摘要
营养物质仅被肠绒毛吸收。该器官的衰老会引起吸收不良和相关疾病，但其衰老机制仍不清楚。在这里，我们显示，衰老引起的肠绒毛结构和功能下降受营养物质和生长因子的传感器mTORC1调节，mTORC1在老年小鼠的肠干细胞和祖细胞中被高度激活。这些衰老表型在肠道干细胞特异性Tsc1中得以概括。淘汰赛小鼠。从机制上讲，mTORC1激活增加了MKK6的蛋白质合成，并增强了p38 MAPK-p53途径的激活，从而导致肠干细胞的数量和活性以及绒毛大小和密度降低。靶向p38 MAPK或p53可预防或挽救ISC和绒毛老化以及营养吸收不良。这些发现表明，mTORC1通过增加肠道干细胞中的显着应激反应途径来驱动衰老，并将p38 MAPK鉴定为mTORC1下游的抗衰老靶标。
由于人口老龄化，与衰老相关的疾病的发病率正在增加1。营养吸收不良在老年人中很常见，经常导致贫血和其他疾病2。营养物质被肠绒毛吸收，肠绒毛由一层肠上皮细胞（IECs）和固有层组成，吸收活性受绒毛3的大小和密度影响。上皮细胞层是由LGR5，每4-5天重新+以下一个对称分裂和中性换档模式肠干细胞（ISCS）4，5，6，产生瞬态扩增（TA）祖细胞，后来分化成吸收性或分泌性细胞7。隐窝和绒毛的密度由ISC裂变8控制。此外，Bmi1的+静态干细胞，TA细胞和祖细胞的分泌可以恢复到LGR5 +损伤后ISC的再生绒毛9，10，11，12，13。据报道，ISC的ISC和再生活动的数量在17-24个月大的小鼠下降14，15，然而，老化是否会影响绒毛的功能以及如何控制绒毛的老化仍知之甚少。
mTOR的，营养物和生长因子的传感器，是老化的中央调节器和用于寿命和长期保健扩展的目标16，17，18，19，20。mTOR的形成的mTORC1和mTORC2复合物，以及mTORC1的活化通过增加全球蛋白质的合成和其它合成代谢过程促进细胞增殖21，22，23，24，其被假定为引起不可逆的细胞衰老和/或氧化和proteostatic应力，因此老化25，26，27，28。然而，这种假设是不可逆的老化理论是一致的29，30。mTORC1信号已经示出稳态和再生期间需要为IEC增殖31，32，33，34，其中包括静态ISC的介导再生35，36。此外，几个研究已经表明，饮食限制促进LGR5 +经由mTORC1信号ISC膨胀，虽然相互矛盾的结果已关于由mTORC1的发挥的确切作用被报道14，37，38。尽管如此，mTORC1信号调节ISC和绒毛衰老的机制仍需进一步研究。
当前的遗传研究表明，mTORC1在IECs中，特别是在老年小鼠的ISC和TA细胞中被过度激活，通过放大MKK6-p38-p53应激反应途径来抑制ISC /祖细胞增殖，从而促进绒毛衰老，而MKK6蛋白的合成正在由mTORC1激活上调。通过靶向p38 MAPK或p53可以减缓或预防绒毛衰老。这些遗传结果建立了一个显着的应激反应途径，作为衰老控制中的mTORC1下游效应物，阐明了控制绒毛衰老的机制，并将p38 MAPK鉴定为mTORC1信号传导下游的抗衰老靶标。
为了了解营养吸收器官的衰老，我们从不同年龄的正常B6小鼠收集了小肠，将它们饲养和饲养在同一设施中。组织学分析显示，与2、3.5、8、12个月大的小鼠相比，16或17.5个月大的小鼠在空肠近端和远端的绒毛高度和数量显着降低（图。 图1A ;补充图 1A，b ）。与2-3个月大的小鼠相比，17.5个月大的小鼠的体重增加了12％。24个月大的小鼠也表现出绒毛结构恶化（补充图 1c））。这些结果表明，老年小鼠的吸收表面下降，这与Nalaparenddy等人的最新研究不同。报告老龄小鼠绒毛大小增加15。尽管这种差异的原因可能很复杂，但一种解释可能是，Nalaparenddy的研究使用了从不同供应商处购买的年轻和老年小鼠群15。我们发现16或17.5个月大的小鼠对不可代谢的L-葡萄糖，氨基酸和脂肪酸的养分吸收活性降低（图 1b；补充图 1d）。
a – d十七和半个月大的小鼠表现出绒毛和隐窝结构恶化（右图：定量数据）（a），养分吸收活性降低（b），对IR引起的隐窝数量减少的敏感性增加和与年轻小鼠相比，在IR（c）后第2天增殖细胞，并且在第6天（d）再生受到损害（绒毛和隐窝的高度和数量减少），通过1.5个月的RAP治疗（3 mg / kg体重）从16个月大开始。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。e十七岁和半个月大的小鼠显示其高度，隐窝的数量和增殖的TA细胞的数量有所减少（基于（a）），这些小鼠已被RAP拯救。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。f代表性图像（空肠近中线部分）显示，隐窝细胞中mTORC1的激活随年龄增加而增加。G蛋白质印迹结果显示，与3.5个月大的小鼠相比，在17.5个月大的小鼠的隐窝样本中mTORC1的激活增加。分离的隐窝直接裂解并用于WB分析。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 3只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。h从17.5个月大的小鼠中分离出的Lgr5 + ISC比3.5个月大的小鼠中显示出mTORC1激活，这被RAP治疗抑制。通过FACS分选从Lgr5-GFP-CreERT小鼠的小肠中分离Lgr5 + ISC，并对p-S6染色。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 6只小鼠。** P <0.01（使用学生t检验确定）。
老年小鼠还显示出对电离辐射（IR）的敏感性增加，表现为隐窝和增殖细胞数量的减少更大，而IR后第二天的小鼠凋亡细胞的增加则更大（图 1c；补充图 2a）。 。这与隐窝样本中PCNA和细胞周期蛋白E的减少以及p53的增加有关（补充图 2b）。IR后第3天获得了类似的结果（补充图 2c）。老年小鼠中损伤的增加可能是IR后第6天观察到的绒毛再生受损的原因，表现为绒毛和隐窝的高度和数量减少（图 1d；补充图 2d）。）。总的来说，这些发现表明衰老与绒毛结构和功能的恶化，对压力的敏感性增加以及再生受损有关。
