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incRNA rp11-19E11是基底乳腺癌增殖和存活所必需的E2f1靶点

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发表时间:2020-01-08 19:34作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

incRNA rp11-19E11是基底乳腺癌增殖和存活所必需的E2f1靶点

摘要

长非编码RNA(IncRNAs)在乳腺癌的发生发展过程中起着重要的调控作用。incRNAs在乳腺癌亚型中有差异表达。基底样乳腺癌通常是低分化肿瘤,富含胚胎干细胞特征,缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER 2(三阴性乳腺癌)的表达,并显示增殖相关因子的激活。我们假设incRNAs是基底乳腺癌的关键调节因子。利用肿瘤基因组图谱,我们鉴定了与其他乳腺癌亚型相比,在基底肿瘤中过度表达的INcRNAs,并在至少10%的患者中表达。值得注意的是,我们发现了其表达与患者预后相关的incRNAs。然后,我们评估了一个子集的INcRNA候选在体外致癌过程中的作用。在此,我们报道了染色质相关的INcRNA RP11-19E11.1的鉴定和特征,它在40%的基础原发乳腺癌中被上调。基因集富集分析发现RP11-19E11.1表达水平与E2F致癌途径有关。我们发现,这种RNA是染色质相关的,是E2F1的靶点,它的表达是癌细胞增殖和存活所必需的。最后,我们利用INcRNA表达水平作为体外药物发现的工具,将蛋白激酶C(PKC)作为基底样乳腺癌的潜在治疗靶点。我们的发现表明,INcRNA过表达在临床上是相关的。了解解除管制的INcRNA在基底型乳腺癌中的表达可能会导致潜在的预后和治疗应用。

导言

乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤,也是美国癌症相关死亡的第二大原因。1雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)的表达及其扩增HER 2基因在预后和治疗干预方面定义了主要的乳腺癌亚型。基于互补DNA(CDNA)微阵列的基因表达谱将乳腺癌分为不同的亚型,具有不同的预后和治疗意义:腔A(LA)、B腔(LB)、基底样(BL)和HER 2(HER 2)。2,3PAM 50测定了50个基因的信使RNA(MRNA)表达水平,这些基因可以将乳腺癌分为相同的亚型。三阴性乳腺癌(TNBC)被定义为缺乏ER/PR/HER 2受体的表达,占乳腺癌的15%-20%,与乳腺癌亚型中尽管局部治疗和细胞毒性化疗而复发的可能性最高。4大多数TNBCs被归类为BL,反之亦然,两种分类之间的重叠程度约为80%。5TNBC的广泛异质性,包括肿瘤间和肿瘤内的异质性,造成了治疗成功的困难。事实上,在三重阴性乳腺癌中进行的基因表达谱显示出六种具有特定本体论的独立簇,包括两种BL(bl 1和bl 2)、免疫调节(IM)、间充质间充质干细胞样(Msl)和腔内雄激素受体(Lar)。6亚型。

随着高通量技术的发展和基因组测序技术的不断完善,我们了解到大多数基因组都是转录的(96%-98%),其中约2%的转录体编码蛋白质。7虽然这些非编码的转录本在历史上被认为是垃圾dna,但在过去的几十年里,非编码RNAs与各种正常的生物学过程和疾病状态有牵连。8,9此外,随着生物复杂性的增加,非编码基因的数量比蛋白质编码基因(PCG)增加得更快。10此外,在全基因组关联研究(GWAS)中发现的与疾病相关的基因变异的比例很高,这表明这些转录本在健康和疾病中具有生物学作用。11

长非编码RNA(IncRNAs)是一类长度为≥200个核苷酸的非编码RNA转录本。INcRNA的表达与多种生物学过程有关,从发育、细胞周期调控到细胞凋亡和癌变。8,9新兴的INcRNA功能机制多种多样,可作为染色质模拟复合物的向导、诱饵或支架,调节转录后mRNA的衰减,或充当miRNA的海绵和调节mRNA剪接等功能。12我们和其他人已经证明,在乳腺癌的印度RNA景观是亚型特异性的。利用非监督聚类分析,INcRNA表达可以与PCG表达相似地对乳腺癌进行分类。13,14此外,越来越多的证据表明,有几个incRNAs特别参与了乳腺癌的发生。13,15

在本研究中,我们试图确定临床相关的INcRNAs解除对基底样乳腺癌患者的特殊管制,然后在体外对这些候选基因的子集进行功能评估,并评估其作为预后指标的价值。我们鉴定并鉴定了染色质相关的INcRNA,RP11-19E11.1,它在40%的基底层乳腺癌中被上调。基因集富集分析(GSEA)在原发肿瘤和细胞系中揭示了RP11-19E11.1表达水平与E2F致癌通路的相关性。我们发现,该INcRNA与染色质相关,是E2F1的靶点,它的表达是癌细胞增殖所必需的。最后,我们将INcRNA表达水平作为体外药物发现的工具,并将PKC作为BL乳腺癌的潜在治疗靶点。

