口腔扁平苔藓(OLP)是一种以角质形成细胞凋亡和炎症反应为特征的口腔上皮疾病。OLP的发病机制仍是一个谜。在此，我们发现OLP患者口腔粘膜活检、血清和唾液中miR-26a/b水平明显低于健康对照组。此外，我们在miR-26a/b基因的启动子区域发现了维生素D受体(VDR)的结合位点，证明miR-26a/b的诱导是VDR依赖的。在维生素D缺乏或缺乏的口腔上皮中也检测到miR-26a/b的表达减少。VDR击倒老鼠。MIR-26a/b抑制剂能促进口腔角质形成细胞凋亡和1T辅助性细胞因子(Th1)的产生，而miR-26a/b模拟物对口腔角质形成细胞有保护作用。机械地分析miRNA靶基因，证实miR-26a/b通过直接靶向蛋白激酶Cδ(PKCδ)来阻断细胞凋亡。同时，miR-26a/b通过分化38(CD 38)的靶向簇抑制Th1相关细胞因子的分泌。随着miR-26a/b的降低，OLP患者血清PKC、δ和CD 38水平显著升高。综上所述，我们的研究表明维生素D/VDR诱导的miR-26a/b通过抑制口腔角质形成细胞的凋亡和抑制炎症反应而在口腔扁平苔藓中发挥保护作用。

口腔扁平苔藓(OLP)被认为是一种慢性黏膜疾病，在全世界的牙科诊所中越来越普遍。1。据估计，OLP的患病率约为2%，而且这一数字正在全球范围内不断增长。2。虽然大多数研究和研究人员倾向于将扁平苔藓归类为炎症性疾病，但其发病机制长期以来仍不清楚。1。一些因素和诱因，如全身或局部过敏、精神压力、微生物感染和对抗原的自身免疫反应，都参与了OLP的发生或发展。3。临床上，大多数OLP患者都会出现口腔不适，即使是在摄入辛辣或酸性食物的过程中也是如此。4。只有少数OLP患者(约15%)伴有皮肤病变，约0.4%-5%的OLP患者有患口腔癌的风险。5。在组织病理学上，OLP病变组织的主要特征是固有层T淋巴细胞浸润带和上皮层细胞样体，分别表现为炎症反应和凋亡。1,6,7。到目前为止，治疗OLP患者的努力一直受到重视，但是治疗的目的仅仅是控制临床症状，而不是治疗。1。鉴于此，需要对OLP的病因探索和永久治疗进行研究。

microRNAs是一组由21-25个核苷酸组成的非编码RNA，在转录后促进靶基因的mRNA降解过程中起到抑制基因表达的作用。8,9。它们直接与mRNA的3‘非翻译区(3’UTR)结合，导致下游靶基因的翻译抑制。9。据报道，microRNAs不仅在细胞内动态平衡和生物过程中发挥着关键作用，而且在广泛的病理条件下，也在各种疾病的发展中起着关键作用。8。在发现的数千个miRNAs中，有一些已经被证明与OLP的过程相关。10,11。在2019年，我们报道了NF-κB通路诱导的miR-802靶向B细胞淋巴瘤2(bcl-2)基因，使角质形成细胞凋亡加剧。6，建立miRNAs与这种疾病的发生或发展之间的关联。此外，另一个有趣的发现是miR-155和miR-19a调节Th1/Th2平衡，以控制OLP的炎症反应。7。因此，利用口腔角质形成细胞中的miRNA网络可以更好地解释OLP的原因。

mir-26家族包含mir-26a和mir-26b，在许多生物学或病理过程中起着至关重要的作用。12。miR-26a/b基因座位于宿主基因内含子中，编码羧基端rna聚合酶Ⅱ多肽A小磷酸酶家族的蛋白质。13。miR26a/b主要通过靶向与细胞周期和增殖相关的基因在多种癌症中发挥抑癌作用。14,15,16。此外，最近的研究表明miR-26抑制了支气管上皮细胞的肿瘤坏死因子α、IL-6和NF-κB通路。17，表明其在调节炎症反应中的作用。虽然miR-26a/b在癌细胞中的作用得到了充分的研究，但其在口腔角质形成细胞中的意义尚不明确。

在这项研究中，我们证实miR-26a和miR-26b在OLP患者中被下调.mR-26a/b的降低是由于维生素D受体(VDR)的减少所致，两者之间存在正相关关系。在机制上，我们发现miR-26a/b分别抑制口腔角质形成细胞凋亡和Th1相关细胞因子的产生。综上所述，我们的发现描述了miR-26a/b在OLP中发挥保护作用，并为这种疾病提供了一个潜在的治疗目标。

