胺氧化酶3是腹膜子宫内膜异位病变中氧化应激的新型促炎标记

二维码

发表时间：2020-01-21 16:34作者：武汉新启迪Xinqidibio来源：www.qidibio.com

胺氧化酶3是腹膜子宫内膜异位病变中氧化应激的新型促炎标记

摘要

子宫内膜异位症是育龄妇女的一种常见妇科疾病，据认为是由于月经倒退和子宫内膜组织植入所致，主要是进入腹膜腔。该疾病的特征是慢性，未解决的炎症过程，从而导致子宫内膜异位症的主要症状即疼痛。有人认为，高活性氧（ROS）和氧化应激是子宫内膜异位症发病机制中的因素。我们在这里进行系统的研究，以发现与异位腹膜病变中的氧化应激有关的新机制和途径。使用蛋白质组学和转录组学方法相结合，我们确定了新的靶标，包括上调的前氧化酶，例如胺氧化酶3 /血管粘附蛋白1（AOC3 / VAP1）以及下调的保护因子，特别是烯醛还原酶PTGR1和蛋氨酸亚砜还原酶。与改变的ROS景观相一致，我们观察到异位病变中的血红蛋白/铁超载，ROS产生和脂质过氧化。ROS衍生的4-羟基-2-壬烯醛诱导的白细胞介素IL-8从单核细胞释放。值得注意的是，AOC3抑制剂在炎性疼痛模型中具有镇痛作用在体内，提示潜在的翻译适用性。

介绍

子宫内膜异位症，影响育龄妇女的5-10％，是妇科疾病，其特征异位的子宫内膜组织的存在最常在盆腔发现1，2。逆行月经是被广泛接受的致病机制，为形成腹膜病变，其中子宫上皮和基质细胞在月经期间通过输卵管播散并植入到腹膜腔3，4。腹膜病变根据颜色进行宏观分类，表现为白色，红色，棕色或黑色病变。这种外观似乎是由子宫内膜腺体含量和邻近的基质反应决定的，可能反映了慢性过程而不是疾病活动水平的不同5。附加贡献者疾病如遗传，后生因素和环境因素的存在，因为妇女的大多数（90％）经历与月经碎片成功间隙从腹膜腔相关联的逆行月经3，6，7，8，9。然而，子宫内膜异位病变的形成是一个签名事件，导致疾病的标志，包括持续的炎症，严重的和慢性疼痛，以及低生育力10，11。

异位子宫内膜和异位病变对雌激素水平的依赖性导致异位病变的循环生长，脱落和出血，进而引起炎症反应，其特征在于免疫细胞浸润并伴有促炎性细胞因子谱8。由于病灶出血，铁超负荷已在腹膜腔的不同部位进行了描述，例如腹膜液（PF），子宫内膜异位病灶，腹膜以及浸润的单核细胞和巨噬细胞12。因此，铁含量的增加和血红素分解代谢的增加可能会促进氧化应激，这被认为在子宫内膜异位症的病理生理中起关键作用13。确实，在卵巢子宫内膜异位症组织的基质和子宫内膜异位症患者的PF中，氧化应激会导致脂质过氧化产物（LPP）（例如4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）和丙二醛（MDA））14，15，16，17。

此外，研究提出了子宫内膜异位症中炎症引起的氧化应激和疼痛之间的联系，这表明免疫调节失调。通过刺激巨噬细胞产生的细胞因子增加浓度已报道在子宫内膜异位症的患者8，18。这种炎性状态可以刺激神经纤维的生长和活化，从而导致疼痛途径的额外活化19。

子宫内膜异位病灶的巨噬细胞浸润可能参与骨盆疼痛和炎症与子宫内膜异位症相关的8，18。在引起疼痛的一系列事件的背景下，未能对LPP解毒可能会增强子宫内膜异位症患者的疼痛感。例如，LPP解毒酶如醛脱氢酶2（ALDH2）可能可能从氧化应激下从过氧化脂质产生的内源性损坏LPPS屏蔽生物体20，21，22。描述亚洲人ALDH2多态性的流行病学证据间接支持了这一点，指出ALDH2在疼痛患病率和疼痛耐受性，阈值或强度中的潜在作用23，24，25。此外，炎症和氧化应激的持续循环促进异位子宫内膜 26的植入，支持氧化应激在子宫内膜异位症发病机理中的核心作用。类似于恶性肿瘤的生长，异位病变的新血管形成是成功植入子宫内膜细胞的先决条件，并且通过诸如由基质和浸润性免疫细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）等因素来实现 27。