老年小鼠还显示出隐窝的高度和数量减少，隐窝是控制绒毛大小和密度的隐匿性腺体（ISC /祖细胞）。我们观察到Ki67 +祖细胞的数量减少（图 1a，e；补充图 1a），但在将绒毛大小标准化后，凋亡或衰老细胞的数量或绒毛细胞的分化没有明显变化（补充图 2e–g）。尽管老龄小鼠的绒毛和隐窝数量减少了，但隐窝与绒毛的比例没有改变（补充图 2h）），提示与衰老有关的绒毛高度和密度下降可能分别是由增殖的TA细胞和隐窝数量减少引起的。Yilmaz的小组还报告说，衰老引起ISC的数量和再生能力下降，但杯状杯或肠细胞分化没有缺陷14。总之，我们和其他人的研究表明，绒毛与衰老相关的绒毛大小和密度下降可能是由在ISC的缺陷和TA祖细胞引起的14，15。
mTOR的激活是在衰老过程中有牵连34，39。免疫染色显示，p-4E-BP1和p-S6是mTORC1激活的指标，随着年龄的增长而增加，尤其是在隐窝细胞中（图 1f）。Western印迹分析证实了老年小鼠隐窝样品中mTORC1激活的增加（图 1g）。由于ISC的数量太少，无法进行Western印迹分析，因此我们对3.5和17.5个月大的Lgr5-GFP-CreERT小鼠的Lgr5 + ISC 进行了分类，并对它们进行了p-S6免疫染色。我们发现，实际上有更多的ISC在老年小鼠中表现出mTORC1激活（图 1h）。）。这些因素，在老年的IEC和ISC的原因mTORC1的过度活跃可能包括全身及利基线索，并需要进一步调查39，40。
有趣的是，用雷帕霉素（RAP），mTORC1抑制剂21治疗16个月大的小鼠1.5个月抑制了mTORC1活性（补充图 2i），并部分挽救了衰老样表型，包括绒毛高度，密度和养分降低。吸收活性，在第2天对IR的敏感性增加，并在IR后第6天损害了绒毛的再生（图 1a-d；补充图 2a-d）。先前已报道了在正常小鼠中的急性RAP抑制绒毛再生31，33，36。在这里，我们在药物治疗完成后3天进行了上述实验，以避免RAP可能产生的急性影响。此外，RAP主要在IR后第2天或第3天挽救了IR诱导的细胞增殖减少和凋亡增加（图 1c；补充图 2a–c），这可能有助于绒毛再生。此外，RAP可以部分挽救老年小鼠的隐窝高度和数量以及增殖的TA细胞数量的减少（图 1a，e）。这些结果表明增强的mTORC1激活有助于绒毛自然衰老。
为了测试mTORC1激活是否引起绒毛衰老，我们使用Villin-Cre小鼠切除了编码mTOR抑制剂的疾病基因Tsc1。韦林在所有小肠IEC（包括ISC）中表达，但在结肠隐窝中不表达41。Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠在整个绒毛中均表现出增强的mTOR活化（补充图 3a）。我们发现2个月或3个月大的Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠显示隐窝的数量和大小增加，但绒毛大小却无明显增加（补充图 3b）。这些小鼠的营养吸收率没有改变（补充图 3c）），表明IEC本身中的mTORC1激活本身在正常绒毛存在下不会影响营养吸收。令人惊讶的是，4-6个月大的突变小鼠显示出与年龄匹配的野生型小鼠相似的绒毛/隐窝（补充图 3b）。
从7个月大开始，突变小鼠表现出与衰老相关的变化，包括绒毛高度和密度，养分吸收活性和绒毛再生降低（补充图 3b-d）。Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠再生能力受损可能是由IR诱导后第2天IR诱导的细胞死亡和绒毛损伤增加所致（补充图 3d）。总体而言，这些结果表明IEC中的Tsc1缺失会引起绒毛过早老化。
上述研究表明，在绒毛自然或过早衰老模型中观察到的养分吸收缺陷与绒毛大小和密度的降低有关，而IEC中的mTORC1激活本身并不影响年轻时的养分吸收活动（补充图 3c）。由于绒毛大小和密度是通过ISC和祖细胞控制，我们烧蚀TSC1使用ISC的LGR5-CreERT小鼠4。据报道，Lgr5-CreERT仅在他莫昔芬（TAM）给药后标记ISC的一部分，并产生嵌合标记模式4。我们的血统追踪研究表明，每天向1个月大的Lgr5-CreERT; tdTomato施用三剂TAM小鼠在2个月大时标记了65％的隐窝（补充图 4a）。几乎所有绒毛中的大多数细胞都被番茄标记，这可能是因为每个绒毛都包含至少六个隐窝7。
我们发现，在1个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中，TAM诱导的Tsc1消融导致到2个月大时几乎所有绒毛的大多数细胞中mTORC1激活增加（图 2a；补充图 4b）。这些小鼠显示出隐窝的大小和数量增加，但绒毛大小却无明显增加（图 2b）。这些突变小鼠的营养吸收活性未改变（图 2c）。），证实IEC中的mTORC1激活本身并不影响其营养吸收活性。但是，7个月或更大的小鼠体重和早衰表型有轻微但微不足道的降低，包括绒毛高度和密度（空肠和远端空肠）和营养吸收活性的变化（图 2b，c；补充图）。 。 5A）。
a Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中有条件消融Tsc1和RAP治疗的示意图（b – e）。b H / E和Ki67染色显示Lgr5 + ISC 中Tsc1的消融导致2个月大时的隐窝过度生长和8个月大时的绒毛结构恶化（空肠近端中线部分），这可以通过以下方法部分挽救说唱 右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 8只小鼠。** P <0.01（使用学生t检验确定）。c八个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠对L-葡萄糖（mmol / l），氨基酸（ng / ml）和脂肪酸的营养吸收活性降低，这些活性通过RAP处理得以部分挽救。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。d，e八个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠在IR（d）后第2天显示对IR诱导的隐窝和增殖细胞数量减少的敏感性增加，并且再生受损（高度降低和IR后第6天的绒毛和隐窝数量（e），部分通过RAP治疗得以挽救。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。
突变小鼠在IR后第2天也显示出比IR更高的对IR的敏感性，其表现为隐窝和增殖细胞数量的减少更多，凋亡细胞的增加也更大（图 2d；补充图5b）。 隐窝样本中PCNA和细胞周期蛋白E降低，p53升高（补充图 5c）。IR后第3天获得了类似的结果（补充图 5d）。这可能导致IR后第6天的绒毛再生受损（图 2e）。虽然mTOR信号所需的绒毛再生31，33，36，我们发现mTOR过度激活使细胞对IR诱导的损伤敏感，这可能会延迟再生过程。请注意，在8个月大的Lgr5-CreERT中，大多数隐窝和几乎所有绒毛均显示出mTORC1激活增加；Tsc1 f / f小鼠比2个月大的Lgr5-CreERT小鼠更大。Tsc1 f / f小鼠（补充图 4b）。
Lgr5-CreERT的绒毛早衰表型；从6.5个月大开始，通过1.5个月的RAP治疗可以部分挽救Tsc1 f / f小鼠（图 2a–e）。这包括在IR后第2或3天挽救IR诱导的细胞增殖减少和细胞凋亡增加（图 2d；补充图 5d）。RAP还可以抑制2个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中mTORC1驱动的隐窝过度生长（补充图 5e），这表明绒毛的生长和衰老至少部分是由mTORC1活化升高引起的。另外，Tsc1缺失导致在2个月大时结肠隐窝过度生长的表型，然后在7个月大时隐窝萎缩，通过RAP得以挽救（补充图 5b）。这些结果揭示了mTORC1激活对小肠和结肠中Lgr5 + ISC的双相影响。
我们的发现（i）mTORC1在衰老小鼠的ISC和祖细胞中被大大激活；（ii）即使在具有正常绒毛大小和密度的年轻Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠和Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的IEC中激活了mTORC1，营养吸收仍是正常的；（iii）与衰老相关的养分吸收下降总是与绒毛大小和密度的下降有关，而绒毛大小和密度的下降受Lgr5 + ISC的控制，这表明活化的mTORC1主要通过ISC促进绒毛衰老。
既绒毛蛋白-酶Cre; TSC1 F / F小鼠和LGR5-CreERT; TSC1 F / F。小鼠显示增加在2-3个月的年龄隐窝的尺寸示出了在7-8个月的年龄绒毛过早老化前（图 2b中；补充图 3b）。2-3月龄的绒毛过度生长是否可能导致绒毛过早老化？我们对6.5个月大的老鼠施用RAP可以挽救绒毛衰老表型的观察结果表明，绒毛早衰并不是2到3个月大时mTORC1驱动的隐窝过度生长的必然结果（图 2b-e）; 如果mTORC1驱动的衰老是由不可逆的ISC / TA细胞复制性衰老和/或凋亡引起的，则这种挽救可能不会发生。为了验证，我们在6.5个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中诱导了Tsc1消融。这些小鼠在8个月大时表现出衰老样表型，包括绒毛高度和密度以及养分吸收活性的变化（补充图 6a–c）。但是，TAM给药未能在7.5个月大时引起隐窝过度生长（补充图 6d）。总体而言，这些结果表明，mTORC1驱动的绒毛过早老化可能不依赖于mTORC1驱动的绒毛过度生长。
是什么原因导致8个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠的绒毛高度和密度下降？我们发现绒毛高度的降低伴随着IEC数量和Ki67 +祖细胞数量的减少（图 2b， 3a，b）。另一方面，IEC细胞凋亡，衰老或分化没有明显改变（补充图 5f–h）。另外，绒毛数目的减少伴随着隐窝数目的减少（图 2b）。由于绒毛与隐窝的比率没有改变（图 3c），我们得出的结论是绒毛密度降低是由隐窝数量减少引起的。总的来说，这些结果表明Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠在7-8个月大时绒毛大小和密度的下降是由隐窝缺陷和TA细胞增殖引起的。
a，b八个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f小鼠显示IECs（a）和增殖性TA细胞（b）数量减少（基于图 2b）。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 4只小鼠。** P <0.01（使用学生t检验确定）。c八个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f小鼠的绒毛与隐窝比率无变化。Ñ = 4 d示出了代表性图像TSC1 / - -隐窝（分离自绒毛蛋白-酶Cre; TSC1 F / F小鼠，因为LGR5-GFP-CreERT可以标记隐窝〜65％）在minigut类器官的大小和隐窝的数目显示的增加，而类器官的连续传代显示，TSC1 -缺乏的类器官很快失去了繁殖能力。右图：数据量化（平均值±SEM）。 