MIR-26a/b在OLP病中表达下调

由于miR26a/b在调节疾病进展中具有重要作用，我们首先检测了它们在OLP标本上皮层的状态。如图所示。1OLP活检上皮中miR-26a和miR-26b水平明显低于健康对照组(图一)。1A)。OLP是一种炎症性疾病，表现为细胞因子表达增强。1,18。为了评价miR-26a/b和OLP的临床相关性，我们在标本中检测了一种关键的细胞因子-肿瘤坏死因子(α)，并观察到两者之间的负相关(附图)。1A，b)。同样，在参与者的血清和唾液样本中也发现了相似的结果(图一)。1C-f和补充图。1B，c)。因为细菌感染和自身免疫反应是导致OLP发生的原因。1,19我们利用LPS或活化的CD4建立了人口腔角质形成细胞(HOK)的两种细胞模型。+T细胞分泌的治疗，如前所述6在体外模拟OLP的微环境。正如预期的那样，mr26a/b在lps或活化CD4的存在下，mr26a/b呈时间依赖性下降，而tfα水平显著升高。+T细胞分泌(附图)1D-g)，两者之间也存在显著的负相关(附图)。1H-k)。目前还没有成熟的模拟OLP的动物模型，因此我们仅限于测试miR 26在小鼠模型中的表达。

a实时PCR法测定人口腔上皮标本中MIR-26a/b水平。b口腔上皮细胞肿瘤坏死因子α与miR-26a/b的相关性(英文)r=−0.8118，P=3.59×10−6、miR-26a的Spearman相关检验；r=-0.8383，P=2.36×10-6，Spearman对miR-26b的相关检验。c采用实时聚合酶链反应(PCR)法测定受试者血清MIR-26a/b水平。d口腔扁平苔藓患者血清肿瘤坏死因子α浓度与血清miR-26a/b水平的相关性(英文)r=−0.6488，P=5.18×10-8、miR-26a的Spearman相关检验；r=−0.7227，P=5.19×10-8，Spearman对miR-26b的相关检验。eOLP唾液的qPCR分析显示miR-26a/b比健康对照组降低40%。f口腔扁平苔藓患者唾液中肿瘤坏死因子α状态与miR-26a/b表达的相关性(英文)r=−0.6128，P=1.57×10−7、miR-26a的Spearman相关检验；r=−0.7525，P=1.63×10−7，Spearman对miR-26b的相关检验。**P < 0.01, ***P < 0.001 vs. corresponding healthy controls; n=每组14人。

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维生素D/VDR信号通路介导口腔角质形成细胞miR-26a/b的表达

为了了解miR-26a/b在OLP中的作用机制，我们对它们的基因组转录区进行了评价。NCBI的基因数据库显示miR-26a似乎有两个基因。和平26a-1和和平号-26a-2)，它们位于宿主基因中。CTDSPL和CTDSP 2miR-26b基因位点分别定位于其宿主基因的内含子中。CTDSP 1并与其拥有相同的启动子(如图所示)。2A)。UCSC数据库的生物信息学分析表明，三个miR-26a/b基因的启动子均含有转录因子VDR的结合位点，称为维生素D受体元件(VDRE)。2A和补充图。2A)。VDR是一种核激素受体，具有广泛的生物学活性，包括免疫应答抑制和细胞凋亡抑制。20。为了证实生物信息学数据，我们设计了VDR结合位点两侧的引物，并进行了芯片分析。结果显示，与载体对照相比，VDR蛋白在VDR质粒处理后与VDRE结合牢固(见图)。2B)。VDR的表达被选择作为内部对照，同时也有很高的表达(补充图)。2B，d)。VDR质粒转染可促进miR-26a/b及其宿主基因的表达(附图)。2C-e)，以及获救的LPS或活化的CD4+T细胞诱导miR-26a/b减少(图1.2C，d)。在两种细胞模型中，VDR的mRNA和蛋白表达均下降了约50%(补充图)。2F-k).

amiR-26a/b基因启动子区VDR结合位点的示意图。b芯片分析显示转染hks后36小时vdr质粒的mir-26a/b水平升高，bar表示log。2折叠零钱，n=3.活化CD4对HOK细胞miR 26-a/b表达的qPCR分析+T细胞(c)或LPS(d)无论有没有VDR质粒，n=3.miR-26a/b在VDRKO口腔角质形成细胞中的差异表达(e)，治疗过的(f)，或维生素D缺乏(g)老鼠，n5.Paricalcitol是维生素D的类似物。hOLP活检中VDR与miR-26a/b折叠变化的相关性(英文)r=0.85081，P=0.00036，miR-26a的Spearman相关检验；r=0.79941，P=0.02852，Spearman对miR-26b的相关检验)，n=14。iOLP患者血清中25(OH)D浓度与miR-26a/b水平的相关性(英文)r=0.44655，P=2.86×10−11、miR-26a的Spearman相关检验；r=0.58412，P=2.87×10-11，Spearman对miR-26b的相关检验)，n=14.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. corresponding control. Ctrl control, VDRKO VDR knockout, Pari paricalcitol, VD-D vitamin D deficiency.

