MicroRNA-27a / b是小的非编码RNA，据报道可调节炎症反应和细胞增殖。尽管一些研究表明，口腔扁平苔藓（OLP）患者的口腔标本中miR-27b被下调，但miR-27b减少的分子机制仍然是一个谜，而且miR-27a在OLP中的表达没有很好的探索。在这里，我们证明与健康对照组相比，miR-27a和miR-27b在从OLP患者获得的口腔活检，血清和唾液样本中均减少了。在脂多糖（LPS）或活化的CD4 + T细胞治疗的人口腔角质形成细胞（HOKs）中也证实了miR-27a / b的降低。此外，我们在miR-27a / b的启动子中发现了维生素D受体（VDR）结合位点基因并验证了这一发现。我们还测试了经paricalcitol治疗的维生素D缺乏或VDR基因敲除小鼠的口腔上皮中的miR-27a / b水平。在救援实验中，我们证实了维生素D和VDR抑制了HOKs中LPS或活化的CD4 + T细胞诱导的miR-27a / b降低。总之，我们的结果表明维生素D / VDR信号在口腔扁平苔藓中诱导miR-27a / b。

口腔扁平苔藓，看作是一种慢性粘膜皮肤炎性病症，被认为是在一个共同的共识潜在恶性疾病之一1。它影响约2％的成年人口，女性患病率更高2。尽管已经进行了大量研究并取得了很大进展，但是OLP的发病机理仍然是一个谜。很明显，自身免疫反应，感染，精神压力都有助于OLP萌生和发展3，4。在临床中，即使在进食过程中，患有OLP的患者也经常出现疼痛，刺激和烧灼感等症状3。OLP的组织病理学特征包括固有层中典型的T细胞浸润带。角化过度，上皮层细胞样体和水样变化3。到目前为止，OLP似乎是无法治愈的疾病，大多数临床工作都集中在炎症控制和症状减轻3上。因此，迫切需要研究OLP的发病机理并寻找治愈的方法。

微小RNA（miRNA）是一组小的非编码RNA，通过与它们的3'UTR相互作用5抑制目标mRNA的表达。在已发表的研究中，miRNA被报道发挥炎症，代谢和发育的生物学功能的6，7，8，9，10，11。在OLP领域，许多研究都把种miRNA作为生物标志物的疾病进展和恶变12，13。蜂窝的miRNA-27在整个各种组织和细胞类型的无所不在表达并且是高度保守的14，15。迄今为止中，miR-27的功能研究大多集中在免疫系统和细胞增殖在10，11，14，15，16，17。一对夫妇的研究，在OLP患者口腔活检在OLP的情况下，的miR-27B据报道，下调2，18。然而，miR-27a在OLP中的表达尚不清楚，并且对miR-27a / b减少的机制也没有很好的解释。鉴于此，在OLP中使用miR-27a / b将有助于我们更好地了解OLP的原因。

维生素D是一种多效激素，在广泛的生物学活动中起着至关重要的作用19。在肾脏中合成的维生素D的活性形式称为1,25-二羟基维生素D [1,25（OH）2 D 3 ] 20。1,25（OH）2 D 3通过与维生素D受体（VDR）21相互作用来发挥其调节作用。维生素D / VDR信号被证实在炎症性疾病中具有调节功能22。我们已经报道维生素d / VDR信令在从OLP患者的口腔活检或血清样品抑制23，24。此外，先前的研究也表明，这种信号抑制的miR-802和缺氧诱导因子1α（HIF-1α），以改善细胞凋亡和在HOKs炎症反应25，26，这表明OLP其保护作用。在这项研究中，我们证实miR-27a / b在OLP患者的口腔活检，血清和唾液样本中被下调，并且维生素D / VDR信号传导可以诱导OLP中miR-27a / b的表达。

人体样本

在山西医科大学附属口腔医院，从健康个体和OLP患者那里采集颊黏膜活检，血液和唾液样本。参加者保留智齿拔出而无任何可见的颊部炎症被分类为健康对照。OLP鉴定和入选标准的基础上修改的世界卫生组织（WHO）的诊断标准设置27，28。参与本研究的所有参与者均签署了书面知情同意书。该调查得到山西医科大学伦理委员会的批准。所有方法均按照相关指南和规定执行。在先前的研究中提供了有关OLP患者的更多信息23。

