和强度的变化都在α-微管蛋白的C末端尾巴中发现（图 4a）。如图4c，d所示， 具有12个残基的α-微管蛋白的C末端尾巴也可以与CKK的C末端动态相互作用。
两者合计，我们的结果强烈表明，C末端微管蛋白尾巴在纳秒至微秒的时间尺度上与CKK域动态相互作用。将这些结果与我们先前的EM和ssNMR数据结合起来，进一步完善了这一概念，这表明CKK C末端与α-和β-微管蛋白相互作用，而CKK N末端与β-C的C末端快速相互作用。微管蛋白。未来的ssNMR实验可能使我们能够进一步剖析这些动态相互作用的细节，包括以残基特异性方式更精确地确定运动时间尺度。
MAP7蛋白家族在调节基于驱动蛋白的细胞内转运中起重要作用。然而，MAP7-MT相互作用的结构细节目前未知20，21，22。根据其氨基酸序列对MAP7进行的二级结构预测以及对溶液中游离MAP7的初步NMR实验表明，MAP7结构域采用高度α-螺旋结构，由短环隔开，该短环包含R144至T146，侧接非结构化的终端（图 5a）。
JPred 58对MAP7-MTBD 的二级结构预测。b从[ 13 C，15 N]标记的MT（黑色）和未标记的MAP7-MTBD与[ 13 C，15 N]标记的MT（青色）形成的2D 15 N-HSQC光谱的光谱比较。c MAP7-MTBD结合的MT和游离MT之间在15 N-HSQC 中解析峰的信号强度比。基于两个光谱中每个峰的NMR信噪比计算误差线。信号强度比作为源数据文件提供。
为了深入了解MT尾巴与结合的MAP7的相互作用，我们以2：1的比例添加了未标记的MAP7以确保MT的完整修饰后，在[ 13 C，15 N]标记的MT 上重复了基于J的实验（请参见方法） 。有趣的是，与CKK域与MT结合的情况不同，与游离MT的情况相比，我们未在2D 15 N-HSQC ssNMR相关谱中检测到任何频率变化（图 5b，青色）。取而代之的是，来自C末端微管蛋白尾部的信号（包括已识别的EGE和FGE片段以及其他E残基）均被强烈衰减（图 5c和补充图 2）。）与α-和β-微管蛋白的最C末端残基分别为Y451和A444。这些观察结果可以通过自由移动的α-和β-微管蛋白尾部构象（在光谱中可见）与直接与MAP7结合的C端尾部之间的缓慢交换过程（毫秒级或更长时间）来解释。请注意，后者状态在我们基于J的实验中将是不可见的。在一个简单的两态模型，结合的群体的相对量由下式给出P 绑定 = 1 - 我结合 / 我自由（参见，例如，参考文献9，46）见于图 5c中导致分别在α和β微管蛋白尾巴中EGE和FGE末端片段周围的结合残基高达80％的值，对于大多数C末端残基，α的结合种群减少至大约65％和25％ -微管蛋白（Tyr 451）和β-微管蛋白（Ala 444）。与动态微管蛋白C末端保持快速动态的CKK情况不同，这些发现因此表明MT末端在毫秒或更长的时间尺度上直接与MAP7结合。同时，MT-MAP7复合物的形成也导致精氨酸侧链动力学的降低，这从我们的实验数据（图4b）中可以明显看出， 并且使我们想起了CKK结合的情况。
蛋白质动力学至关重要地参与MT的组织，包括生长状态和收缩状态之间的随机切换，以及MAP和其他细胞因子对MT的调节。NMR具有直接探测此类过程的潜力，只要可以获得功能性和NMR活性的MT。我们已经显示，高分辨率ssNMR光谱可以记录在从人细胞获得的[ 13 C，15 N]标记的MT上。如体外MT动力学测定所证实的，MT 以功能形式24从微管蛋白聚合。另外，如果第二步聚合反应中不包含紫杉醇，我们的方案可以得到纯化的功能性微管蛋白（见图 1c）。）。此类制备方法可用于溶液（或解聚后）中人类微管蛋白的NMR研究，例如研究MT的成核及其通过不同MAP和潜在相关相变的调控47。窄31P NMR线表明微管蛋白亚基上核苷酸的均匀结合，导致MT正确聚合。这种观点已通过基于二维偶极子的相关性实验进一步证实，该实验与低温-EM结构中所见的MT晶格在质量上吻合。在基于2s ssNMR偶极子的数据中不存在环信号，可能表明微管蛋白结构域预期的蛋白质环区域动态增强，这对于MT动态不稳定或参与PTM（例如残基P37-D47的α-微管蛋白环）至关重要（也称为αK40回路7）。进一步的ssNMR研究（可能使用三维或更高维的ssNMR实验）可以与定制的标记结合，揭示这些运动的确切细节。