每组N＝ 3只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。e八个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f小鼠显示ISC和增殖ISC数量减少。对肠切片进行PCNA免疫染色，并对PCNA和GFP阳性的细胞计数，并标准化为Lgr5 + ISC 的总数。底部：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 5只小鼠。** P <0.01（使用学生t检验确定）。f在自然年龄为17.5个月大的小鼠中，ISC和增殖ISC的数量减少了。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 3只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。
然后，我们使用离体类器官培养来验证这些发现。我们从两个月大的正常人或Villin-Cre中分离出隐窝；Tsc1 f / f小鼠，并进行离体迷你肠类器官培养。缺乏Tsc1的隐窝在类器官培养物中显示出增加的生长。然而，它们失去了在第3代繁殖的能力（图 3d），证实了mTORC1信号在隐窝生长和衰老中的两相作用。
Tsc1消融诱导的绒毛早衰也与ISC的缺陷有关。在8个月大时，包含Lgr5表达ISC的隐窝数量和每个隐窝的Lgr5 + ISC数量减少，而在2个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中观察到相反的结果（图。 3E）。此外，在8个月大的Lgr5-CreERT； Tsc1 f / f小鼠中，增殖的Lgr5 + ISC 的数目也减少了（图 3e）。同样，在自然衰老的小鼠中，Lgr5 + ISC和增殖的Lgr5 + ISC的数量减少了（图 3f）。总的来说，这些结果表明，Tsc1缺乏引起的绒毛过早衰老和自然衰老可能都是由ISC / TA细胞数量减少引起的。
为了了解mTORC1驱动的绒毛过早衰老和ISC / TA细胞增殖减少的分子基础，我们使用了抗体阵列（204种抗体）来比较参与细胞增殖的蛋白质的表达和激活。为此，我们比较了Villin-Cre; Tsc1 f / f和对照小鼠的速冻肠样本，以最大程度地减少隐窝分离过程对蛋白质磷酸化的可能影响。我们发现Tsc1缺乏症改变了包括p38 MAPK，MEK1和p53在内的几种信号分子的表达和激活（补充表 1）。我们选择p38 MAPK进行进一步研究，因为它们是与衰老有关的应激反应激酶42。Western印迹分析显示，在Tsc1 -/-绒毛样品和Tsc1 -/-类器官样品中，MKK6蛋白和p38 MAPK激活水平增加（图 4a，b）。从机理上讲，Tsc1缺乏并没有显着影响隐窝样品中Mkk6的mRNA水平（图 4c）。取而代之的是，在Tsc1 -/-初级成肠细胞中，放射性标记的蛋氨酸掺入MKK6的过程增加了，这被RAP处理抑制了（图 4d）。在Tsc1 -/- MEF 中还观察到MKK6蛋白和p38 MAPK激活的增加（补充图。 7a–c）。我们发现用siRNA瞬时敲低MKK6导致p38 MAPK激活减少（补充图 7d），表明升高的MKK6负责Tsc1缺陷细胞中增强的p38 MAPK激活。已显示mTORC1可以增加具有5'末端寡嘧啶（TOP）或TOP样基序的转录本的蛋白质合成[ 43]。小鼠Mkk6转录本在5'非翻译区中包含多个TOP或TOP样片段（补充图 7e）。这些结果表明，mTORC1激活可促进MKK6的蛋白质合成，从而增强p38 MAPK激活。
a，b蛋白质印迹结果表明，Villin-Cre绒毛样品中MKK6的水平和p38 MAPK的激活均增加；与对照组相比，Tsc1 f / f小鼠（a）和缺乏Tsc1的类器官（b）。右图：定量数据（平均值±SEM）。Ñ = 4只小鼠为一和3 b。** P <0.01（使用学生t检验确定）。c Tsc1缺乏并没有显着影响Mkk6的mRNA水平在隐窝样本中。从隐窝样本中分离出总RNA，将其转化为cDNA，然后用于定量PCR分析。 每组N＝ 4只小鼠。d Tsc1缺乏症导致放射性标记的甲硫氨酸掺入MKK6的增加，而RAP抑制了这种作用。用35 S Met和Cys对原代肠母细胞培养物进行脉冲标记1 h。收集细胞，将MKK6免疫沉淀并分馏到SDS-PAGE凝胶上，干燥。信号是用PhosphorImager检测到的。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 3只小鼠。* P <0.05（使用学生t检验确定）。ËWestern印迹分析显示，与两个月大的小鼠相比，来自八个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f小鼠的隐窝样本显示MKK6表达，p38 MAPK激活和mTORC1激活增加。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N = 3。* P <0.05（使用学生t检验确定）。
此外，通过Western印迹比较2月龄和8月龄Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠的隐窝样本，发现p38 MAPK激活在老小鼠中进一步增强，同时mTORC1激活增加。 4e）。免疫染色结果证实了老年小鼠隐窝中增强的p38激活（补充图 7f）。与2个月大的小鼠相比，在8个月大的小鼠的肠切片上也观察到mTORC1激活增加（图 1f；补充图 4b）。这些结果表明，在7-8个月大时，外在和/或内在变化可能与ISC和IEC中mTORC1和p38 MAPKs活化增强有关。