动物研究

通过实验选择了具有野生型背景的8周龄C57BL / 6小鼠。通过腹膜内注射每天向野生型小鼠施用维生素D类似物paricalcitol（300 ng / kg），持续一周。对于建立维生素D缺乏症模型，如断奶前所述，将小鼠在断奶后立即置于黑暗的房间中，并喂食缺乏维生素D或正常饮食的食物，持续8周，如29所述。VDR-/-小鼠是根据先前方法30生成的。收集来自小鼠的口腔上皮细胞以分离蛋白质和miRNA。动物研究的所有方案均已获得山西医科大学伦理委员会的批准。所有方法均按照相关指南和规定执行。

细胞培养

将人口腔角质形成细胞（HOK）置于6孔板中，并与含有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的口腔角质形成细胞培养基一起培养。两种细胞模型用于体外模拟OLP 。首先，HOS受到LPS（100 ng / ml）的挑战。第二，将来自T细胞培养的上清液（以抗CD3 / 28刺激）以30％的最终体积浓度25添加到HOKs培养基中。对于随时间变化的实验，LPS或活化的CD4 +T细胞分别持续0、4、8、12、24小时。对于其余的细胞模型，除非另有说明，否则将HOK攻击24小时。在另一个实验中，在LPS或活化的CD4 + T细胞处理之前，将HOKs用VDR或对照质粒（4 µg）转染36小时，或用1,25（OH）2 D 3（20 nM）预处理12小时。VDR或空质粒被Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）转染。如之前25所述进行T细胞的分离和刺激。

口腔粘膜上皮分离

将人和小鼠的口腔颊组织在冷室中用0.25％的dispase II消化12小时。据报道31使用肌肉钳完成上皮和固有层的分离。

免疫印迹

如先前所述使用Western blot分析32。简而言之，将细胞或组织用laemmli缓冲液溶解，然后在95°C下孵育5分钟。全细胞裂解物通过SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到PVDF膜上。第一抗体用于在冷室中孵育膜过夜，然后在室温下进行一小时的第二抗体处理。使用ECL试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对条带进行可视化。VDR（sc-13133）和β-actin（sc-47778）抗体均来自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。

实时PCR

用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从HOK或口腔颊上皮中提取总RNA，并纯化mRNA。第一链cDNA使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa，Mountain View，CA）合成，实时PCR使用SYBR Premix Ex Kit（TaKaRa）进行。使用miRNA分离试剂盒（Life Technologies）分离组织和细胞中的miRNA，并根据制造商的说明使用mirVana PARIS试剂盒（Life Technologies）获得血清和唾液中循环的miRNA。相应地，使用特定的miRNA第一链cDNA合成试剂盒（Aidlab Biotechnologies，北京）来完成cDNA合成和实时PCR。转录物的相对量通过2- ΔΔCt进行分析式。对于循环miRNA样品，在提取miRNA之前添加了相同量的外源cel-miR-39，并将其标准化。PCR引物的序列示于表   1。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

根据制造说明书，使用商业试剂盒进行ChIP测定。简而言之，将用VDR或空质粒转染的HOK细胞固定在1％甲醛中，然后用甘氨酸处理以进行中和。将细胞裂解液超声处理，并借助抗体（VDR或IgG）和蛋白A琼脂糖沉淀。洗脱和一系列洗涤后，通过qPCR定量样品。表1中提供了用于ChIP测定的引物   。

统计分析

数据显示为平均值±SD。使用2尾Student t检验分析2 组数据，并通过单因素方差分析分析多组数据。P  <0.05被认为具有统计学意义。

miR-27a / b在OLP患者和OLP模型中下调

以前的研究已经证明了miR-27b中示出了OLP患者口服活检一个显著减少2，12，18。为了确认miR-27b的表达并利用OLP中的miR-27a，我们收集了个体的口腔上皮，血液和唾液样本以研究miR-27a / b的水平。如图1所示，在   OLP患者的口腔活检组织的上皮层中miR-27a / b降低（图   1a，b）。此外，OLP组的循环miR-27a / b血清水平低于健康对照组（图   1c，d），唾液样本中的水平也是如此（图   1e，f）。由于自身免疫反应和感染都能够诱导OLP，因此可以更好地模仿它在体外，我们用LPS或活化的CD4 + T细胞上清液处理了HOK，以建立OLP模型。不出所料，在两个细胞模型中，miR-27a / b均呈时间依赖性下调（图   2a–d）。在存在LPS或活化的CD4 + T细胞上清液的情况下，被选作阳性对照的TNFα，IL-6和IFNγ也有所增强（补充图   1a–f）。重要的是，LPS或活化的CD4 + T细胞上清液对用于阴性对照的miR-16没有影响（补充图   2a，b）。