结果

BL乳腺癌中过度表达的临床相关INcRNAs的鉴定

为了识别在BL乳腺癌中起作用的INcRNAs,我们使用了来自1183名患者的RNA测序(RNA-seq)数据,这些数据可以在癌症基因组图谱(TCGA)数据库中找到。我们用PAM 50分子亚型注释对肿瘤进行分类,16获得由131 BL,64 HER 2,404 LA和170 LB亚型所代表的769名患者的最终队列(图)。1A)。为了进一步分析,我们排除了25个最初被归类为正常类(NL)亚型的肿瘤。我们和其他人以前已经证明,INcRNA的表达反映了乳腺癌的亚型特异性。13,14,17因此,对前500个在患者中表达的incRNAs的t-sne(t分布随机邻居嵌入)分析显示,这组患者的分子亚型聚类,类似于使用标记基因获得的聚类,即编码基因和非编码基因的混合(如图所示)。1B,补充图。1A)。通过差异表达基因分析(DEseq分析),我们发现在BL亚型中,与正常组织和其他亚型相比,过度表达的INcRNAs有一个子集(>1.5倍的变化)。为了丰富临床相关的INcRNAs,我们筛选出那些在不到10%的患者中表达的低基线RNA(<0.5)。为了研究其在体外的功能,我们分析了一组细胞系的RNA-seq数据,并筛选出至少在两个BL乳腺癌细胞系中表达的INcRNAs。为了进一步限制抑癌基因在BL乳腺癌中的高表达,我们选择了在BL乳腺癌中高表达和在其他亚型中表达最少的基因(FPKM(每百万个外显子模型的片段数)<1)(图1)。1C,d)。有趣的是,这份报告列出了九种候选基因,其表达情况足以通过t-SNE分析对BL亚型肿瘤进行聚类(补充图)。1B).

图1:利用tcga数据库中的患者数据鉴定基底样乳腺癌亚型的特异性incRNAs。
figure1

a用于识别INcRNA候选的管道流程图。bT-SNE图起源于500例患者中表达最强的INcRNA。c热图显示9种INcRNA候选基因在不同乳腺癌亚型中的表达。d热图显示九种候选细胞在一组按分子亚型分类的细胞系中的表达情况。e点图显示在乳腺癌亚型内的每个患者的表达水平,选择的INcRNA候选。平均±SD代表每种情况。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (ANOVA). NT normal tissue, BL basal-like, HER2 her2-enriched, LA luminal A, LB luminal B, NL normal-like.

BL乳腺癌中过度表达INcRNAs的体外验证及功能筛选

为了研究这些INcRNA在肿瘤生长或肿瘤进展中的潜在作用,我们采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术分析了它们在代表乳腺癌不同分子亚型的细胞系中的水平。我们选择那些在至少两个BL细胞株中通过qRT-PCR和过表达(OE)检测到的incRNAs来进行进一步的研究,与其他癌症和/或正常乳腺细胞株相比,至少有10倍于此。INcRNAs CTD-2015G9.2、RP11-19E11.1、AC 01917.1和RP3-522D1.1符合这些标准,由于它们在细胞系中的表达模式与病人观察到的一致,因此被选择用于进一步的功能研究(图6)。1E2A)。接下来我们研究了这些incRNAs的定位,因为这可以提供对其潜在功能的洞察。4种候选基因中有3种主要表现为细胞质定位(类似于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)),RP11-19E11.1表现出较强的核定位,与核非编码RNA(NcRNA)对照、Malat-1和7SK的水平相似。(无花果)2B)。利用TGCA中的患者生存数据,我们询问我们的候选人是否会表现为一个预后指标。我们将患者分为高表达组和低表达组,对每一组患者进行对数秩检验(补充图)。2)。较高水平的INcRNA AC 01917.1的患者有更好的生存状况(p值0.035),而RP11-19E11.1水平较高的患者生存效果较差(p价值0.041)。然后,我们询问这些incRNAs是否在癌细胞的生长和迁移中起了作用。为了评估这一点,我们设计了小干扰RNA(SiRNAs)对细胞质INcRNA和锁定核酸(LNA)GapmeRs(LNAs)来降低核INcRNA。最初,我们用两种过高表达INcRNA候选基因的细胞株来测定转录敲除后的细胞活力(见图)。2C,d)。值得注意的是,在所有缺失CTD-2015G9、RP11-19E11.1或RP3-522D1.1的细胞系中,存活率都降低了,但AC01917.1基因敲除后没有观察到任何影响。因此,我们测试了这种INcRNA在细胞迁移和/或侵袭中是否重要(图一)。2E)并发现两种不同细胞株AC 01917.2在Boyden室迁移试验中的迁移和侵袭受到抑制。

图2:INcRNA候选基因的体外验证和功能筛选。
figure2

a用qRT-PCR方法在一组细胞系中获得了4个候选细胞的RNA表达。以MCF 7细胞株为参照。b细胞核-细胞质分馏后用qRT-PCR方法检测INcRNA候选体的亚细胞定位。c在不同时间点对两种不同的细胞株进行抑制后(siRNA 20 nm或LNA 50 nm)的存活率(MTT)测定。d转染48和72h后,两个细胞系的INcRNA候选基因RNA水平下降。eINcRNA AC 01719.1基因敲除后MDA-MB-468细胞的迁移和侵袭。实验至少进行三次,一式三份。数据为平均值±扫描电镜。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (two-tailed unpaired t测试)。

因此,我们的研究表明,我们已经确定了一小群在患者和细胞系中都有BL亚型特异性表达的INcRNA候选基因。重要的是,我们在此基础上聚类BL肿瘤的能力表明,这些INcRNAs可能具有预后价值,并在肿瘤的发展和癌变中发挥潜在的作用。

BL特异性和染色质相关INcRNA RP11-19E11.1的遗传特性研究

在40%的BL患者中,细胞核INcRNA RP11-19E11.1高表达。我们发现,细胞活力在被击倒后会受到严重的损害,并且高水平的INcRNA患者的预后很差。因此,我们试图深入地描述它的潜在功能,并在我们剩余的研究中将重点放在这个INcRNA上。