蛋白质组学方法已被用于识别可能的生物标志物与子宫内膜异位症病理相关，主要是在血清或PF 2，28，29。除了关键的细胞因子和生长因子（如白介素IL-1β，IL-6，IL-10或VEGF）外，这些研究还发现了氧化应激指标的改变，例如对氧磷酶，超氧化物歧化酶（SOD），硫氧还蛋白结合蛋白和其他30再次证明氧化应激是疾病的标志。现在，我们对子宫内膜异位症靶标发现的兴趣促使我们采取了系统的蛋白质组学方法，并进一步获得了转录组学的支持，以更深入地确定潜在的潜在上调氧化应激的潜在原因及其可能的后果。

结果

异位病变中的氧化蛋白修饰增加

对已确认子宫内膜异位的患者（图1A，B）的配对组织活检（异位子宫内膜，异位病变）进行a弹枪蛋白质组学分析，鉴定出2307种蛋白质。为了进一步验证结果，研究中包括了来自对照患者的子宫内膜异位症（已确认为非子宫内膜异位症诊断）。主成分分析（PCA）显示，异位样品与异位样品的聚集方式不同，而与对照和疾病队列无关（图 1C）。子宫内膜异位症患者的正常子宫内膜与正常子宫内膜之间没有差异，这表明子宫内膜的植入和病变的发展导致蛋白质组的显着改变。

我们首先研究了由于ROS引起的病变和在位子宫内膜中氧化蛋白修饰的可能差异。肽谱匹配数据的分析显示，异位病变蛋白的氧化修饰水平较高（图 1D））。在子宫内膜异位症患者的异位样本中，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，精氨酸和酪氨酸残基的氧化修饰水平显着较高（p <0.001）。尽管无统计学意义（p> 0.05），但与对照组相比，氧化的蛋氨酸残基在子宫内膜异位症样品中也表现出较高的水平（异位>异位）。组氨酸，色氨酸和半胱氨酸修饰水平显示异位病变和对照之间无显着差异，异位病变和对照中组氨酸，色氨酸和半胱氨酸的氧化和甲酰化水平通常较低。

脂质过氧化产物4-HNE存在于异位病变中，并诱导单核细胞分泌IL-8

使用蛋白质印迹法，在子宫内膜异位症患者的腹膜液中观察到更高水平的ROS介导的蛋白质加合物（4-HNE加合物）（图 2A）。这些4-HNE修饰在异位病变中也很普遍（图 2B）。为了研究ROS修饰对免疫细胞的功能后果，我们使用了人单核细胞系THP-1。当在有或没有血清的情况下用4-HNE处理时，4-HNE加合物的剂量依赖性增加是明显的（图 2C）。这种4-HNE处理还会导致细胞因子发生变化，刺激后在培养上清液中测量到这种变化（图 2D）。）。除了在长时间孵育（24小时）中4-HNE浓度较高（10μM）的IL-1β之外，与载体处理细胞的基础水平相比，分泌的IL-1β，IL-6或TNFα的水平仅略有变化，在4和24小时内以中等浓度（2μM）或高浓度（10μM）的4-HNE 相反，IL-8分泌表现出强大且显着的剂量依赖性反应，在人外周血单核细胞（PBMC）中也观察到（图2E），这表明IL-8分泌增加是4-HNE暴露于体内的生理反应。单核细胞。THP-1细胞暴露于4-HNE不仅增加了蛋白质加合物的形成，而且还以剂量依赖的方式使细胞死亡（SI图 1），其中10μM的4-HNE（如上文详述的实验中所用）似乎是在血清阳性和阴性条件下不会引起过度细胞死亡的最大剂量。重要的是，我们观察到在月经期，与黄体期和卵泡期相比，对照患者的IL-8水平下降，而子宫内膜异位患者的趋化因子水平仍显着升高（图 2F）。尽管在本研究的这一特定分支中未检测到ROS水平，但该观察结果提示子宫内膜异位症存在潜在的病理生理机制，并且总体上证实了先前观察到的子宫内膜异位症中IL-8水平升高的现象31。