OLP患者的miR-27a / b水平下调。（a，b）通过qPCR测量的人口腔上皮细胞中的miR-27a（a）和miR-27b（b）的水平。（c，d）通过qPCR监测的miR-27a（c）和miR-27b（d）在人血清中的表达。通过实时PCR检测的人类唾液中的（e，f）miR-27a（e）和miR-27b（f）状态。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001与相应的健康对照组相比; n = 14。

全尺寸图片

在LPS或活化的CD4 + T细胞处理的HOKs中，miR-27a / b的水平降低。（a和b）通过qPCR在所示的不同时间点确定的活化CD4 + T细胞处理的HOKs中的miR-27a（a）和miR-27b（b）水平。（c，d）用时程依赖性LPS治疗的HOK 中miR-27a（c）和miR-27b（d）水平的实时PCR定量。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 n = 3。

全尺寸图片

VDR与其在miR-27a / b启动子中的元件结合，以增强其在HOK中的表达

为了确定miR-27a / b在OLP中降低的机制，我们检查了miR-27a / b的启动子，在其中我们发现了VDR元件（VDRE）（图   3a）。看来在miR-27a的启动子中有3个推定的VDR结合位点（1-3）（补充图   3a），但是我们的ChIP数据显示，只有VDRE-2和VDRE-3构成了VDR的真实结合位点（图   3b和补充图   3c）。此外，与用空质粒转染的HOKs的温和增加相比，VDR的过表达大大增强了VDR和VDRE的组合（补充图   3d，e）。而且，miR-27b的启动子中有一个VDRE（补充图   3b），其通过ChIP测定法在用或不用VDR质粒转染的HOK中证实（图   3c和补充图   3f）。为了进一步验证VDR在miR-27a / b诱导中的作用，我们将VDR质粒转染到了HOKs中并测试了miR-27a / b诱导。如图3所示，   在存在VDR质粒的情况下，miR-27a / b水平高度增加（图   3d）。Hsa-let-7a-2，VDRE 研究的阳性对照33，在VDR过表达后在HOK中也显示出较高的表达（补充图   3g）。SNAP25和TXN2是miR-27a / b 14的两个靶基因，接下来我们尝试探索它们的表达方式。伴随miR-27a / b的增加，VDR过表达下调了SNAP25和TXN2的水平（补充图   3h）。据报道，维生素D可激活大多数细胞中的VDR以发挥其生物学功能21。为此，在这项研究中，我们向HOKs培养基中添加了1,25（OH）2 D 3。如图所示，维生素D轻微上调了miR-27a / b的状态（图   3e）。据报道，含溴结构域蛋白9（iBRD9）的药理学抑制作用增强了VDR的生物学功能[ 34]，我们的数据表明iBRD9促进了维生素D的表达，从而增加了miR-27a / b的表达（图   3e）。

维生素D和VDR促进HOKs中miR-27a / b的表达。（a）miR-27a / b启动子中VDR结合位点的示意图。（b）ChIP分析表明，在IgG或VDR抗体沉淀后，在用VDR质粒转染的HOK 中，miR-27a中的VDR结合位点上调。站点1-3分别表示VDRE 1-3。条形图显示对数变化2倍，每个位点n = 3。（c）ChIP分析表明在IgG或VDR抗体处理后，用VDR质粒转染的HOK 中miR-27b中VDR结合位点的上调。条形图显示原木的2倍变化，该位置n = 3。（d）实时荧光定量PCR检测含或不含VDR质粒的HOKs中miR-27a / b的水平。（e）采用指示的不同处理方法实时定量检测HOKs中的miR-27a / b。** P <0.01，*** P <0.001 vs. n =3。Ctrl，控制；1,25VD，1,25（OH）2 D 3。

全尺寸图片

维生素D / VDR信号调节小鼠口腔上皮细胞中miR-27a / b的表达

为了进一步检测维生素D / VDR信号传导对miR-27a / b 体内的影响，我们用paricalcitol处理了C57BL / 6小鼠。伴随着VDR表达的增加，口腔上皮细胞中的miR-27a / b水平被上调（图   4a，b）。相反，维生素D缺乏或VDR敲除小鼠的口腔上皮miR-27a / b的表达下调，表明VDR降低或VDR缺失（图   4c-f）。这些结果提供了在体内 miR-27a / b上介导维生素D / VDR信号的证据。

miR-27a / b的表达是由体内的维生素D和VDR介导的。（a，b）分别通过western印迹和qPCR在经帕立骨化醇处理的小鼠中测量口腔上皮细胞的VDR表达（a）和miR-27a / b水平（b）。（c，d）蛋白质印迹和qPCR显示维生素D缺乏症小鼠的口腔上皮的VDR（c）和miR-27a / b（d）状态。（ê，˚F）Western印迹和qPCR显示VDR表达式（ë）和miR-27A / B水平（˚F在口腔上皮层）VDR淘汰赛小鼠。与相应的对照或WT相比，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001；n =5。Ctrl，控制；pari，paricalcitol; VDRKO，VDR淘汰赛；VD-D，维生素D缺乏症；WT，野生型。