RP11-19E11.1是一种基因内的INcRNA。这个INcRNA的注释识别了两个不同5‘和3’末端的转录体(图)。3A)。为了验证该INcRNA的真实5‘端和3’端,我们利用高表达INcRNA(HCC 2157)的细胞系的核分数进行了cDNA末端的5‘和3’快速扩增(RACE)。我们的结果表明,与以前的注释不同,变体1和2(V1和V2)具有相同的3‘端(图1)。3A)。此外,我们无法检测到带注释的V2的5‘端的任何转录本,而具有与V2相同内含子的两个不同的异构体共享V1的5’端(图1)。3A)。RACE克隆测序结果表明,所有变异体在V1注释的5‘端包含85个额外的核苷酸。

图3:INcRNA RP11-19E11.1转录特性。
figure3

a三种主要变体的5‘和3’种族结果的方案。b核质分馏和染色质沉淀后,用qRT-PCR方法检测V1和V2的亚细胞定位。数据以平均值±扫描电镜表示。cTCGA患者INcRNA RP11-19E11.1中1Mb相邻基因表达的热图研究。dRP11-19E11.1和EN1在一组细胞系中表达的热图。e点图显示每个细胞系RP11-19E11.1相邻基因的表达水平。每个基因的平均值为±SD。表达低于检测水平的基因值未显示。实验至少进行三次,一式三份。

接下来,我们将探讨这种INcRNA是否与染色质有关,因为许多核INcRNA在染色质重塑或转录调控等功能中发挥着作用。18,19我们的结果清楚地表明染色质的结合,类似于整齐-1或Xist,用作V1和V2的对照(见图)。3B)。核内干扰RNA可调控邻近基因的表达顺式。为了研究这一假设,我们绘制了一个热图,显示所有基因在incRNA周围的1 Mb窗口中的表达(图1)。3C)。引人注目的是,我们观察到RP11-19E11.1和EN1的表达之间存在着近乎完美的相关性,EN1是一种定位于13 kb以外的神经特异性转录因子,与基底样乳腺癌有关。20在多个细胞系中也观察到了这种相关性(见图)。三维空间)。然而,在INcRNA被击倒后,我们没有观察到包括EN1在内的邻近基因的表达有明显的变化(如图1所示)。3E)。此外,EN1的敲除并没有显著改变RP11-19E11.1的表达(补充图)。3A)。我们还注意到,这两种转录本的OE并不是由于染色体上这一区域的扩增(CBioPortal)所致。由于RP11-19E11.1和EN1的启动子在CpG岛上都富集,我们推测观察到的协同OE可能是由于这两种转录体启动子中DNA甲基化的解除所致。利用tcga甲基化数据,我们发现三重阴性患者在该区域甲基化CpG岛的百分比明显低于其他癌症或正常组织亚型(补充图)。3B)。DNA甲基化是哺乳动物基因组中必不可少的调控层,控制着包括发育在内的多种生物学过程。DNA甲基化模式在癌症中发生了深刻的改变,包括通过启动子高度甲基化抑制肿瘤抑制基因的转录,以及通过全球低甲基化激活基因转录。21我们的数据表明,RP11-19E11.1的表达可能由于含有这种INcRNA的一个大的染色体区的低甲基化而在基础肿瘤的子集中被解除管制。由于所鉴定的所有RP11-19E11.1转录本均显示核定位和染色质结合,因此我们认为这种RNA的功能与染色质相关过程的调控有关。

高rp11-19E11.1的患者表现出特殊的致癌信号。

由于RP11-19E11.1高水平患者的预后比低表达者差,我们询问过表达RP11-19E11.1的患者是否有特定的致癌信号。为此,我们比较了BL患者RP11-19E11.1高表达和低表达(1q对4q),n=33(每组)使用GSEA(如图所示)。4A)。有趣的是,RP11-19E11.1水平较高的患者表现出明显的下调特征性磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt/哺乳动物的雷帕霉素信号通路的靶点,并上调Rb/E2F的致癌通路(如图所示)。4B,c)。然后,我们通过扩增、缺失或突变来评估这个轴的某些主要效应在癌症中是否有任何改变(Rb,E2F,CDKN2A,CCDN 1,CDK 4),这些改变可能与incRNA的表达模式有关。22(无花果)4D)。解除对这一途径的管制是众所周知的在乳腺癌中普遍存在,并与不良结果有关。23我们没有发现高和低RP11-19E11.1的患者在任何可以激活这些通路的基因改变的发生率上有显着性差异(图一)。4D,e)。由于RP11-19E11.1高表达的患者有一个特定的致癌信号,我们分析了这种INcRNA的表达是否被限制在一个独特的TNBC分子亚型上,正如另一个成熟的分类方案所定义的那样。6,24102例TNBC患者在这6种不同亚型中,BL1亚型中RP11-19E11.1明显富集(图1)。4F)。BL1是一个在细胞周期和细胞分裂成分及途径中富集的亚型,表现为增殖增强和细胞周期控制点丢失。这些结果与我们的GSEA分析结果吻合得很好。此外,我们还观察到,这种INcRNA在IM和间充质亚型中也有高表达,这两种亚型与BL2、MSL或LAR相比都具有高度的增殖表型。

图4:基底样高发患者的GSEA分析n=33比低(n=33)RP11-19E11.1的表达水平。
figure4

aRP11-19E11.1高、低患者上、下位基因热图。bGSEA丰富了标记存储库的结果。cGSEA的富集导致致癌通路的形成。d高发患者E2F轴基因改变n=33)或低(n=33)RP11-19E11.1水平或基底样亚型(标记为基底层)。e乳腺癌亚型中E2F-和E2F调控基因的热图。f点图显示在102例TCGA(Mann-Whitney试验)TNBC患者中,Vanderbilt分类所鉴定的分子亚型中每个患者RP11-19E11.1的表达情况。给出了每种条件下的平均±扫描电镜。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. HD homodeletion, M mutation, AMP amplification.