氧化应激和保护性代谢途径的失衡是子宫内膜异位病变的标志

蛋白质组学分析鉴定出2307个蛋白质的错误发现率（FDR）为1％（SI数据 1）。我们使用配对的Student t检验鉴定了581种蛋白质，这些蛋白质在异位病变和异位子宫内膜之间的丰度上存在显着差异（图 3A，B，SI数据 1）。这些蛋白质显着富集的生物学类别包括轴突指导，细胞外基质组织，免疫系统和代谢途径，例如谷胱甘肽（GSH）偶联。对损伤中后一种途径的鉴定使我们进一步研究了与ROS产生和脂质过氧化途径有关的代谢蛋白（图 3C）。我们在蛋白质组学数据集中确定了27种蛋白质（图 3D）与这些途径有关。尽管并非所有蛋白质在此数据集中都达到了严格的统计学意义，可能是由于样品数量有限所致，但数据表明，与匹配的对照相比，病变中涉及ROS或脂质过氧化和细胞死亡的许多代谢蛋白质受到不同的调节。在病变中上调的代谢蛋白中，乙醇脱氢酶1（ADH1），醌氧化还原酶2（NQO2），超氧化物歧化酶3（SOD3）和谷胱甘肽S转移酶μ3（GSTM3）参与异种生物醇，ROS及其衍生的活性羰基化合物的解毒例如羟基烯烃（例如4.HNE）或MDA。相反，几种氧化应激相关的酶和因子在皮损中的表达水平较低。这些包括对氧磷酶（PON）等酶，醛还原酶PTGR1，参与硫醇和谷胱甘肽代谢的酶，例如谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLC），谷胱甘肽合成酶（GSS），谷胱甘肽S转移酶（GSTO和GSTP1），过氧化物酶（PRDX2），α血红蛋白还原酶稳定蛋白（BLVRB），次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT1），凋亡诱导因子线粒体1（AIFM1），FAM213和含4的乙二醛酶结构域（GLOD4）。特别令人感兴趣的是鉴定上调的铜依赖性胺氧化酶AOC3（也称为脉管粘附蛋白1，VAP-1），该酶催化伯胺的氧化脱氨反应，产生相应的醛，过氧化氢和铵盐。谷胱甘肽S转移酶（GSTO和GSTP1），过氧化物酶（PRDX2），α血红蛋白稳定蛋白（AHSP），biliverdin还原酶（BLVRB），次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT1），凋亡诱导因子线粒体1（AIFM1），含FAM213结构域和g （GLOD4）。特别令人感兴趣的是鉴定上调的铜依赖性胺氧化酶AOC3（也称为脉管粘附蛋白1，VAP-1），该酶催化伯胺的氧化脱氨反应，产生相应的醛，过氧化氢和铵盐。谷胱甘肽S转移酶（GSTO和GSTP1），过氧化物酶（PRDX2），α血红蛋白稳定蛋白（AHSP），biliverdin还原酶（BLVRB），次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT1），凋亡诱导因子线粒体1（AIFM1），含FAM213结构域和g （GLOD4）。特别令人感兴趣的是鉴定上调的铜依赖性胺氧化酶AOC3（也称为脉管粘附蛋白1，VAP-1），该酶催化伯胺的氧化脱氨反应，产生相应的醛，过氧化氢和铵盐。FAM213和包含4的乙二醛酶结构域（GLOD4）。特别令人感兴趣的是鉴定上调的铜依赖性胺氧化酶AOC3（也称为脉管粘附蛋白1，VAP-1），该酶催化伯胺的氧化脱氨反应，产生相应的醛，过氧化氢和铵盐。FAM213和包含4的乙二醛酶结构域（GLOD4）。特别令人感兴趣的是鉴定上调的铜依赖性胺氧化酶AOC3（也称为脉管粘附蛋白1，VAP-1），该酶催化伯胺的氧化脱氨反应，产生相应的醛，过氧化氢和铵盐。32，因此可以显着增加病变内ROS和脂质过氧化产物的水平。在蛋白质组的数据集（图标识的另一个新颖上调的蛋白质 2A，B）为1小窝蛋白（CAV1），在质膜小窝脂筏的一个组成部分，先前显示介导成纤维细胞中细胞衰老和IL-6信号 33。尽管信息量很高，但我们假设质谱方法仅提供了一部分氧化应激异常的标志物。因此，有兴趣将蛋白质组学子集与转录组数据集进行比较，该数据集是从对位子宫内膜和异位病变的匹配样本的单独集合中获得的。使用308个基因的候选清单（SI数据 2）被认为参与了通过文献搜索和GLAD4U搜索引擎34确定的脂质过氧化和氧化应激途径，我们分析了来自18个处于不同疾病阶段的子宫内膜异位患者的匹配子宫内膜异位和异位病变样品的RNAseq数据集（SI数据 3）。在RNAseq数据中存在的17673个基因中，所选308个基因中的264个具有表达数据。109（41％）显示出全基因组错误发现率（FDR）校正后的差异值p值<0.05，相比之下，所有17,673个基因的n = 4,897（27％）（图 3E）。在这109个样本中，与异位样本相比，有44个在异位样本中显示出最大的差异表达（<0.5或> 2倍）（图 3E，F）。重要的是，查找属于这些类别（脂质过氧化和氧化应激）的基因证实了ROS的解毒，GSH结合和铁/血红素超载途径在异位病变和异位内膜之间的差异调节（图3G）。例如蛋白质修复，以前在蛋白质组学数据集中尚未发现。值得注意的是，SOD3，GSTM3，AOC3，CAV1，γ-谷氨酰转移酶（GGT）和GCLC等几个基因在转录组和蛋白质组学数据集之间重叠，在这两种方法之间提供了显着的相关性。