全尺寸图片

维生素D / VDR信号的抑制导致miR-27a / b的OLP降低

在OLP患者我们以前的研究表明，VDR的状态在活检和维生素d血清是下调23，24，其表示的miR-27a的原因/ B在OLP降低可能是，至少部分地由于维生素D / VDR信号抑制。与关于人类样品的结果一致，我们在两种细胞模型中测试了VDR表达，发现在用LPS或活化的CD4 + T细胞治疗的HOK中，它们的水平受到了损害（图   5a-d）。因此，在从OLP患者和对照组获得的口腔上皮细胞中，观察到VDR与miR-27a / b之间呈正相关（图   6a，b [ r  = 0.7681，P = 0.0236，针对miR-27a的Spearman关联检验]和[ r  = 0.7282，P  = 0.0417，针对miR-27b的Spearman关联检验]）以及参与者血清中的25（OH）D和miR-27a / b也显示良好相关性（图   6c，d [ r  = 0.6605，P  = 2.78×10 -11，针对miR-27a的Spearman相关检验]和[ r  = 0.7305，P  = 2.80×10 -11，针对miR-27b的Spearman相关检验] ）。

VDR水平在OLP单元模型中显示出显着降低。（a和b）通过qPCR或Western印迹测试，在有或没有活化CD4 + T细胞的情况下，HOKs中的VDR mRNA（a）或蛋白质（b）水平。（c，d）通过qPCR或蛋白质印迹检测到的LPS处理存在或不存在时，HOKs中的VDR mRNA（c）或蛋白（d）水平。* P <0.05，** P <0.01 vs. n =3。Ctrl，控制。

全尺寸图片

维生素D / VDR和miR-27a / b在OLP患者和健康对照组中显示出良好的正相关。（a，b）来自OLP患者和健康对照组的人口腔上皮细胞中VDR和miR-27a（a）/ miR-27b（b） 的相关性（r  = 0.7681，P = 0.0236，Spearman的miR-27a相关检验; r  = 0.7282，P  = 0.0417，miR-27b的Spearman相关检验，n =14。（c，d）人血清中25（OH）D与miR-27a（c）/ miR-27b（d）的相关性来自OLP患者和健康对照者（r  = 0.6605，P = 2.78×10 -11，用于miR-27a的Spearman相关检验；r  = 0.7305，P  = 2.80×10 -11，针对miR-27b）的Spearman相关检验，n = 14。

全尺寸图片

如果维生素D / VDR信号的抑制导致OLP中miR-27a / b降低，我们假设维生素D或VDR治疗可能会挽救他们。为了研究这个假设，我们在LPS或激活的CD4 + T细胞攻击之前用维生素D或VDR质粒预处理了HOK 。如图所示，在HOKs中存在活化的CD4 + T细胞或LPS 的情况下，VDR质粒转染逆转的miR-27a / b减少（图7a，b），而1,25（OH）2 D 3预处理也是如此（图   7b）。   7c，d）。此外，VDR过表达还改善了细胞培养基中miR-27a / b的减少（补充图   4a，b）。相应地，维生素D / VDR信号通过LPS或活化的CD4 + T细胞治疗减弱了霍克氏综合征中TNFα的产生（补充图   4c-f）。总之，这些数据表明维生素D / VDR信号传导阻滞是miR-27a / b降低OLP的原因之一。

维生素D和VDR在OLP细胞模型中增加miR-27a / b。（a，b）实时PCR显示，在有或没有VDR质粒转染的情况下，用活化的CD4 + T细胞（a）或LPS（b）处理的HOK中miR-27a / b的水平，如所示。（c，d）实时PCR，表明在存在或不存在1,25 VD的情况下，用活化的CD4 + T细胞（c）或LPS（d）处理的HOK中miR-27a / b表达。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 ＃ P <0.05，## p <0.01，###与CD3 / 28或LPS组相比，P <0.001；n =3。Ctrl，控制；1,25VD，1,25（OH）2 D 3。