因为在大多数情况下，p38 MAPK途径在细胞增殖中均发挥了负作用42，所以增强的p38 MAPK激活可能是mTORC1驱动的ISC /祖细胞衰老的基础。为了测试这种可能性，我们在Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠中消融了编码p38α的Mapk14，以规避Tsc1和Mapk14嵌合消融的可能并发症。我们发现，两个月大的Villin-Cre; Mapk14 f / f小鼠（如Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠）显示出p38α表达降低，隐窝的数量和大小增加（补充图 8a，b）。 ，如先前报道的44。此外，Mapk14消融阻止了与衰老相关的组织学表型的发展，导致8个月大的Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的隐窝过度生长和融合（补充图 8b）。
我们还消除了Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠中的Mapk14（补充图 9a），发现仅删除一个Mapk14等位基因可阻止8个月大的绒毛早衰表型的发展，包括绒毛结构缺陷。 ，IR后第6天的养分吸收活性和绒毛再生（图 5a–c）。Mapk14单倍体功能不全还挽救了IR后第2天对IR的敏感性提高（补充图 9b-d），增殖的TA细胞，含Lgr5 + ISC的隐窝，每个隐窝的Lgr5 + ISC和增殖的Lgr5 +数量减少。ISC以及mTORC1驱动的结肠隐窝萎缩（图 5d；补充图 9e）。总体而言，这些遗传数据表明p38 MAPK介导mTORC1驱动的ISC和绒毛过早衰老。最近的一项研究报告说，线粒体产生的活性氧会激活p38 MAPKs，从而驱动类器官培养物中的隐窝形成45。总之，这些结果表明，p38 MAPK在ISC活动中起关键作用。
a – c Mapk14单倍体缺乏症在8个月大时挽救了绒毛结构的恶化（a），养分吸收活性降低（b）和再生受损（c）。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。d Mapk14单倍体缺乏症挽救了8个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f中ISC和增殖ISC数量的减少老鼠。对肠切片进行PCNA免疫染色，并对PCNA和GFP阳性的细胞计数，并标准化为Lgr5 + ISC 的数量。底部：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。
以上研究表明，p38 MAPK在mTORC1驱动的绒毛/ ISC早衰中起重要作用。为了测试p38 MAPK是否在绒毛自然衰老中起作用，我们比较了3.5和17.5个月大的正常小鼠的隐窝，发现老年小鼠MKK6表达和p38激活增加，这与mTORC1激活和增强有关。 RAP治疗抑制了它们的表达（图 6a）。然后，我们测试了p38 MAPK的小分子抑制剂是否可以减缓绒毛的自然衰老。向16个月大的正常小鼠施用SB203580 1.5个月可抑制p38 MAPK活化，其表现为p38 MAPK底物Creb磷酸化的降低（补充图 9f）），并减轻了绒毛的衰老表型，包括绒毛结构，养分吸收活性和受损的再生（图 6b-d），以及增殖的TA细胞数量减少（图 6b）。已显示p38 MAPK的抑制作用可减缓骨骼肌的衰老46。此外，我们发现源自17.5个月大小鼠的类器官在生长和隐窝形成方面存在缺陷，可通过向培养物中添加低剂量的SB203580或RAP来部分挽救（图 6e），这表明SB203580的作用和RAP直接在crypt单元上。此外，Lgr5-CreERT; Mapk14 + / f小鼠（在2个月龄时注射TAM）在16个月龄时显示适度的绒毛/隐窝过度生长，但未表现出衰老样表型（图 6f）。这些结果表明升高的p38信号传导抑制TA细胞增殖并促进绒毛自然衰老。
一个 Western印迹结果表明，17.5个月大的小鼠隐窝样品显示的升高MKK6表达，增加的p38蛋白激酶的活化，和增加的p53和p16蛋白的水平，这是由RAP治疗压抑1.5个月开始在16个月的年龄。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 3只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。b – d对p38 MAPK的抑制在很大程度上挽救了绒毛和隐窝结构的恶化（b），养分吸收活性降低（c）和再生受损（d）在17.5个月大的正常小鼠中。用SB203580治疗小鼠1.5个月。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生t检验确定）。e代表性图像显示SB203580（2μM）或RAP（0.5μM）部分挽救了从17.5个月大的小鼠分离出的小肠类器官的生长和隐窝形成缺陷。在类器官培养的第1天将抑制剂加入培养物中。底部：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 3只小鼠。** P <0.01（使用学生t检验确定）。f Lgr5-CreERT; Mapk14f / +小鼠（在2个月大时注射TAM）在16个月大时未显示出类似衰老的绒毛结构缺陷。将肠切片并用H / E或Ki67抗体染色。右图：定量数据（平均值±SEM）。 每组 N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.01（使用学生 t检验确定）。
mTORC1-MKK6下游的p38 MAPK激活如何诱导绒毛衰老？越来越多的证据表明，p38蛋白调控对经由p53和p16蛋白，和其它分子老化47，48，49。我们的抗体阵列和Western印迹结果表明，自然老化的隐窝样本或Tsc1缺陷的过早老化的隐窝样本显示p53和p16的水平升高，这通过RAP处理小鼠得到抑制（补充图 10a，补充表 1）。此外，Mapk14缺乏或抑制可抑制隐窝样品中衰老或mTORC1激活诱导的p53和p16水平的增加（补充图 10b，c）。这些结果表明，mTORC1激活以p38 MAPK依赖性方式诱导p53和p16表达。