这些结果提示,除遗传背景外的其他因素可触发E2F的致癌信号,这一特征与BL乳腺癌预后不良有关。

incRNA rp11-19E11.1基因敲除诱导细胞周期阻滞和凋亡

我们扩展了我们的分析小组的BL细胞株,以研究两种变体的INcRNA RP11-19E11.1的水平。我们还分别用两种不同的LNAs(MTT,3-(4-5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴)对两种不同的LNAs进行了活性测定,分别针对两种不同细胞株HCC 38(LNA 2和LNA NS在72h时的存活率)进行了活性测定。p值0.017,用于LNA 3和LNA NSp值<0.001)和SUM149PT(LNA2vs LNA NS在72h存活时间)p值0.002,用于LNA 2和LNA NSp值<0.001)(如图所示)。5A,b)。结果发现,转染后18 h,LNA 3的敲除效率最高(>90%,LNA 2>80%)。此外,我们观察到,无论使用哪种LNA,这两种变异体在被击倒后都会被下调,这表明它们可以针对无剪接的转录本(补充图)。4)。我们接下来在三个细胞系中进行了靶向RP11-19E11.1的LNAs转染后的RNA-seq。489个基因在三种细胞系中普遍被解除管制(折叠变化>2,假发现率<0.1,图)。5C)。为了确定可能与INcRNA功能相关的主要途径,我们进行了GSEA分析,并对解除管制的基因中的致癌途径和转录因子基序的富集进行了评估。有趣的是,我们的分析表明E2F/Rb致癌通路和E2F转录因子基序丰富的基因在RP11-19E11.1敲除后丢失。5D)。相反,表达上调的基因包括p53途径、紫外线(UV)反应和通过核因子-αB的肿瘤坏死因子-κ信号(图1)。5D).

图5:INcRNA RP11-19E11.1的功能特征。
figure5

a用qRT-PCR方法检测基底样细胞系中V1和V2的RNA水平。以MC10A为参照。b用两种不同靶点的LNAs(LNA 2/LNA 3 25 NM)对HCC 38和SUM149PT细胞株的存活率(MTT)进行检测。c3种细胞系(LNA 1+LNA 2 50 NM)在24 h后,其基因普遍解除(折叠变化>2,假发现率(FDR)<0.1)的Venn图。d在INcRNA RP11-19E11.1基因敲除后,GSEA的富集导致标记和致癌途径的增加。eγH2AX、P53、p-p53和p21在转染后18和24h(25 Nm)后的蛋白质分析。fLNA3转染HCC 38和SUM149PT细胞24h后,细胞周期分析和EDU掺入分析(PI-Edu双染)。每个点代表一个度量。gAnnexin-V分析LNA3转染HCC 38和SUM149PT细胞后24h和48h后的变化。实验至少进行三次,一式三份。数据为平均值±扫描电镜。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (two-tailed unpaired t测试)。

根据这些转录改变,我们对RP11-19E11.1基因敲除后的DNA损伤标记物(γH2AX)和p53途径蛋白进行了Westernblotting分析。我们观察到18h后γH2AX的大量诱导,P53水平在敲除后升高,与其典型靶标p21/CDKN1A(图1)一致。5E)。上调其他典型的p53靶基因,GADD 45PMAIP 1/Noxa,在这两个细胞系中也观察到(补充图)。5A)。因此,细胞周期分析显示,所有细胞系(HCC 38)的S期分数都会随之降低。p值0.017,SUM149PTp值0.002),以及SUM149PT细胞的G2/M期块(p5-乙炔-2‘-脱氧尿苷(Edu)掺入法(HCC 38)测定的dna合成抑制也证实了该值<0.001。p值0.0011,SUM149PTp值0.0014)(如图所示。5F)。鉴于p5 3靶基因的明显激活和DNA损伤反应,我们询问是否能在缺失这种INcRNA的细胞中诱导凋亡。事实上,用Annexin-V染色法进行凋亡分析显示,细胞在击倒后48小时内死亡(如图所示)。5G)在这两个细胞系中。

这些观察表明,我们的GSEA分析与RP11-1E11.1基因敲除后所描述的表型密切相关,即E2F下调和细胞周期阻滞,然后激活凋亡通路。推测细胞凋亡可能与RP11-1911.1 E11.1基因敲除后的复制应激或DNA损伤反应有关。

p5 3下游基因的诱导是以一种部分不依赖p5 3的方式进行的。

p53基因突变在三重阴性乳腺癌中已被报道超过80%.25大多数突变位于DNA结合区,干扰p53与启动子的亲和力,改变转录靶基因的表达。26我们注意到p53缺失细胞系HCC 1569有较高水平的RP 11-1911.1,因此我们询问INcRNA的敲除是否能在p53靶基因中引起同样的反应。出乎意料的是,p21水平在这个细胞系中独立于p53被上调(补充图)。c.)。P53突变的SUM149PT细胞系也得到了类似的结果。该细胞系p5 3的缺失在INcRNA敲除后并不能挽救细胞的存活,p21的水平在RNA和蛋白水平上均升高,而不依赖于p5 3蛋白水平(补充图)。5B,d,e)。因此,凋亡诱导可以独立于p53功能,这与p53突变频率高的乳腺癌亚型有关。

incRNA rp11-19E11.1是E2F1的靶基因。

RP11-1E11.1高表达的患者有一个与激活E2F靶基因子集有关的特定基因标记。事实上,这种INcRNA的缺失会导致细胞周期阻滞,从而减少增殖,进而诱导凋亡基因。因此,我们研究了三种可能的方案,可以将这个INcRNA与E2F基因标记联系起来。首先,INcRNA可以控制E2F1的转录。第二,INcRNA可能受E2F转录家族成员的调控,因此在维持细胞增殖中起着不可或缺的作用;第三,INcRNA参与调控E2F下游基因的一个特定子集。第二和第三种可能性并不是相互排斥的。