全尺寸图片

在这项研究中，我们收集了来自OLP患者和健康参与者的口腔活检，血清和唾液样本以检测miR-27a / b的表达。与健康对照相比，在来自OLP患者的三种类型的样品中，miR-27a / b水平一直受到损害。从OLP患者的口腔活组织检查这些发现与以前的笔记一致了miR-27B是下调2，18。重要的是，我们通过LPS处理来模拟HOK感染条件或采用活化的CD4 +，进一步研究了OLP细胞模型中miR-27a / b的状态。T细胞上清液可模拟自身免疫反应的微环境。与在人类样品中发现的观察结果一致，miR-27a / b水平在两种细胞模型中均显示出强劲的下降，这为我们的发现提供了令人信服的证据。

体内miR-27a和miR-27b的主要生物学活性已证明与免疫应答，细胞增殖和发育有关。在HeLa细胞中，miR-27靶向SNAP25和TXN2以阻断腺病毒感染14。先前的报告已经通过调节T细胞功能和细胞因子生产声称的miR-27禁止显示炎性应答10，15。相反，miR-27过表达具有损害Treg分化的能力17。对于细胞增殖，的miR-27被证实促进骨肉瘤细胞的生长和加速软骨分化16，35，而另一些研究鉴定的miR-27在肾细胞癌肿瘤抑制36。这些不一致的观察结果导致人们对miR-27的功能尚不清楚。在OLP领域，一些研究表明miR-27b靶向PLK2以促进口腔角质形成细胞增殖 37。由于炎症条件，在OLP的情况下，miR-27a / b的功能可能很大程度上参与了免疫反应。该假设需要在我们的后续项目中进行进一步研究。在这里，我们专注于减少OLP中miR-27a / b的机制。

我们最近的数据已经表明，维生素d / VDR信号传导通过抑制细胞因子分泌和细胞凋亡在口腔角质形成细胞在OLP保护作用25，26。在当前的研究中，我们将VDR结合位点定位在miR-27a / b的启动子区域，这意味着维生素D / VDR信号传导具有诱导miR-27a / b表达的潜力。然后，我们进行了ChIP分析，以确认VDR通过与VDRE结合来增强miR-27a / b转录本。此外，VDR质粒转染，但不转染1,25（OH）2 D 3处理后，HOKs中的miR-27a / b产量大大提高，表明VDR在维生素D / VDR信号传导中起主要作用。这种看法是一致的与以前的报告，其中需要注意的是VDR是β细胞存活，基质重新编程和肝纤维化的关键调制器34，38，39。由于一些研究已经报道了维生素D的生物学功能在几个领域都受到限制40，我们建议应更多地关注VDR本身而不是维生素D激素。维生素D / VDR信号传导是否调控小鼠miR-27a / b转录本？为了回答这个问题，我们建立了三种模型。我们的数据表明，维生素D处理可提高小鼠口腔上皮细胞中miR-27a / b的表达，而维生素D缺乏或VDR缺失会降低它们。这些细胞系和小鼠数据共同确定了口服上皮维生素D / VDR信号传导在miR-27a / b表达介导中的关键作用。

我们已经证明，口腔上皮的VDR水平约50％下调和25（OH）d的血清显示状态在OLP患者> 50％减少早期探索23，24。与人类数据一致，我们进一步显示OLP细胞模型的VDR降低了约50％。根据这些结果，我们得出的结论是维生素D / VDR信号抑制可导致OLP中miR-27a / b降低。重要的是，在OLP患者的口腔标本或血清中发现VDR / 25（OH）D与miR-27a / b之间具有良好的正相关。由于缺乏完善的OLP动物模型，我们无法在小鼠患病条件下调查VDR和miR-27a / b的相关性。

维生素d或VDR表达已经被证明可以阻止核因子κB（NF-κB）途径或通过诱导希佩尔-林道（VHL）执行OLP的口腔上皮其监管职能25，26。在这项工作中，我们发现VLP质粒转染或维生素D处理可减弱LPS或活化的CD4 + T细胞上清液诱导的miR-27a / b在OLP细胞模型中减少，提示维生素D / VDR信号传导可控制miR- 27a / b表达可在OLP中发挥其生理作用，并扩展维生素D / VDR信号的调控网络。

总之，这项工作表明维生素D / VDR信号可以促进OLP中miR-27a / b的表达。与VDRE结合后，维生素D促进VDR改善口腔上皮细胞中的miR-27a / b转录本。因此，OLR的miR-27a / b降低可能至少部分归因于维生素D / VDR信号转导抑制。尽管已经阐明了miR-27a / b减少的机制，但是miR-27a / b在OLP发育中的作用仍然需要进一步研究，以更好地了解这种疾病的病因。