然后，我们测试了p53和p16是否有助于mTORC1驱动的绒毛老化。尽管Trp53 -/-小鼠在5-6个月大时开始出现肿瘤，但许多小鼠存活了7-8个月，没有明显的肿瘤发生。虽然2或8个月大的Trp53 -/-小鼠表现出正常的绒毛结构，但Trp53缺乏促进了Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的隐窝生长，并在很大程度上阻止了绒毛过早衰老表型的发展，包括绒毛结构的减少，营养吸收活动，对IR的敏感性增加以及7个月大时绒毛的再生减少（图 7a–c；补充图 10d）。我们还反复使用这些实验LGR5-CreERT; TSC1 F / F ; Trp53的- / -小鼠中，发现Trp53的不足救出在增殖TA细胞和LGR5的数目的减小+含ISC-隐窝，LGR5 +每个隐窝ISC的，和Lgr5 + ISCs也增殖（图 7d）。这些结果表明p53在Tsc1缺失驱动的绒毛老化中起重要作用。
a – c删除Trp53可以挽救8个月大的Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的绒毛和隐窝结构恶化（a），营养吸收活性降低（b）和再生受损（c）。数据表示为平均值±SEM。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.0（使用学生t检验确定）。d Trp53切除挽救了8个月大的Lgr5-GFP-CreERT; Tsc1 f / f中ISC和增殖ISC数量的减少 老鼠。对肠切片进行PCNA免疫染色，对PCNA和GFP阳性的细胞进行计数，并标准化为Lgr5 + ISC 的总数。底部：定量数据（平均值±SEM）。 每组N＝ 5只小鼠。* P <0.05，** P <0.0（使用学生t检验确定）。e通过mTORC1控制肠道干细胞和祖细胞老化的模型。
P16（由编码CDKN2A）起着在若干组织的老化重要作用48，50。但是，2个月或8个月大的Cdkn2a -/-小鼠表现出正常的绒毛组织学，而Cdkn2a消融未能影响2个月大的Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的绒毛生长。Cdkn2a缺乏对8个月大的Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠的衰老相关组织学影响微不足道（补充图 10e）。这些结果表明，在mTORC1驱动的绒毛老化中，p16的作用比p53小。
与衰老相关的营养吸收不良是一种常见疾病，但其潜在病因仍然难以捉摸。这项研究表明，衰老与绒毛高度和密度以及养分吸收活性的降低以及对IR的敏感性增加有关，这可能是绒毛再生受损的原因。这些与衰老相关的表型在7–8个月大的Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠和Villin-Cre; Tsc1 f / f小鼠中得以概括。与衰老相关的绒毛结构恶化伴随着隐窝数量和高度的减少以及ISC数量和增殖的减少。这些发现以及我们对Tsc1的观察IEC中的消融和mTORC1激活不会影响2-3个月大小鼠的绒毛细胞分化或营养吸收活性，这表明与衰老相关的吸收不良主要归因于肠道干细胞的精疲力竭和其活性降低，从而导致肠道干细胞减少绒毛的大小和密度。
虽然衰老可能是由复杂的机制引起的，但我们提供了遗传证据，表明绒毛和ISC衰老可能涉及mTORC1信号传导。mTORC1在老小鼠的ISC和TA细胞中被强烈激活，仅用RAP抑制mTORC1 1.5个月就部分恢复了老小鼠肠绒毛的结构和功能。而且，Lgr5 + ISC中的Tsc1消融导致无Paneth结肠的绒毛早衰表型和隐窝萎缩，通过RAP治疗得以挽救。这些数据表明，mTORC1是肠道干细胞和绒毛衰老的重要调节剂。我们的结论与最近的一项研究一致，该研究表明饮食限制可以通过抑制mTORC1信号传导来帮助扩展ISCs 37。，但与另一项研究表明RAP 38抑制饮食限制诱导的ISC扩展不一致。是什么导致老化的IEC和ISC中mTORC1激活增强？这可能是在全身因素与年龄相关的变化可能参与，目前已被积极探索40，51，52。这些因素可能包括养分，代谢产物和生长因子14，45，和需要进一步调查。
我们的研究还表明，mTORC1激活可促进年轻小鼠中的ISC / TA细胞增殖。虽然一般认为mTORC1驱动的细胞过度增殖和合成代谢会导致衰老53，但我们的研究表明，根据以下观察结果，在快速周转的肠绒毛中，mTORC1激活诱导的衰老不一定需要mTORC1诱导的早期过度生长。 （i）在6.5个月大时切除Lgr5 + ISC中的Tsc1可以避免绒毛过度生长阶段，该阶段在2-3个月大时发生，但仍会引起绒毛过早老化；（ii）通过向老年小鼠施用p38或mTORC1抑制剂可以部分挽救Tsc1缺陷型小鼠的绒毛衰老。和（iii）Mapk14消融可增加隐窝细胞增殖，但可挽救绒毛过早老化。这些结果表明，Tsc1缺失驱动的ISC耗尽和绒毛衰老不是直接由mTORC1驱动的细胞过度增殖引起的。
相反，我们显示mTORC1信号通过增加细胞应激反应途径促进绒毛衰老。mTORC1激活增加MKK6表达，增强p38 MAPK激活并增强p53表达，导致ISC衰竭，绒毛大小和密度降低（图 7f）。此外，mTORC1激活还以p38 MAPK-p53依赖的方式增加了细胞对IR的敏感性并损害了绒毛的再生，这与基于细胞的研究一致，后者显示mTORC1激活的细胞对压力更敏感47。mTOR-MKK6-p38 MAPKs-p53途径的天然功能可能是平衡mTORC1诱导的过度生长并保护细胞免受失控的增殖和致癌性转化，这与衰老是一种抗增生机制的概念是一致的42。