为了评估第一种选择,我们使用三个不同细胞株的rna-seq数据检测了RP11-1E11.1基因敲除后E2F家族的水平。结果没有显示任何E2F家族成员的RNA有明显的变化(图一)。6A)。对E2F1和E2F3的蛋白水平也进行了评估,没有发现明显的变化(图一)。6B)。因此,我们进一步评估了INcRNA作为E2F靶基因的可能性。启动子分析确定了一些潜在的E2F基序围绕着转录起始位点(TSS)。p值<0.001,图1。6C)。为了验证E2F1与RP11-19E11.1启动子直接相互作用的假设,我们进行了染色质免疫沉淀(CHIP)分析。由于确定了几个可能的结合位点,我们设计了6个重叠引物集,它们跨越5‘种族鉴定的TSS的上游和下游区域。只有引物集4(−141+13)与对照相比明显富集。p值0.003)(如图所示。6d)。同时,外源性E2F1的表达增强了RP11-19E11.1的表达。p值0.04),与另一个典型的E2F1目标基因CCNE 2(p值0.017)(如图所示。6E).

图6:INcRNA RP11-19E11.1是E2F的靶基因。
figure6

aRP11-19E11.1基因敲除后E2F家族转录因子表达的折叠变化。每个点代表每个细胞株的折叠变化,每个基因的平均值±sd被表示。b用LNA 3对RP11-19E11.1后18、24h的E2F1和E2F3进行Westernblot分析。cE2F转录因子RP11-19E11.1启动子区的基序富集分析。dHCC 38中使用E2F1抗体的染色质免疫共沉淀(芯片)显示了两个生物副本(双尾未配对)。t测试)。e外源性高表达E2F1(双尾配对)后HCC 38和SUM149PT中CCNE 2和RP11-19E11.1的RNA水平t测试)。每个点代表一个度量。数据为平均值±扫描电镜。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

最后,关于RP11-19E11.1调控E2F家族靶基因的可能性,本研究表明RP11-19E11.1缺失后E2F基因信号在体外逆转,DNA损伤、DNA合成阻滞、凋亡通路激活。因此,我们不能排除某些E2F靶基因在RP11-19E11.1耗尽后细胞适应能力丧失而间接下调的作用。超出本报告范围的分析将有助于确定这种INcRNA在E2F转录因子家族直接或间接控制的基因调控中的作用。

E2F家族成员是众所周知的转录因子,控制细胞增殖的几个方面,从细胞周期进展到DNA损伤检查点和修复。已经确定了几个incRNAs为E2F靶,包括H19,27ANRIL28还有埃里克29这些基因在肿瘤细胞中均表现出异常表达,并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。我们认为RP11-19E11.1可能是这组INcRNA的另一个成员。

incRNA rp11-19E11.1表达对BL细胞药物敏感性的预测价值

高水平的INcRNA患者在BL亚型中显示出特定的基因特征。因此,我们询问BL亚型中的药物敏感性是否可以通过INcRNA RP11-19E11.1的表达水平来预测。为此,我们研究了不同表达水平的BL细胞系对来自肿瘤药物敏感性基因组学的267多个化合物的敏感性。30我们发现了14个BL细胞株的药物敏感性筛选数据,并将这些数据与从CCLE中获得的RNA-seq数据各自表达水平重叠。31根据rp11-19E11.1的表达情况,对4株上、4株底部细胞株进行排序,并比较其平均半数抑制浓度(IC)。50)高表达细胞株的平均IC值50(图1)最低的(见图)。7A)。我们选择了那些显示IC的药物进行进一步的分析。50/IC50低层比值<0.25,以确保各组间药物敏感性的生物学意义。对于那些显示IC的化合物50根据INcRNA的表达,比较6个上/下细胞系时,我们分析了药物敏感性与INcRNA表达水平之间是否存在相关性(图1)。7b,c)。有趣的是,其中三个化合物的表达水平与敏感性呈显著负相关:pac-1(p值0.022),p价值0.023)和YM 201636(p值0.023)(如图所示。7C)。PAC-1是第一个开发出来的前caspase激活剂化合物,并于2016年被食品药品管理局指定为孤儿药物。32扎司他林是蛋白激酶C(PKC)的抑制剂,在治疗淋巴瘤的III期治疗中失败。33YM 201636是一种PIKfyve(磷脂酰肌醇磷酸激酶PIP5KIII)抑制剂,是一种参与PtdIns(3,5)P2生物合成的激酶。它的抑制破坏了被感染细胞的内膜运输和逆转录病毒释放。34

图7:以INcRNA RP11-19E11.1水平作为预测值进行药物筛选。
figure7

a根据RP11-19E11.1(来源于CCLE)的表达,可获得药物敏感数据的基底样细胞系排名。31) b识别出的敏感性显著不同的化合物(根据IC)50)比较RP11-19E11.1表达水平低或高的细胞系。cRNA表达与药物敏感性的线性相关50)b。采用皮尔逊相关检验。不包括CAL-85-1细胞株(无表达数据).d对苯司他林的结果进行了验证。数据为平均值±扫描电镜。*P < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (unpaired t除非有指明,否则进行测试。