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据报道，维生素D能结合和激活细胞质中的VDR，并加速其核易位。21。为了验证维生素D/VDR信号通路在miR-26a/b中的作用，我们用1，25-二羟基维生素D(1，25(OH))处理HOKs。2D3)，相应地，维生素D的活性形式，1，25(OH)2D3在两种细胞模型中，miR-26a/b略有逆转(补充图)。2L)。然而，1，25(OH)的这种保护作用2D3hVDR-siRNA转染HOKs后减少。2m，n)。此外，VDR蛋白的乙酰化发生在赖氨酸91(K91)，这是由溴结构域蛋白(BRDS，补充图)。2o-p)和药物抑制BRD 9(IBRD 9)是通过促进VDR乙酰化来促进维生素D/VDR信号转导的生理功能。22。事实上，当存在1，25(OH)时，miR-26a/b的水平要高得多。2D3与对照或1，25(OH)相比，iBPD 92D3单独(附图)2Q).

与体外实验结果一致，miR-26a/b使VDRKO小鼠的miR-26a/b下降了40%。2E)。用qPCR和WESTERNBLOTTING方法检测VDR缺失(附图)。2R)。此外，我们还建立了野生型小鼠维生素D(VD)过表达和缺乏症模型，并验证了VDR的mRNA和蛋白水平(附图)。2s-t)。VD处理后小鼠口腔角质形成细胞MIR-26a/b表达上调，VD缺乏小鼠口腔角质形成细胞Mir-26a/b表达略有下降(图一)。2F-g)。在人标本中，活组织检查中VDR水平与miR-26a和miR-26b呈良好的正相关，血清中的VDR与miR-26a和miR-26b呈正相关。2H，i).

miR26a/b阻断口腔角质形成细胞凋亡活性

凋亡是OLP最常见的特征之一。6,23因此，我们使用miR26a/b模拟物或抑制剂评价HOKs中与凋亡相关的关键因素。如图所示，miR26a/b水平在miR-26a/b模拟或抑制剂治疗中明显上调或下调(补充图1)。3A，b)。同时，miR26a/b模拟处理可抑制Caspase 3、Caspase 9、PARP和Caspase 3的活性，而miR26a/b抑制剂则起相反的作用。3A，b和补充图。3C，d)。此外，miR-26a/b模拟脂多糖或CD4的衰减。+T细胞分泌诱导HOK细胞凋亡(附图)。3E-g)，而miR-26a/b抑制剂则加重了凋亡活性(附图)。3H-j)。为了进一步证实miR-26a/b的作用，我们给C57BL/6小鼠注射miR-26a/b模拟物或抑制剂，并验证了它们在小鼠口腔上皮细胞中的水平(补充图)。4A，b)。一致地，在小鼠口腔角质形成细胞中，miR-26a/b能抑制多种凋亡标记物的凋亡，而抑制剂则能促进细胞凋亡(如图1所示)。3C，d和补充图。4C，d)。在用小鼠口腔角质形成细胞建立的细胞模型中也观察到了同样的结果(补充图)。4E-j)，支持miR-26a/b抑制口腔角质形成细胞凋亡的观点。

a–dWesternblot结果显示，miR-26a/b模拟物对HOKs中Caspase 9、PARP和Caspase 3的裂解有明显的影响。a)或抑制剂(b). c-d小鼠口腔角质形成细胞Caspase 9、PARP切割和caspase 3表达的Westernblot分析C57BL/6小鼠受miR-26a/b模拟(c)或抑制剂(d)尾静脉注射。e推测miR-26a/b结合位点在PKCδ3‘UTR中。fhPKCδ3‘UTR结合位点的示意图。g荧光素酶报告法检测hPKCδ3‘UTR中miR-26a/b靶结合位点，转染LUC-PKCδ-3’UTR或PRL-TK(对照)质粒。24h后测定荧光素酶活性。h用Luc-PKCδ-3‘UTR或Luc-PKCδ-3’UTR-Mut和miR-26a/b抑制剂共转染HOKs。I-j用实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测miR-26a/b模拟物或抑制剂对HOKs中pkcδ表达和磷酸化的影响。i)或Westernblot(j)。westernblot显示miR-26a/b模拟过程中HOKs中bax易位、cyt c释放及下游凋亡因子的表达(P<0.01)。k)或抑制剂(l)用或不加pkCδ质粒或siRNA转染。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. corresponding control; n=3用于体外和n体内试验=5。Ctrl对照，Mito线粒体，Cyto细胞质，Cytc细胞色素c，MI模拟，在抑制剂，Mut突变。

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MIR-26a/b靶向pkcδ调控口腔上皮细胞凋亡

然后利用TargetScan数据库检索miR-26a/b的凋亡相关潜在靶基因。在这数百个可能的靶基因中，pkcδ被描述为通过调节细胞内线粒体的损伤而诱导细胞凋亡。24，预测其mRNAs的3‘UTR中存在miR-26a/b的结合位点(图1)。3E)。进一步的生物信息学分析发现pkcδ中miR-26a/b结合位点在物种间高度保守(附图)。4K)。为了进一步通过荧光素酶报告法证实，我们克隆了50 bp核苷酸(2581-2630)，其中包括hPKCδ3‘UTR片段的miR-26a/b目标序列，并克隆到PRL-TK载体上。3F)。当miR-26a/b模拟共转染时，Luc-PKCδ-3‘UTR显示荧光素酶活性下降。第三代)。MIR-26a/b抑制剂对Luc-PKCδ-3‘UTR有促进作用，但对Luc-PKCδ-3’UTR-Mut无促进作用。3H)。我们的qPCR和westernblot结果一致地证实miR-26a/b对pkcδ表达及其磷酸化有调节作用(图1)。3i，j).