这项研究将p38 MAPK置于mTORC1信号下游，以控制ISC /绒毛的衰老。p38 MAPK与骨骼肌和其他组织的衰老有关42。我们表明，p38 MAPK抑制剂可以有效改善自然老化的绒毛的结构和功能，而Mapk14消融可以防止ISC和绒毛老化。这些结果证明p38 MAPK是抗衰老的靶标。由于p38 MAPKs可以被多种压力和细胞因子激活，因此p38 MAPK可以作为结合环境线索以影响衰老过程的纽带。这些侮辱可能包括mTOR激活引起的氧化应激和ER /蛋白静态应激，这可能导致p38 MAPK进一步激活（图 7f）。我们的发现支持一种模型，其中mTORC1信号传导与p38 MAPK激活应激协同调节组织干细胞的衰老（图 7f）。
越来越多的证据表明，mTOR是衰老的主要调节因子，可能介导RAP和饮食限制引起的寿命和健康期延长。虽然通常认为mTORC1驱动的细胞增殖以及引起的氧化和蛋白水解应激是细胞和组织衰老的基础，但这项研究提供了遗传证据，表明mTORC1可以通过显着的应激反应途径调节组织干/祖细胞衰老和组织衰老。这些发现揭示了mTORC1信号调节衰老的机制，该工作模型可以解释衰老的可逆性。
Tsc1 f / f，Villin-Cre和Trp53 -/-小鼠系购自The Jackson Laboratories。在LGR5-CreERT小鼠在汉斯·克利夫尔斯实验室被生成。Mapk14 f / f是在王宜斌的实验室中生成的。Cdkn2a -/-老鼠是在罗恩·德皮尼奥的实验室中产生的。将这些小鼠维持在上海交通大学的SPF小鼠设施中。大多数小鼠最初是在129 / B6背景中，然后再回到B6中四次。他们可以在该设施中居住30个月。根据《国家研究委员会实验动物的护理和使用指南》中的建议进行动物实验，并遵守有关动物测试和研究的道德规范，并经上海交通大学动物保护与使用委员会批准的方案通大学。
将他莫昔芬（Sigma）溶解在玉米油中，并连续3天每天给小鼠注射每剂10 mg，以激活CreERT。为了抑制mTORC1，在研究中指示的时间内每天向小鼠注射RAP（3 mg / kg，Selleck，s1039）。为了抑制p38 MAPKs，在研究中指示的时间内每天向小鼠注射SB203580（5 mg / kg，Selleck，S1076）。对于长期RAP或SB203580给药，我们在完成药物治疗后至少等待3天，然后再进行实验以避免药物的急性作用。对于电离辐射，将小鼠暴露于5 Gy剂量的γ辐射，并在IR后2、3或6天杀死小鼠。
将小鼠禁食16小时的营养测定前54，55，56。为了进行葡萄糖吸收测试，将小鼠的PBS中的L-葡萄糖溶液（2 mg / g，体重）管住，在0、7、15、30、60、90和120分钟时从尾静脉收集血样测定血糖水平，以60分钟时的值作为葡萄糖吸收活性的指标。为了进行氨基酸吸收测试，给小鼠喂食氨基酸混合物（2 mg / g，体重），在不同时间点从尾静脉收集血液样品，并通过HPLC测定血液氨基酸水平。峰值（1小时）用于表示氨基酸吸收活性。为了进行脂肪酸吸收测试，将500/510 C1，B12脂肪酸（2μg/ g体重，Molecular Probes＃D3823）或橄榄油（10μl/ g体重）喂食小鼠。2小时后，切除小肠并在OCT中冷冻。切成10μm的切片，用带DAPI的ProLong®Diamond Antifade Mountant固定，并在荧光显微镜下检查。在营养吸收研究中，雄性和雌性小鼠之间没有观察到显着差异。
杀死后立即收获小肠并用PBS洗涤。将组织（空肠近端和远端空肠以及近端结肠）固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，在4-μm处纵向切片，中线切片用苏木精和曙红（H / E），ALP或阿尔辛蓝染色。为了进行免疫染色，通过将切片在pH 6的柠檬酸盐缓冲液中煮沸10分钟，然后在室温下冷却60分钟来进行抗原修复。为了消除内源性过氧化物酶，在含3％H 2 O 2的甲醇中处理组织30分钟 将组织用0.1％Triton X-100渗透30分钟。将切片在10％山羊血清中封闭30分钟，然后将一抗在4°C孵育过夜，然后将二抗在37°C孵育60分钟。针对Ki67（ab15580，1：100）和溶菌酶（ab108508，1：100）的抗体购自Abcam。购自Cell的针对GFP（2956，1：200），p-S6（2211，1：100），p-p38（9211，1：100）和p-Erk1 / 2（9106，1：200）的抗体信令技术。针对PCNA（sc-56，1：100）的抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
为了比较参与细胞增殖的蛋白质的激活和表达，我们选择使用野生型和Villin-Cre的速冻小肠样本；Tsc1 f / f小鼠由于在37°C下通过酶消化分离隐窝而产生不一致的结果。H-Wayen Biotechnologies用phospho-Exploerer（PEX100）分析了样品。
为了分离隐窝，立即去除小肠，主要是空肠和回肠，然后用冰冷的PBS冲洗大便。切开组织并纵向打开，切成1厘米的小块，将其置于4°C的含2 mmol / L EDTA的PBS中30分钟，然后置于含54.9 mmol / L d-山梨糖醇和43.4 mmol / L的PBS中蔗糖。然后将碎片涡旋1-2分钟，用70μm无菌细胞滤网过滤，并在4°C下以150 g离心10分钟进行富集。将近500个隐窝悬浮在50μL生长因子还原的无酚基质胶（BD Biosciences）中。之后，将50μL的Matrigel /隐窝混合物液滴置于12孔板的中心孔中，聚合30分钟后，将650μl的minigut培养基覆盖。Minigut培养基（先进的DMEM / F12，辅以HEPES，1-谷氨酰胺，N2，（B27）和R-Spondin，Noggin和EGF加入培养物中。每2-3天更换一次培养基。对于GFP+ ISC分离，我们首先分离隐窝，然后在37°C下用0.25％胰蛋白酶消化5分钟，在150–200 g离心3分钟，然后在冰冷PBS中用0.1％BSA复溶。我们通过FACS分选纯化了GFP +细胞并收集。这些细胞在PBS中重稀释，涂在包被的玻片上，在4°C下干燥。然后将载玻片固定在4％PFA中，并在荧光显微镜下对GFP +细胞进行计数。