为了验证筛选出的化合物,我们对RP11-19E11.1水平的qRT-PCR结果进行了排序,选出了3个上/下细胞系。采用与筛选方法相似的方法进行代谢试验的治疗时间和生活能力评估。我们发现无论是PAC-1还是YM 201636都没有观察到筛选细胞株的趋势(补充图)。6a,b)。另一方面,除SUM149PT(补充图)外,Zenzastaurin在所有被测细胞系上都显示了预期的结果。6C)。因此,我们决定包括另一个细胞株的RP11-19E11.1,MDA-MB-468的中等水平。在这里,我们复制了在筛选中观察到的结果,作为一个显著的负相关(p在RP11-19E11.1水平与对扎司他林的敏感性之间观察到0.044)。7D)。集成电路50在筛选中观察到的值有相同的趋势,但没有显着性。

这些结果是相当挑衅性的,因为pkc的活动导致了几条通路的激活,这些途径可以调节许多细胞过程,包括增殖和抗凋亡信号。35PKC通过直接磷酸化激活Raf1,进而导致Rb蛋白磷酸化,释放E2F转录因子。36此外,Raf1-RB蛋白相互作用的破坏导致肿瘤生长和血管生成抑制。37此外,PKC还能激活RAS,从而诱导E2F1的表达。38因此,PKC抑制可能是进一步探索E2F活化信号的基础乳腺癌治疗的一个有吸引力的靶点。

讨论

几项研究表明,INcRNA的表达可以和PCGS一样有效地将乳腺癌分为亚型,13,14,39,40提供额外的预后和预测价值。41我们确定了与正常组织和其他乳腺癌亚型相比,在基底样乳腺癌中过度表达的一组临床相关的incRNAs,我们认为这一特征在今后的研究中可能会有帮助,以了解这种侵袭性肿瘤的病因和治疗。

在基底型/TNBC亚型中,INcRNA调控异常的后果和机制尚不清楚。两项研究使用INcRNA微阵列比较了一小群患者TNBC与正常组织的表达水平,42,43另一项研究侧重于乳腺癌亚型,但没有考虑到正常组织中INcRNA的表达,40就像我们在学习中所做的那样。此外,我们的研究是新的,因为我们交叉病人的数据与细胞系的RNA-seq数据,以努力利用临床发现在体外的研究,以进一步的功能和机械研究。有趣的是,在先前的研究中,我们的两位候选人被确认为基础特异性的incRNAs,即ctd-2015g9.2和rp11-19E11.1。40,44我们发现的另一个候选基因是MIR 146,MIR 146是MIR 146的宿主基因,它是一种广泛研究的微RNA,在TNBC/基底样乳腺癌中起着重要作用。45我们用qRT-PCR方法验证了INcRNA在不同细胞株亚型中的表达规律。此外,我们还证实了INcRNA消融对细胞增殖和迁移/侵袭有重要影响,这是肿瘤信号的主要特征。

我们选择了incRNA RP11-19E11.1作为进一步研究的重点,因为它的OE与基底样乳腺癌预后不良有关。重要的是,它的耗竭损害细胞的增殖,并强烈诱导细胞凋亡。当我们的手稿正在准备中时,另一组发现RP11-19E11.1在一组独立的肿瘤样本中是一种特殊的基底样转录本。44在这项研究中,作者发现这种INcRNA是通过表观遗传修饰来调控的,与我们的观察一致,但没有详细描述转录本、室间定位或推测功能。在这里,我们至少识别和描述了三个RP11-19E11.1转录体,纠正了实际的GENCODE注释。重要的是,我们还发现这两个主要的INcRNA变异体是染色质相关的。此外,通过对患者和细胞系进行GSEA分析,我们将INcRNA表达与E2F信号联系起来,并通过芯片实验证明了其与E2F的连接。我们还对RP11-19E11.1基因敲除后的三种不同细胞株进行了转录体范围的分析,进一步加强了这种RNA的消融、DNA损伤反应的激活和诱导凋亡之间的联系。因此,我们的工作已经大大扩展了以往的成果,提供了更好的了解RP11-19E11.1在基底样乳腺癌中的作用。

基底样乳腺癌通常是低分化的肿瘤,在胚胎干细胞特征中富集,并显示增殖相关因子的激活。46E2F转录因子是众所周知的RB肿瘤抑制因子的下游效应,在调控细胞周期进程中具有重要作用。47,48它们不仅转录了从G1期向S期过渡所需的基因子集,而且在控制有丝分裂、DNA损伤检查点、修复和凋亡等方面起着重要作用。47,48众所周知,E2Fs会影响癌症的发展,22TNBC发生RB功能障碍的病例约占30%。49E2F转录因子在乳腺癌发生发展中的作用是不容置疑的。23在本研究中,我们发现了RP11-19E11.1水平上调患者的E2F致癌信号。此外,我们的结果显示RP11-19E11.1是E2F1的靶基因和染色质相关的INcRNA。事实上,RP11-19E11.1的敲除导致DNA合成受到抑制,E2F靶基因的表达降低,随后DNA损伤反应和凋亡途径强烈激活。我们发现,这些效应可以独立于p53发生。这些结果表明RP11-19E11.1功能可能与E2F的功能有关。在文献中可以找到几个控制细胞周期的incRNAs例子。50例如,安瑞尔,一个E2F1目标基因,通过向INK 4启动子。另一个E2F1目标基因H19/miR-67似乎参与了pRb通路的失活。因此,为了阐明RP11-19E11.1可能参与调控细胞周期的可能性,今后的研究应研究RNA-DNA和RNA-蛋白质的相互作用。