这些发现促进了我们评估PKCδ在OLP中的表达。结果表明，两种细胞模型均能提高PKCδ水平和磷酸化PKCδ活性(附图)。5A)。在pkcδ激活过程中，bax转运到线粒体和细胞色素中。c从细胞器释放，导致细胞凋亡24。为了回答pkcδ是否促进口腔角质形成细胞凋亡的问题，我们构建了pkcδ质粒，并证实了bax和细胞色素的改变。c质粒转染后HOK细胞的分布及凋亡加重(附图)。c.)。在接下来的研究中，我们使用了两种pkcδ抑制剂rottlerin和δv1-1，以达到平衡bax和细胞色素的目的。c细胞模型中细胞凋亡的分布及抑制作用(附图)。5D-g)。为了进一步研究miR-26a/b对OLP细胞PKCδ的抑制作用，我们在两种细胞模型中抑制或升高了miR-26a/b水平。如附图所示。5miR-26a/b模拟物能抑制PKCδ的表达和活性，而miR-26a/b抑制剂则在HOKs中诱导其表达和活性。5H-K)。然后免疫沉淀PKCδ，用抗磷酸化酪氨酸抗体(Py)分析其酪氨酸磷酸化。结果表明，miR-26a/b对OLP诱导的PKCδ酪氨酸磷酸化有调节作用。5L，m)。miR-26a/b在小鼠口腔角质形成细胞中的调节作用也得到证实(附图)。5N-u).

为了确定miR-26a/b靶蛋白激酶Cδ是否介导细胞凋亡，我们在HOKs中进行了几个拯救实验。首先，质粒转染pkCδ的过表达逆转miR26a/b对细胞凋亡的抑制作用。3K和补充图。5V)。第二，用siRNA技术进行pkcδ基因敲除(补充图)。5X抑制pkcδ可减少miR-26a/b抑制剂诱导的细胞凋亡。3L和补充图。5W)。这些数据表明miR-26a/b通过靶向PKCδ调控口腔角质形成细胞凋亡。

MIR-26a/b抑制与OLP中的1T助手(Th1)细胞相关的细胞因子，而不是其他Th细胞亚群

CD4+TH细胞似乎是OLP上皮区和固有层的主要淋巴细胞。1,2,4。为此，我们对HOK中Th1、Th2、Th17和Treg细胞及其受体的典型细胞因子进行了研究。如图所示。4在细胞模型中，IFNγ、IL-13、IL-4、IL-17和IL-10的mRNA转录均显著增加，相应的受体也明显增加。4A)。为了解决miR-26a/b是否抑制OLP患者口腔角质形成细胞炎症的问题，我们在这些细胞模型中加入miR-26a/b模拟。如表所示，miR-26a/b的过表达降低了干扰素的γ水平(如图所示)。4B)，它代表Th1细胞，而对其他细胞和所有受体没有影响(补充图。6a，b)。这些耐人寻味的数据表明miR-26a/b似乎会影响Th1相关反应，其他Th1细胞因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和白细胞介素12)也被测试以证实这一结论(补充图)。6C，d).

a热图显示活化CD4对HOK细胞因子及相应受体表达的影响+实时PCR刺激T细胞或LPS。b活化CD4相对干扰素γ状态的实时PCR分析+用36h miR-26a/b预处理T细胞或LPS刺激的HOKs。c推测mR-26a/b结合位点位于CD 38 mRNA 3‘UTR中。d图示显示hCD 38 cDNA 3‘UTR中的结合位点位置。e荧光素酶报告试验显示hCD 38在hCD 38的3‘UTR中有miR-26a/b靶结合位点。F-gHOK中荧光素酶活性的定量研究。细胞共转染Luc-CD38-3‘UTR或Luc-CD38-3’UTR-Mut和miR-26a/b抑制剂。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. corresponding control; n=3.Ctrl对照，在抑制剂中，Mut突变。

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分化簇(CD 38)是口腔上皮细胞miR-26a/b的直接靶基因。