作为这些实验的补充，质子检测的基于标量的2D和3D ssNMR实验使我们能够直接研究与MAP结合至关重要的无序，柔性微管蛋白尾巴41并且在所有可用的高分辨率结构中都不可见。在当前情况下，我们跟踪了CAMSAP和MAP7的CKK结构域的结合对α-和β-微管蛋白C末端尾巴动力学的影响。我们的数据表明，MAP-微管蛋白尾巴相互作用可以在很宽的时间范围内发生。对于CKK，α-和β-微管蛋白C末端尾巴的动力学都被CKK域快速调节（以纳秒为单位），这证实了我们先前的发现：微管蛋白C末端尾巴对CKK很重要捆绑。这些实验的组合与我们先前的冷冻电镜和SSNMR分析研究的结果15，19提供了有关这些动态相互作用的详细信息的进一步见解，并表明CKK的无序末端参与了这些相互作用。另一方面，与MTs结合的MAP7的特征是微管蛋白C末端的尾巴在较慢（毫秒或更长）的时间尺度上在结合（主要状态）和游离（次要状态）构象之间交换。
CKK和MAP7与微管蛋白尾巴结合的显着差异可能部分与MAP本身的结构和动力学性质有关。例如，可移动的CKK末端包含几个带正电荷的氨基酸（图 4c），而在MAP7的情况下，此类残基主要存在于MAP7的推定结构核心中（图 5a）。此外，MT上MAP结合表位的分子细节可能在定义尾巴相互作用中起作用。正如我们早前显示15，19，CKK绑定将原丝之间。另一方面，已知MAP7竞争与MT 20的结合与tau蛋白有关，因此很可能与原丝峰有关，如tau 6所示。进一步的ssNMR研究可能有助于剖析这些依赖性，包括与C末端尾部相互作用的确切CKK和MAP7区。此类研究可能涉及同位素标记的MAP或混合标记的48种 MAP-MT制剂。此外，提出的方法可以很容易地扩展到研究MAPs的更长的变体之间的相互作用，这些变体除了最小的MT结合区之外，还包括内在无序的蛋白质结构域以及Kinesin-1结合结构域22。正如我们最近对mRNA加工体的情况所表明的，39，这样的研究不仅可以瞄准真正的MT，但他们也可以揭示动态交互由tau或其他地图的冷凝导致MT格条块47，49，50。此类NMR实验与从冷冻EM和荧光显微镜实验获得的数据相结合，可能会导致对定义MT与MAP或其他调节MT功能的细胞相互作用的结构和动力学方面的全面了解。
所述的HeLa S3细胞系（ATCC ® CCL2.2 ™）用于培养。以与先前研究51中所述相同的方式制备[ 13 C，15 N]标记的DMEM培养基，除了我们使用3.5 g / L葡萄糖以维持悬浮培养中的细胞活力。首先在两个150mm细胞培养皿中的标记培养基中培养细胞，然后将其转移到具有相同培养基的12个皿中。当培养物在平板上达到约80％的融合度时，将细胞用胰蛋白酶消化并转移到2 L标记的培养基中，并在7 1 L锥形瓶（Corning）中培养，直到细胞密度达到〜1.2–1.5×10 6 / mL 。然后通过500×离心收集细胞 g在4°C下放置20分钟。收集细胞沉淀，重悬于磷酸盐缓冲液中，在4°C下以500× g再次离心 15分钟，用于MT制备。