RP11-19E11.1表达增高的患者有一个与不良预后相关的特殊致癌信号。我们推测这些病人对药物治疗也会表现出不同的敏感性。利用药物筛选在细胞系中公布的数据,我们确定了一种PKC抑制剂作为进一步研究的潜在化合物。值得注意的是,PKC不仅与E2F激活有关,而且还参与病毒复制的关键步骤。51病毒引发乳腺癌的想法已经被提出,但有争议。更令人振奋的是,最近发表的一项研究发现,人类内源性逆转录病毒-K的表达与基底样乳腺癌密切相关,并且在这些患者中观察到与Rb磷酸化和细胞周期激活密切相关。52

总之,本研究利用tcga的大量样本来鉴定临床相关的基底样incRNAs。其中一些候选人可能具有预后价值,并可能与致癌表型直接相关。最后,我们对incRNA,RP11-19E11.1进行了表征,鉴定了一种新的染色质相关和E2F靶标INcRNA。我们的结果表明,这种INcRNA是细胞周期进展所必需的,其消融通过诱导细胞凋亡而损害细胞活力。我们还鉴定了与RP11-19E11.1的表达相关的E2F特异性信号,并利用表达这种INcRNA的细胞系来确定可能的药物治疗方法,并可在TNBC患者中进行检测。

方法

TCGA数据

所有测序样本的读计数表(n在TCGA中,从国家癌症研究所的基因组数据共享(GDC)下载。使用DEseq 2根据其库大小因子对计数表进行规范化,并进行差异表达式分析。使用iCellR(https://github.com/rezakj/iCellR)通过主成分分析和t-SNE分析筛选分散基因。所有甲基化β具有Illumina 450甲基化数组数据的样本的值(n(=892)从GDC下载。

rna-seq数据处理

所有原始测序从我们的样本中读取(基因表达总括(GEO))https://identifiers.org/geo:GSE138606(2019年)和从GEO储存库下载的细胞系,https://identifiers.org/geo:GSE73526(2016年)和https://identifiers.org/geo:GSE48213(2013),使用星对齐仪(v2.5.0c)绘制到人类参考基因组(GRCH 37/hg 19)54。比对由一个基因转移格式文件指导。使用Picard工具计算平均读插入大小及其标准偏差(v.1.126)(http://broadinstitute.github.io/picard)。读取计数表是使用HTSeq(v.0.6.0)生成的。55使用DEseq 2根据它们的库大小因子进行规范化56并进行差异表达分析。使用BEDTools生成每百万个规范化的大文件(v.2.17.0)57和bedGraphToBigWig工具(第4节)。所有下游统计分析和生成地块都是在R环境下进行的(v.3.1.1)(http://www.r-project.org/).

细胞培养

将乳腺癌细胞MDA-MB-231、Hs578T、MDA-MB-157、MDA-MB-468、MCF 7、SkBr 3和BT 474分别培养于Dulbecco改良的Eagle‘s mMedium:营养液F12(DMEM/F12)(Corning)+10%胎牛血清(FBS)、P/S(50 U/mL)和Bt 474。L-供过于求(1%)。SUM149PT和SUM159PT分别与添加5%FBS、P/S(50 U/mL)的DMEM/F12混合培养。L-过剩(1%)、胰岛素(5g/mL)和氢化可的松(1g/mL)。乳腺癌细胞HCC 2157、HCC 38、HCC 2157、BT 549、HCC 70、HCC 1143和T-47D分别在含10%FBS、P/S(50 U/mL)的RPMI培养基中培养。L-供过于求(1%)。正常乳腺MCF10A细胞在添加5%马血清、表皮生长因子(20 ng/mL)、霍乱毒素(100 ng/mL)、胰岛素(0.01 mg/mL)和氢化可的松(500 ng/mL)的DMEM/F12(Corning)培养基中培养。所有细胞均在37°C和5%CO的条件下培养。2。除SUM149PT和SUM159PT(来自Neel BG实验室)外,所有细胞系均来自ATCC。

为确保无支原体培养,采用通用支原体检测试剂盒(ATCC,30-1012K)定期检测细胞。

RNA干扰(siRNA和LNA)协议

在OptiMEM(吉布科)和RNAiMAX(Invitrogen)2.5L/mL(Invitrogen)中制备20 nm(Dharmacon)的siRNA或25/50 NM的反义LNA GapmeRs。然后在播种时将转染混合物添加到细胞中。6h后,用新的培养基代替培养基。siRNA和LNAs序列采用补充方法。

细胞转染协议

细胞接种于6孔板中,汇合率为20%~30%.第二天,用Fugene HD试剂(Promega)以3:1的比例在OptiMEM中制备转染混合物,pCMV-E2F1或pCDH-EGFP为1g。10 min后,在0.5%DMEM/F12培养基中加入终体积为1mL的混合液。6h后,加入10%FBS培养基。第二天,将转染培养基替换为新鲜培养基,48或72h后收集细胞进行分析。

细胞分馏

细胞核/细胞质分馏按描述进行。53简单地说,用冷磷酸盐缓冲液(Pbs)冲洗三次细胞,仔细擦洗.纺丝后,中断缓冲液(KCl 10 mm,MgCl 1)2加入1.5mm,Tris-Cl,pH7.5,20 mm,二硫苏糖醇(DTT)1mm,静置10 min。用10-15次中风来破坏细胞质.当细胞质破碎90%时,加入0.1%的TritonX,倒置5次,1500 r.pm离心5 min。用该方法回收了含有细胞质分数的上清液。用Surep核或细胞质RNA纯化试剂盒(Fisher,BP2805-50)对上清液和细胞核(小球)进行RNA提取。对两组分(Norgen Biotek Cat)进行DNAaseI处理。嗯。25710)。