为了解决miR-26a/b如何介导炎症的问题，我们对Targetscan数据库进行了筛选，发现cd38是由干扰素γ诱导的一种表面分子。25,26生物信息学分析表明，在CD 38的3‘UTR中存在高度保守的miR-26a/b结合位点。4C和补充图。6E)。在荧光素酶报告实验中，我们克隆了50 bp核苷酸(3978~4027)，其中含有hCD 38 cDNA 3‘UTR片段的miR-26a/b目标序列，克隆到PRL-TK载体上。4D)。MIR-26a/b模拟共转染后，CD 38的Luc-3‘UTR的荧光素酶活性下降。4E)。MIR-26a/b抑制剂对Luc-CD38-3‘UTR有促进作用，但对Luc-CD38-3’UTR-Mut无促进作用。4F-g)。结果表明，miR-26a/b可介导HOKs中CD 38蛋白的表达。7E，f)和小鼠口腔角质形成细胞(补充图。7I，j).

mir-26a/b下调CD 38的表达，而CD 38在osp中的表达较高，并有助于Th1相关细胞因子的产生。

CD 38在巨噬细胞和上皮细胞炎症环境中强上调25,26。在本研究中，CD 38的mRNA和蛋白水平在细胞模型中均显著升高(附图)。7A-d)。为了解决CD 38是否促进口腔角质形成细胞Th1相关炎症作用的问题，我们构建了CD 38质粒，并将其转染到HOK(补充图)中。7米)。重要的是，CD 38的过度表达促进了干扰素γ、肿瘤坏死因子α、IL-2和IL-12的表达，而CD 38抑制剂则抑制了这些模型诱导的IFN-α、TNF-α、IL-2和IL-12水平。5A，b)，为我们的假设提供了令人信服的证据。同时，miR-26a/b在OLP细胞模型中也证实了miR-26a/b对CD 38表达的调节作用。7g-h)和小鼠口腔角质形成细胞(补充图。7k，l).

a流式细胞术检测CD 38质粒转染后HOKs中干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和白细胞介素12水平。(bqPCR显示活化CD4中IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12水平。+CD 38抑制剂治疗后，T细胞或LPS刺激的HOK。miR-26a时HOKs中干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和白细胞介素12水平的实时聚合酶链反应分析(英文)c)或miR-26b(d)用CD3质粒转染或不转染CD3质粒进行模拟治疗。miR-26a期HOKs中IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12水平的实时聚合酶链反应分析(英文)e)或miR-26b(f)siRNA转染或不转染siRNA的抑制剂治疗。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. corresponding control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs miR-26a/b mi or In group; n=3.Ctrl控制，MI模拟，在抑制剂中。

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MIR-26a/b通过靶向CD 38调节OLP中Th1相关细胞因子

为了检测miR-26a/b靶点CD 38是否介导Th1相关细胞因子，还进行了救援实验。在miR-26a/b模拟物存在下，CD 38增强了干扰素γ、肿瘤坏死因子α、IL-2和IL-12的表达。5C，d)。然而，miR-26a/b抑制剂在CD 38基因敲除条件下失去了诱导细胞因子的能力。5E，f和补充图。7N-p)。总之，这些发现支持miR-26a/b通过靶向CD 38调节口腔角质形成细胞中Th1相关细胞因子的观点。

OLP活检组织中pkcδ活性及CD 38表达增强

我们进一步从OLP炎性活检中分离出上皮细胞，发现PKC活性增强。6A和补充图。8a，b)。因此，与健康对照组相比，Westernblot证实凋亡因子增加，TUNEL染色发现病变组织中有大量角质形成细胞死亡(见图)。6A-c和补充图。8A)。此外，4种Th细胞亚群的CD 38表达、细胞因子及其受体的表达均较正常对照组增加(图1)。6d，e，补充图。8B，c和补充图。1A).

aOLP患者(I)和健康人口腔上皮细胞的Westernblot分析。bOLP患者或健康对照组活检组织的TUNEL染色。c平均每显微镜下TUNEL阳性口腔角质形成细胞(放大倍数×400)，每组20个随机场。d小提琴图显示CD 38 mRNA在健康口腔上皮或OLP口腔上皮中的表达。e人活组织中干扰素γ、IL-2和IL-12mRNA水平的实时PCR分析。n每组14例，NI非炎症组，Ⅰ组。

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口腔扁平苔藓是口腔最常见的疾病之一，超过2%的病例有可能在临床上转化为肿瘤。1。了解OLP的分子原因并找出关键的致病因素，将有助于我们通过药理学方法或其他策略来管理OLP。越来越多的证据表明miRNA网络在这种不治之症中起着非常重要的作用。7,10,11。研究miRNAs在OLP中的功能是OLP勘探的重要途径。在本研究中，我们认为miR-26a/b在OLP病中是下调的，在减少时，miR-26a/b不能协调口腔角质形成细胞的程序性细胞死亡和炎症细胞因子，从而确立miR-26a/b是OLP的关键调节因子。