基于公开的方案进行紫杉醇稳定MT的纯化52，53稍作修改。首先将收获的细胞重悬于1 g细胞/ mL裂解缓冲液（80 mM PIPES pH 6.8、1 mM EGTA，1 mM MgCl 2，1 mMβ-巯基乙醇，1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂（Roche）中，并通过在冰上裂解通过French Press匀浆器在1000 psi下3次，然后将裂解的细胞在4℃ 以120,000× g离心30分钟，收集上清液，再以5000× g离心上清液。 在4°C下放置15分钟，以去除残留的细胞碎片，然后加入一半体积的甘油和1 mM GTP并充分混合。通过将混合物在30°C下孵育30分钟来进行MT聚合。随后，将粗制的MT颗粒在30°C 下以150,000× g（Type 70.1 Ti，Beckman Coulter）离心分离 30分钟，并置于冰上。然后将沉淀重悬于补充有蛋白酶抑制剂的BRB80缓冲液（80 mM PIPES pH 6.8，1 mM EGTA，1 mM MgCl 2）中，并在冰上放置30分钟以使MT解聚。为了更有效地解聚，将溶液频繁重悬，然后以150,000× g离心。 （Type 70.1 Ti，Beckman Coulter）在4°C下放置30分钟，并收集上清液。高浓度PIPES等体积缓冲液（1M PIPES pH为6.8，10毫摩尔MgCl 2，20mM的EGTA），用等体积的甘油和1mM GTP一起然后加入到上清液中，并充分混合。再次在30℃下进行MT聚合30分钟。随后，将20μM紫杉醇（Paclitaxel，Sigma）添加到反应中，孵育20分钟以生成紫杉醇稳定的MT。然后将紫杉醇稳定的MTs 在30°C 下以150,000× g（TLA-55，Beckman Coulter）离心30分钟，用含有20μM紫杉醇和蛋白酶抑制剂的BRB80洗涤。
对于所有体外测定，以与上述相同的方式制备紫杉醇稳定的MT。关于用于体外动力学测定的样品，微管蛋白的制备是相似的，除了在第二次MT聚合反应中不包括紫杉醇。在第二次MT聚合反应后，将MTs离心下来并重悬在冰冷的BRB80中，其中补充了蛋白酶抑制剂。第二次解聚在冰上进行30分钟，然后在150,000× g下于4°C 离心 30分钟。将纯化的微管蛋白等分，并在液氮中速冻，储存在-80°C直至使用。
通过将含有70％未标记，18％生物素-微管蛋白和12％HiLyte488-微管蛋白的20μM猪微管蛋白混合物与1 mM胍基-（α，β）-亚甲基二膦酸酯（GMPCPP）在37°C下孵育30分钟来制备MT种子。通过在Airfuge中离心5分钟从混合物中分离出聚合的MT。MT在1 mM GMPCPP中进行一轮解聚和聚合反应，最终的MT种子存储在含有10％甘油的MRB80缓冲液（80 mM K-PIPES pH 6.8、1 mM EGTA，4 mM MgCl 2）中。
在流动室中进行体外重构测定。通过用双面胶带将经过等离子清洁的玻璃盖玻片粘贴在显微镜载玻片上来组装流室。紫杉醇稳定的HeLa MTs的测定是在MRB80预洗室中进行的。体外反应混合物由15μMHeLa MTs（由20μMTaxol稳定）组成，它们在MAS于44 kHz持续24小时之前或之后，150 nM MAP7D3-MTBD，50 mM KCl，0.1％甲基纤维素，0.5 mg / ml κ-酪蛋白，1 mM GTP，除氧系统（20 mM葡萄糖，200μg/ ml过氧化氢酶，400μg/ ml葡萄糖氧化酶，4 mM DTT）。在Airfuge中以119,000× g离心5分钟后 ，将反应混合物添加至流室并用真空油脂密封。