为了初步隔离IEC，将肠纵向打开，并在Ca 2+和Mg 2+中洗涤含2％葡萄糖，25 ng两性霉素B / ml，100 U青霉素/ ml和100 mg链霉素/ ml的不含Hanks的平衡盐溶液（HBSS），将其切成1毫米的片段，并温育10次于22°C在装有胶原酶XIa（Sigma），2％牛血清白蛋白和0.2 mg大豆胰蛋白酶抑制剂/ ml（Sigma）的HBSS上的振荡器平台上，于22°C放置1分钟。在含有Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco），10％山梨糖醇（Gibco），100 U青霉素/ ml的培养基中沉淀两次60秒后，通过收集上清液，将细胞和小片肠上皮与致密的肠段分离，100 mg链霉素/ ml和5％胎牛血清。将细胞以1200 g离心五次 在DMEM加2％山梨糖醇中放置3分钟。丢弃上清液，将细胞在10 cm平板中培养，该平板在无酚红DMEM（Sigma）中按每1 cm 2稀释40 ml Matrigel每cm 2的比例包被。
将原始IEC与不含蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM预孵育30分钟，然后用EasyTag™EXPRESS 35 S蛋白标记混合物（NEG772007MC）标记1 h。为了确定蛋白质的合成速率，用单个抗体对细胞提取物进行免疫沉淀。针对MKK6（9264，1：250）的抗体购自Cell Signaling Technology。针对Gapdh的抗体（sc32233，1：250）购自Santa Cruz Biotechnology。洗脱免疫沉淀物并进行SDS-PAGE，干燥凝胶，并用磷酸显像使之可视化。
对于Villin-Cre；Tsc1 f / f小鼠的绒毛组织从小肠上刮下。对于Lgr5-CreERT; Tsc1 f / f小鼠，隐窝被分离。在这些实验中，小鼠饥饿过夜，并在第二天早晨收获。将这些样品溶解在购自Thermo Scientific（78510）的T-PER™组织蛋白提取试剂中，该试剂含有1 mM PMSF和1μg/ ml抑肽酶，亮肽素和胃抑素。将细胞在TNEN缓冲液中裂解，该缓冲液含有1 mM PMSF和1μg/ ml抑肽酶，亮肽素和胃抑素。通过Bio-Rad测定法确定蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE解析并转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。抗MKK6（9264，1：1000），p-p38（9211，1：1000），p38（9212，1：1000），p-Erk1 / 2（9106，1：1000），Erk1 / 2（9102， 1：1000），细胞周期蛋白E（4129，1：1000），p53（2524，1：1000），p-S6（1211，1：1000），p-p70S6K（9234，1：1000），p-4E- BP1（2855，1：1000），4E-BP1（9644，1：1000），p-mTOR（5536，1：1000），和mTOR（2983，1：1000）购自Cell Signaling Technology。针对β-肌动蛋白（sc81178，1：1000），p16（sc1207，1：1000）和PCNA（sc-56，1：1000）的抗体购自Santa Cruz Biotechnology。使用FluoChem M系统（Protein Simple）提供的软件对蛋白质条带进行定量。未裁剪的蛋白质印迹图像可在补充图中找到。 11。
Silencer预先设计的靶向小鼠MKK6的siRNA购自Gene Pharma（74366、74367、74368），按照制造商的规程将其转染为Tsc1 + / +和Tsc1 -/- MEF。击倒效率通过蛋白质印迹法确定。
按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞，隐窝或绒毛组织中提取总RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）用0.5μg的总RNA合成互补DNA。用实时PCR进行靶mRNA的检测和定量，将其标准化为β-肌动蛋白的水平。使用Applied Biosystems 7500系统进行实时PCR。
在本研究中使用了以下引物：Mapk14正向引物：5'-GGCACCTGCCATCAGTAGTT-3'，反向引物：5'-CCAGGGCTTCCAGAAGACAG-3'；Mkk6正向引物：5'-GGCACCTGCCATCAGTAGTT-3'，反向引物：5'-CCAGGGCTTCCAGAAGACAG-3'。
两次盲法计数每个视图的绒毛数目（10×10放大倍数）。使用NIKON-TiuNIS-Elements显微镜从顶部到底部测量绒毛和隐窝的高度。每组至少有三只小鼠，结果代表每只小鼠平均五个切片。
如果使用重复数据，数据表示为具有平均值的标准误差的平均值（±SEM）或具有标准偏差的平均值（±SD）。图例中显示了样本数（n）。应用未配对的两尾学生t检验确定两组之间差异的显着性，P值<0.05被认为具有统计学意义。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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