MIR-26在进化上是保守的，但是它的中介和作用是一个很大的谜团。先前的研究表明，miR-26b显示OLP患者的活组织检查显著减少。27，暗示miR-26家族参与OLP的发展，并鼓励我们阐明miR-26减少的原因。一致地，我们证实在OLP患者和细胞模型中miR-26a和miR-26b水平都被下调。机械地，我们发现并验证了VDR作为miR-26a/b诱导HOKs的关键上游因子。虽然我们以前的研究已经证明维生素D/VDR信号通路在口腔角质形成细胞的微环境中起着保护作用。18其机理没有得到完整的解释。这一次我们提供了维生素D/VDR与miR-26a/b的正相关关系，这有助于更好地理解维生素D/VDR途径对OLP的影响。这些结果也揭示了维生素D补充剂可能是提高OLP患者miR26a/b水平的有效策略。由于我们在临床上遇到的大多数OLP病例都属于网状亚型，因此我们对其他形式的研究是有限的。

我们认为角朊细胞凋亡在OLP之前是很常见的。6。在功能上，miR-26a/b通过靶向PKCδ抑制人和小鼠口腔角质形成细胞凋亡。然而，其他研究发现mir-26a/b能促进多种肿瘤细胞的凋亡。15,28。这些不一致的发现可能是由于这些研究中使用的细胞类型不同所致。pkcδ通过破坏线粒体内平衡，包括bax易位进入线粒体和细胞色素，成为细胞凋亡的重要调节因子。c释放到细胞质中24。在这里，我们做了一个新的观察，即PKCδ活性在OLP活检和细胞模型中被诱导。与其他研究相一致，我们的功能增益和功能丧失测试表明，pkcδ参与了HOK的线粒体损伤和下游凋亡反应。由于一些有吸引力的研究表明miR-26a/b通过靶向各种信号通路来抑制或增强凋亡反应。28,29miR-26a/b是否通过调节口腔角质形成细胞的其他途径，至少在一定程度上抑制细胞凋亡，仍是一个谜。鉴于miR-26a/b有可能促进肿瘤细胞凋亡，研究miR-26a/b在OLP病转化的口腔癌中的作用将是非常有趣的。此外，mir-26a/b在口腔癌中的表达可能会升高，因为据报道vdr在口腔癌中被上调。30，但这一假设还需要进一步研究。

除了角质形成细胞凋亡外，上皮层和固有层的炎症反应也是OLP的另一个主要特征。在此，本研究仅关注上皮细胞炎症的发生。我们观察到在osp标本和细胞模型中，Th1、Th2、Th17和Treg相关细胞因子及其受体显著增加，这与认为Th1/Th2失衡、Th17诱导和Treg细胞的出现都参与了OLP的免疫病理网络的观点是一致的。31。miR-26a/b是否调节上皮炎症促使我们进行相关实验。事实上，我们证明了一个有趣的观察，即miR-26a/b可以改善细胞模型中Th1相关细胞因子的分泌，但其他类型的细胞因子和所有受体除外，而miR-26可以减少肺泡基底上皮细胞中的肿瘤坏死因子α和NF-κB通路。17。由于以往的研究大多关注OLP固有层的炎症反应，而不重视上皮层的炎症反应。1,31,32miR-26a/b在口腔角质形成细胞因子产生中的作用为OLP的发展提供了新的认识。

CD 38是一种在巨噬细胞中识别的炎症标记物，当有lps或IFNγ存在时，CD 38的表达明显增加25。我们采用多种方法揭示CD 38在OLP病中的显著上调，并提示miR-26a/b通过靶向CD 38来对抗炎症。pkcδ抑制剂抑制CD 38活性是很有吸引力的。33，这为miR-26a/b对CD 38表达的调控提供了一种间接的途径。为了检测CD 38在炎症反应中的作用，我们将CD 38质粒转染到HOKs中，并证明诱导了Th1相关细胞因子，而CD 38抑制剂则将其阻断。在这一部分中，一个限制因素是CD 38介导的细胞因子分泌调控的基础尚未被解释，这需要在未来更多的研究。此外，一些研究人员指出，肿瘤坏死因子α等细胞因子对vdr表达有损害。34。因此，口腔角质形成细胞中的细胞因子也可能是VDR降解的靶点。7)，这种反馈规则非常有趣。

示意图概述口腔角质形成细胞miR-26a/b的生物学过程和功能。

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总之，这项调查表明OLP患者减少miR-26a/b。miR-26a/b的降低是由于维生素D/VDR途径在口腔角质形成细胞微环境中的抑制所致，通过靶向PKCδ和CD 38，这些miRNAs的水平越高，抗OLP的效果越好。7)。口腔角质形成细胞miR-26a/b的发现不仅为口腔扁平苔藓的理解提供了新的思路，而且为临床治疗开辟了新的途径。本研究不涉及固有层的研究，因为在OLP治疗中需要进一步的研究以保证miR-26a/b的治疗效率。

人体样本采集

OLP患者和健康参与者均被纳入山西医科大学口腔医院。药物治疗前，采集口腔黏膜标本、血清和唾液进行实验检测。正常的健康样本是从接受保留智齿拔除，没有临床可见的口腔炎症的参与者中获取的。根据经修订的世界卫生组织诊断标准，确定了病人纳入和鉴别扁平苔藓的标准35,36。该项目得到了山西医科大学机构伦理委员会的批准，并得到了所有个人的同意。每组的人体样本数目为14份。健康对照者的临床参数载於补充表格内。1。在先前的研究中提供了更多的OLP患者的信息。6.