染色质沉淀

如上文所述,进行了细胞分馏。然后将含核组分的球团重新悬浮在12 5μL的冷NUN 1缓冲液(20 mm Tris-HCl,75 mm NaCl,0.5mm EDTA,5 0%甘油)中,并转移到新的Eppendorf中。然后,1.2mL的NUN 2冷缓冲液(20 mm HEPES-KOH,pH 7.6,300 mm NaCl,0.2mm EDTA,7.5mm MgCl)2加入1%NP 40,1M尿素,进行旋涡处理。样品在冰上保存15 min,每3~4 min进行一次涡旋。16,000×离心回收染色质g在4°C下提取RNA,用TRIzol LS(Invitrogen)从上清液中提取RNA,用TRIzol(Invitrogen)提取染色质组分。

逆转录和定量实时PCR

用TRIzol试剂(Fisher)分离总RNA。用NanoDrop(Thermo Science)定量RNA,用Verso cDNA合成试剂盒(Thermo Science)反向转录RNA。用CFX 96触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行定量逆转录PCR.用ΔΔCT法计算相对表达量,以GAPDH为内对照。引物序列在补充方法中。

蛋白质提取与Westernblot

细胞经胰蛋白酶消化,用PBS洗涤。在新鲜的ELB缓冲液(50 mm HEPES,pH7,150 mm NaCl,5 mm EDTA,0.1%NP 40,10%甘油)中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂(1 mm DTT,0.5mm AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐),2μg/mL亮肽,2μg/mL抑肽酶,10 mM NaF,50 mmβ-甘油磷酸酯)。在10-15%的丙烯酰胺凝胶中装载了20微克的蛋白质.原抗体用3%牛血清白蛋白TBS-T(Tris-缓冲液加吐温-20)稀释,4°C孵育O/N,一次抗体和稀释液为α-微管蛋白(SigmaT 5168,1:5000),E2F1(CST#3742,1:1000),E2F3(GeneTexGTX11843,1:2000),p21(#2947,1:1000),P53(Santa Cruz FL-393,1:1000),p-p53(CST#9286,1:1000),γH2AX9718,1:1000。所有的印迹都是从相同的实验中提取出来的,并被并行处理。未裁剪的印迹可以在补充信息文件中找到。

FACS分析

对于EDU和细胞周期分析,按制造商的说明使用了Click-it Edu Alexa Fluor 488试剂盒(Invitrogen C 10337)。

采用Annexin-V试剂盒(Mileny Biotec,130-092-052)进行Annexin-V染色.所有分析均用LSRII型紫外细胞分析仪(BD生物科学)和Flowjo软件进行。

活性测定和化合物

在药物敏感性评价方面,将细胞接种在96孔板上,每孔4000细胞。第二天,细胞在37℃与不同浓度的试验化合物共同孵育。对照组用二甲基亚砜(DMSO)孵育。48或72h后,用添加MTT(Sigma)的新鲜培养基代替培养基,终浓度为0.5mg/mL。1.5h后,去除培养基,用100μl的二甲基亚砜溶解甲醛晶体。在紫外分光光度计(TECAN无限M 200)中读取570 nm处的吸光度。本试验使用的药物为PAC-1(S 2738,Selleckchem),YM 201636(参考文献)。13576,开曼化学),和Z astaurin(参考文献。Hy-10342,MedChemExpress)。

RNA干扰后细胞活力测定,以4000细胞/孔为种子,同时转染细胞,如前一节所述。6h后,用新的培养基代替培养基。每天进行MTT试验,并与T0比较。所有实验在不同传代数下至少重复三次,每次重复三次。

cDNA末端的快速扩增

根据上述协议,从HCC 2157细胞株中分离出核RNA。按照制造商的指示,使用更智能的RACE 5‘/3’Kit(Clontech)执行比赛。在转录本已知区域设计引物,以达到准确的5‘或3’末端(补充方法)。

染色质免疫沉淀

芯片是按照前面描述的方法执行的,并做了一些修改。58。核从1×10中获得7HCC 38细胞与1%甲醛交联。用Branson Sonifier 450在冰上进行超声处理,获得平均长度为400-600 bp的DNA。每片反应使用相当于25g DNA的DNA。先用蛋白A预清染色质,然后与每种抗体的2μg共同孵育,再将E_2F1和IgG(微孔17~10061交联)O/N再悬浮在10 mM Tris的200μL中,pH8.0缓冲液中,定量PCR法测定染色质的富集。使用的引物在补充方法中有描述。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料,可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

原始的RNA测序数据(支持图)。1)在研究过程中使用的,可在NCBI基因表达总库(GEO)中公开获得:https://identifiers.org/geo:GSE73526https://identifiers.org/geo:GSE48213。读计数表(支撑图)14)所有测序样本(n在TCGA中,国家癌症研究所(NCI)基因组数据共享(GDC)(https://portal.gdc.cancer.gov/)。rna-测序数据集(支持图)36)在目前的研究中产生的,可在全球环境展望资料库中公开查阅:https://identifiers.org/geo:GSE138606。乳腺癌细胞系数据的药物敏感性(附图)7)可在https://www.cancerrxgene.org/downloads/drug_data?tissue=BRCA。如下列元数据记录所述,应相应作者Francisco J.Esteva教授的请求,将提供研究期间使用和生成的其他数据集:https://doi.org/10.6084/m9.figshare.1026652759.

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