动态MT分析在流动室中进行，该流动室通过与0.2 mg / ml PLL-PEG-生物素（Surface Solutions，瑞士）和1 mg / ml NeutrAvidin在MRB80缓冲液中依次温育5分钟而功能化。MT种子附着在生物素-NeutrAvidin连接上，并与1 mg / mlκ-酪蛋白一起孵育。体外反应混合物由15μMHeLa微管蛋白（用牛血清白蛋白标准品量化），20 nM GFP-EB3和0.5μM罗丹明标记的猪脑微管蛋白，50 mM KCl，0.1％甲基纤维素，0.5 mg / mlκ-酪蛋白组成，1 mM GTP，除氧系统（20 mM葡萄糖，200μg/ ml过氧化氢酶，400μg/ ml葡萄糖氧化酶，4 mM DTT）。在Airfuge中以119,000 g离心5分钟后 然后，将反应混合物加入到装有HiLyte-488 MT种子的流动室中，并用真空油脂密封。HiLyte488-和若丹明-微管蛋白购自Cytoskeleton Inc.
所有体外实验均在30°C下进行。使用配备了尼康CFI Apo TIRF 100×1.49 NA油物镜的尼康Eclipse Ti-E（尼康）和完善的聚焦系统（尼康）在倒置研究显微镜Nikon Eclipse Ti-E（Nikon）上使用全内反射荧光（TIRF）显微镜收集数据（日本），Photometrics Evolve 512 EMCCD（Roper Scientific）和Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD（Roper Scientific）并由MetaMorph 7.7软件（Molecular Devices，CA）控制。显微镜装有由Roper Scientific France / PICT-IBiSA（居里研究所）改良的TIRF-E电动TIRF照明器。对于激发激光器，我们使用了491 nm 100 mW Stradus（Vortran），561 nm 100 mW Jive（Cobolt）和642 nm 110 mW Stradus（Vortran）。我们使用ET-GFP 49002滤光片组（Chroma）对带有GFP标签的蛋白质进行成像，并使用ET-mCherry 49008滤光片组（Chroma）对MAP7D3的X-若丹明标记的微管蛋白和mCherry标记的MTBD进行成像。为了同时对绿色和红色荧光成像，我们使用了Evolve512 EMCCD相机（光度学），ET-GFP / mCherry滤光片立方体（59022，Chroma）以及配备了双发射滤光片立方体的Optosplit III分束器（Cairn Research Ltd.）。 ET525 / 50m，ET630 / 75m和T585lprx（色度）。为了将体外样品保持在30°C，我们使用了台式培养箱（型号INUBG2E-ZILCS； Tokai Hit）。使用ImageJ处理图像。通过线性调整亮度和对比度来修改所有图像。使用ImageJ插件KymoResliceWide v.0.4生成了运动记录仪。ET-GFP / mCherry滤光片立方体（59022，Chroma）与Optosplit III分光镜（Cairn Research Ltd.）一起配备了双发射滤光片立方体，该滤光片立方体配置有ET525 / 50m，ET630 / 75m和T585lprx（色度）。为了将体外样品保持在30°C，我们使用了台式培养箱（型号INUBG2E-ZILCS； Tokai Hit）。使用ImageJ处理图像。通过线性调整亮度和对比度来修改所有图像。使用ImageJ插件KymoResliceWide v.0.4生成了运动记录仪。ET-GFP / mCherry滤光片立方体（59022，Chroma）与Optosplit III分光镜（Cairn Research Ltd.）一起配备了双发射滤光片立方体，该滤光片立方体配置有ET525 / 50m，ET630 / 75m和T585lprx（色度）。为了将体外样品保持在30°C，我们使用了台式培养箱（型号INUBG2E-ZILCS； Tokai Hit）。使用ImageJ处理图像。