动物研究

选用6~8周龄雄性C57BL/6小鼠作为研究对象。VDR-/-小鼠按报告策略生成。37。为建立维生素D缺乏模型，3周龄小鼠断奶后，饲喂维生素D缺乏(维生素D)。3 < 25IU/kg) or vitamin D normal (vitamin D3=1000 IU/kg(如前面所述，为期8周)38。这些老鼠被放置在一个黑暗的房间，以防止他们受到紫外线的照射。在体内给药过程中，用Invivofectamin2.0(Invitrogen，CAT：1377901)试剂盒，经尾静脉静脉注射20 mg/kg miRNAs寡核苷酸，连续2周。本次调查的动物部分得到了山西医科大学附属机构伦理委员会的批准。每组小鼠5只，年龄相近的小鼠随机分为不同组。在对数据进行分析之前，进行实验的人不知道具体样本的身份。

口腔粘膜上皮细胞分离

从人或动物口腔中分离出3 mm×3mm的口腔组织，并分离上皮层。6。简单地说，用0.25%的分散酶Ⅱ(Sigma-Aldrich)消化12 h，然后用肌肉钳直接分离上皮层。

细胞培养

将人口腔角质形成细胞(HOK)(中国北京北方研究所)置于口腔角质形成细胞培养液(OKM，Sciencell，CAT：2611)中进行培养。对小鼠口腔角质形成细胞培养，将分离的上皮细胞切成小块，消化成胰蛋白酶(Invitrogen)，得到单个角质形成细胞。39。用含1%两性霉素B(Sigma-Aldrich)的OKM洗涤和再悬浮后，将角质形成细胞置于重组人1型胶原(Sigma-Aldrich)包被的盘子中。加入培养基，每2天更换一次。第三代角质形成细胞已准备就绪。为了模拟OLP的体外微环境，我们分别建立了两种细胞模型。一种是用LPS(100 ng/ml，Sigma-Aldrich)处理口腔角质形成细胞24 h，以模拟感染所致olp的情况；另一种是用抗CD3/cd 28(bd生物科学)刺激的T细胞上清液以30%的终体积浓度加入细胞板，以模拟炎症所致olp的情况。6。T细胞的分离和刺激按照先前的报道进行。6。在剂量依赖性实验中，hk被LPS(100 ng/ml)或活化的CD4处理。+T细胞(30%终体积浓度)分别作用0、4、8、16、24h。在一些实验中，在36-h vdr质粒转染后(4g)，12-h1，25 vd(20 nm，Sigma-aldrich)或12 h pkcδ/cd 38抑制剂(20 nm，medChemExpress)预处理后，hks被LPS或活化的cd4刺激。+用miR-26a/b模拟物或抑制剂(200 NM)转染口腔角质形成细胞36h后，再转染LPS或活化的CD4。+T细胞产生处理。所有实验重复三次。

质粒构建

VDR质粒由李燕春博士提供。针对pkcδ或CD 38质粒的构建，根据前人的研究，将人pkc基因的编码序列克隆到pcDNA3.1载体中。40,41。为了构建荧光素酶报告质粒，我们合成了pkcδ或cd38cDNA 3‘UTR片段中包含miR-26a/b预测靶位点的50 bp序列，并按照已发表的方法将其亚克隆到prl-tk载体中。42。50 bp序列和突变也被使用。插入的序列如下：

AGGGAAATTGTAAATCCTGTGTTTCATTACTTGAATGTAGTTATCTATTG(PKCδ)；AGGGAAATTGTAAATCCTGTGTTTCATCGACCTGGTGTAGTTATCTATTG(PKCδ突变)；TTGATTTCAGACTGAATACTTGAAAGGACACACACACACATACGTAAGTG(CD 38)；TTGATTTCAGACTGAACGACCTGGAGGACACACACACACATACGTAAGTG(CD 38突变)。

转染试验

利用脂质体2000(Invitrogen)将微RNA寡核苷酸(200 NM)、siRNA寡核苷酸(40 M)和质粒(4g)瞬时转染口腔角质形成细胞。miRNA-26a/b模拟物、miR-26a/b抑制剂和阴性对照者从(Thermo Fisher Science)购买。hVDR-siRNA序列为5‘-CCCCUGGCUGAUCU UGUCAGUUA-3’和5‘-AAUGCUUCACAUAGCAUCC-3’；hPKCδsiRNA序列为5‘-CCAUGUUUAUCGCCACC-3’，hCD 38 siRNA序列为5‘-UUGGCAGCUUCUGUCUUCUCAUCUC-3’。18,40,41.

荧光素酶分析

将PRL-TK-3‘UTR质粒或对照载体转染HOKs 36h，转染后收集细胞裂解物，用双荧光素酶报告系统(Promega，CAT：E 1910)检测荧光素酶活性。

TUNEL和免疫染色试验

TUNEL染色如前面所述进行了调整。6。用10%福尔马林固定口腔组织，然后包埋切开。根据“原位细胞死亡检测试剂盒”(Roche LifeScience，CAT：12156792910)对4微米切片进行处理。免疫染色用抗磷脂蛋白激酶Cδ或抗CD 38抗体在冷室过夜，然后用二次抗体和二氨基联苯胺处理。用显微镜系统观察玻片。

ELISA法

在第1天采集的人血样本被放置在4°C过夜。分离后第2天，血清保存25-羟基维生素D检测使用免疫诊断系统的特殊试剂盒后，手册。用EBioscience ELISA试剂盒检测血清和唾液中肿瘤坏死因子α的浓度。用微板系统测定OD值。

WESTERNBLOTTING

Westernblotting试验是在先前的研究之后进行的。43。细胞和组织用laemmli缓冲液溶解和超声处理。用8%-12%SDS-PAGE对蛋白质进行负载分离，然后转移到PVDF膜上.经1-h5%BSA阻断缓冲液处理后，在4°C下，隔夜与一系列初级抗体共同孵育，然后在25°C下孵育1小时，VDR(Cat：SC-13133)、CD 38(Cat：SC-374650)和β-actin(Cat：SC-47778)抗体分别来自圣克鲁兹。CTDSPL(Cat：17532-1-AP)和CTDSP 1(Cat：10952-1-AP)抗体来自蛋白质技术.CTDSP 2(Cat：ab97463)和PKCδ(Cat：ab182126)来自ABCAM。磷脂激酶Cδ(Tyr 311，CAT：2055)，caspase 3(Cat：9664)，Caspase 9(Cat：9505，9509)和切割PARP(Cat：5625，94885)均来自细胞信号转导。细胞色素c(CAT：MA5-11674)和bax(猫：MA5-14003)抗体来自Invitrogen。用ECL westernblot底物检测印迹。选择ΒETA-actin作为加载对照.

共免疫沉淀

用免疫沉淀裂解缓冲液收集口腔角质形成细胞裂解液，用抗PKCδ抗体进行免疫沉淀。用凝胶电泳法对所得沉淀进行分析。

细胞分馏

Bax和细胞色素c经转位检测，将口腔角质形成细胞分为胞浆和膜结合的细胞器组分，进行免疫印迹分析。在RT条件下，细胞在含0.05%洋地黄素的等渗缓冲液中孵育2 min.将混合物中的可溶部分保存为胞浆组分，再将残留的不溶性物质溶于2%SDS中，收集膜结合有机组分。

RNA的提取与实时PCR

分别用Trizol试剂(Invitrogen，CAT：15596026)和miRNA分离试剂盒(QIAGEN，CAT：217004)从HOKs或参与者中分离出总RNA或miRNAs。分别用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，CAT：RR037B)或特异性miRNA第一链cDNA合成试剂盒(Aidlab生物技术，CAT：PC 4801)进行mRNA或miRNA的第一链cDNA合成。实时PCRS用SYBR预混快递试剂盒(Takara，CAT：RR420L)或miRNA实时PCR检测试剂盒(Aidlab BioTechnologies，CAT：PC 4901)完成。mRNAs转录本的相对量用该方法计算。-ΔΔCT公式。以GADPH和U6为内对照，分别进行mRNA检测和miRNA检测。循环miRNA样品，在提取miRNA前加入相同量的外源细胞-miR-39，作为正常化。PCR引物在补充表中显示2.

caspase-3活性测定

caspase-3活性的测定如前所述。6。将口腔角质形成细胞用溶解缓冲液溶解10 min。离心后取上清液作为细胞裂解液。用caspase底物ac-DEVD-AFC(Bio Vision)检测裂解液的caspase-3活性，并在X 360/EM 530平板阅读器上进行分析。

染色质免疫沉淀(芯片)试验

芯片按照前面描述的方式执行，并作了一些修改。42,43。转染VDR或对照质粒后，用1%甲醛固定HOKs，用甘氨酸中和。收集细胞裂解液，经超声剪切层析，得到400~500 bp的片段。40微米剪切样品作为输入。其余样品用BSA和蛋白A琼脂糖珠纯化2h，加入4微克的VDR或对照IgG抗体，结合和拉出碎裂的染色质。经过一夜孵化后，蛋白A琼脂糖珠被处理以沉淀抗体。沉淀和剪切后的DNA样品用一组洗涤液洗脱纯化，然后用实时PCR对IP和输入样品进行定量。作为内部控制的输入。补充表中提供了实时PCR的引物。2.

生物信息学分析

TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/)对miR-26a/b.ucsc数据库(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/选择hgGateway)搜索启动子区域进行结合位点分析。

统计分析

数据以均值±SD表示。这些差异在统计学比较的各组间是相似的。这些数据符合测试的假设。学生的t两组差异分析采用方差分析，多组间差异有显着性。邓恩的多重比较用于单因素方差分析，费舍尔的最小显着性差异是双向方差。P < 0.05 was considered to be significant.