通过线性调整亮度和对比度来修改所有图像。使用ImageJ插件KymoResliceWide v.0.4生成了运动记录仪。通过线性调整亮度和对比度来修改所有图像。使用ImageJ插件KymoResliceWide v.0.4生成了运动记录仪。通过线性调整亮度和对比度来修改所有图像。使用ImageJ插件KymoResliceWide v.0.4生成了运动记录仪。https://github.com/ekatrukha/KymoResliceWide ; 复制副本存档在https://github.com/elifesciences-publications/KymoResliceWide）。
如上所述，在有或没有MAS纺丝的情况下，制备了紫杉醇稳定的MT。蛋白质样品在辉光放电的碳涂层铜网上用2％乙酸铀酰进行负染。图像在带有LaB6灯丝的Tecnai 20电子显微镜上记录，该图像使用BM Eagle 4 K CCD相机（ThermoFisher，埃因霍温，荷兰）在200 kV下操作。散焦约5μm时获得图像。在19,000× g的放大倍数 下，样本水平的有效像素尺寸为1.14 nm。
如上所述制备[ 13 C，15 N]标记的MT。CKK结构域的纯化和CKK-MT复合物的制备是根据参考文献中发表的方法进行的。15。首先通过带有POROS ™ MC柱的ÄKTA纯系统纯化CKK ，并用Ni 2+饱和。首先使用洗涤缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，pH 8、500 mM NaCl，1 mMβ-巯基乙醇和20 mM咪唑）平衡色谱柱。用相同的缓冲液洗脱蛋白质，但含有400 mM咪唑。随后，将蛋白质上样到SEC HiLoad Superdex 75 26/60色谱柱（GE Healthcare）上，该色谱柱用40 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）补充了150 mM NaCl和1 mM DTT平衡。然后将纯化的蛋白质浓缩并用于ssNMR样品制备。然后添加CKK N1492A至终浓度65.3μM（4：1 CKK /微管蛋白），并在37°C下与标记的MT孵育30分钟。沉淀以180,000× g离心 （Beckman TLA-55转子）在30°C下放置30分钟，并用BRB80洗涤，而不会干扰沉淀。然后将粒料转移并包装到1.3 mm转子中。
人的cDNA MAP7-MTBD（残基59-170），通过使用不依赖于连接的克隆克隆到用编码N-末端His标签的麦芽糖结合蛋白（MBP）凝血酶裂解位点的基因的载体pLICHIS 54 .Transformation是用大肠杆菌 Rosetta 2细胞完成，并在1 L未标记的M9培养基中生长。当OD 600用0.3 mM IPTG在20°C持续16 h达到0.6 时，进行蛋白质诱导。然后将培养物在4°C下用4000× g离心 20分钟以收获细胞。细胞沉淀用50 mM磷酸钠缓冲液，pH 8、500 mM NaCl，1 mMβ-巯基乙醇和20 mM咪唑洗涤，并储存在-80°C下。
对于蛋白质纯化，通过在冰上超声处理来进行细胞裂解，并通过在4°C 下离心40,000× g 30分钟来收集细胞裂解液 。随后，将蛋白质通过ÄKTA纯系统进行纯化，该系统带有用Ni 2+饱和的POROS ™ MC色谱柱。首先用与上述相同的缓冲液平衡色谱柱。然后将细胞裂解物上样到柱子上，并用20倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子。用补充了蛋白酶抑制剂的50 mM磷酸钠缓冲液，pH 8、150 mM NaCl，1 mMβ-巯基乙醇和400 mM咪唑洗脱蛋白质。浓缩蛋白质，然后用pH 6.5的40 mM磷酸钠缓冲液稀释，使咪唑的终浓度为20–30 mM。随后，用Hitrap HP SP色谱柱（GE Healthcare Life Sciences）进行阳离子交换纯化。首先用缓冲液A（40 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5）平衡色谱柱。然后将样品加载到色谱柱上，并用缓冲液A洗涤5个色谱柱体积。通过将缓冲液A和缓冲液B（40 mM磷酸钠缓冲液，1 M NaCl，pH 6.5）合并使用梯度洗脱来洗脱蛋白质。然后将蛋白质浓缩并储存在4°C。最后，使用凝血酶裂解MBP融合蛋白，然后补充蛋白酶抑制剂。
将10 mg / ml猪脑微管蛋白在BRB80缓冲液（80 mM K-PIPES，pH 6.8，1 mM EGTA，1 mM MgCl 2）中稀释至2 mg / ml。加入1 mM GTP后，将样品在冰上孵育5分钟。MT聚合在30℃下进行20分钟。随后，添加20μM紫杉醇并在30°C下孵育15分钟。通过与不同摩尔比的MAP7-MTBD：MTs混合，在MAP7-MTBD存在下进行MT沉淀法。作为对照治疗，单独应用紫杉醇稳定的MT或MAP7-MTBD。然后将所有样品以180,000× g离心 在30℃下30分钟，从上清液中取等分试样。除去上清液后，将沉淀重悬于SDS样品缓冲液中。加载上清液和沉淀级分的样品，并在考马斯染色的12.5％SDS凝胶上进行分析。
在制备用于ssNMR的样品之前，首先将纯化的未标记MBP-MAP7-MTBD与5 U凝血酶在4°C下孵育16小时，以裂解融合的MBP蛋白。然后将蛋白酶抑制剂添加到蛋白质中。为了制备MAP7-MTBD-MT复合物，制备了2 mg纯化的[ 13 C，15 N]标记的MT，并将其重悬于含有20μM紫杉醇的温BRB80缓冲液中。然后将MAP7-MTBD与MAP7-MTBD：MT的摩尔比为2：1，并在30℃下孵育30分钟。将沉淀物在180,000× g（Beckman TLA-55转子）上于30°C 离心 30分钟，并用含有20μM紫杉醇和蛋白酶抑制剂的温BRB80缓冲液洗涤，而不会干扰沉淀物。然后将粒料转移并包装到1.3 mm转子中。
[ 13 C，15 N]标记的MT（游离MT，结合CKK的MT和MAP7结合的MT）的NMR实验是在标准孔700 MHz，宽孔500 MHz（Bruker Biospin）上进行的。上的700 MHz SSNMR实验包括2D 13 C- 13 ÇRFDR 29，1 H- 13 C / 15 ÑHSQC和3D 15的N-编辑1 H- 1个 ħ自旋扩散实验35（设定温度270 K，MAS率44千赫） 。的SSNMR实验两个APO以及MAP结合的微管样品中的实际温度为293 K的13 C- 13在RFDR实验中，C混合为3 ms。在RFDR混合和13 C 检测期间，在1 H通道上采用120 kHz 的PISSARRO解耦55方案。质子自旋扩散时间为200 ms。在所有质子检测实验中，在1 H，13 C和15 N通道上以11 kHz应用了PISSARRO解耦方案。在500 MHz光谱仪上进行31 P NMR实验（设定温度290 K，MAS速率11 kHz）。CP MAS实验是在1 H通道95.4 kHz和31 P通道71.7 kHz上以100–50％的斜率记录的，CP接触时间为1.2 ms。螺旋解耦56的1个获取的H期间31 p在90千赫施加。使用pH 7的磷酸盐缓冲液从外部参照31 P的化学位移，并将信号设置为0 ppm。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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