异位病变的特征是铁和血红素超负荷增加，髓样浸润，氧化应激，吞噬作用和蛋白质修复

尽管在蛋白质组学数据集中的异位病灶中未发现血红素或铁相关蛋白水平明显失调，但炎症过程的诱因似乎是月经碎片和红细胞来源的血红素和铁的沉积，如前所述12，我们的RNAseq数据也支持。观察到的触珠蛋白（HP），转铁蛋白（TF），细胞血红蛋白（CYGB）和血红素反应性主转录因子BACH2的表达增加，清楚地表明了病变中铁血红素超负荷反应（图 3F，G）。免疫组织化学染色的铁和血红素清除蛋白，如触珠蛋白（图4A），转铁蛋白或BACH2（SI图 2和3）），表明在病变中的表达不限于在原位子宫内膜中看到的腺上皮结构，而是在病变附近的整个基质中发生，表明反应更为普遍。

异位病变的特征在于CD68 +和CD163 +巨噬细胞的浸润（图 4B）。这些吞噬细胞的表达谱显示出特征性和强烈的转录血红素/铁反应，得到腹腔镜子宫内膜异位症患者切除病灶的腹膜巨噬细胞RNAseq数据的支持（图 4C））。在这些巨噬细胞中表达最多的100个转录本中，鉴定出铁蛋白轻链和重链（FTH1，FTL），血红素加氧酶1（HMOX）和血红素清除剂受体CD163的各种转录本。综合起来，IHC和RNAseq分析清楚地表明，铁和血红素超负荷信号以及吞噬反应是异位病变的关键因素。虽然浸润的髓样细胞构成了在异位病变中发现的一部分细胞并有助于氧化应激水平，但似乎ROS的产生和失活，组织修饰和修复机制并不一定限于病变中的特定细胞类型或结构。我们使用免疫组织化学和免疫荧光显微镜研究了参与ROS生成，防御和修复的蛋白质的表达（图。 4D–F，SI图。 2和3）。在蛋白质组学和转录组学研究中鉴定出的氧化前胺氧化酶AOC3在异位病变中表达强烈，在腺上皮或脉管系统周围的表达最高（图 4D）。像烯醛还原酶PTGR1这样的酶参与ROS衍生的LPP（例如4-HNE或MDA 35）的失活，并且在基质和腺体中注意到了它的表达（图 4E）。另一个保护性氧化损伤修复酶，如蛋氨酸亚砜还原酶MSRB3 36（图 4F）仅在异位腺的上皮结构中发现。综上所述，这些实验突出了与ROS产物和加合物的产生和失活有关的蛋白质在病灶内分布的明显差异。

抑制前氧化AOC3会在体内产生镇痛作用

在蛋白质组和转录组实验中对AOC3的鉴定以及在病灶中发现的强免疫反应性，促使我们进一步研究该酶在子宫内膜异位症接种模型中的作用。我们假设抑制AOC3会钝化促炎和促氧化刺激（如病灶接种）的后果，并且我们很想知道这是否会导致镇痛作用。我们在接种子宫内膜异位症模型中使用了先前描述的化合物PXS-4681A 37（图 5A）。使动物接受2 mg / kg BID剂量的抑制剂，其在快速暴露测试中的体外 IC 50 37以上（图 5B）），从腹腔注射子宫穿孔（动物每次12次）之前1小时开始。在第2天，在血浆中测量了过氧化氢的产生，并且作为白色性腺脂肪的靶标参与测试，与媒介物处理的对照相比，显示出全身H 2 O 2含量显着降低（图 5C，D）。此外，在动态负重测定38和饲养时间中，动物的前爪/后爪比率测量的动物表现出与疼痛相关的自发行为减少（图 5F），表明AOC3抑制导致氧化应激和疼痛的减轻。接种模型。

讨论区

针对子宫内膜异位症的病理学特征的研究表明，高水平的ROS会产生氧化应激的恶性循环，进而促进异位子宫内膜的植入26。我们的数据支持先前假设pathomechanistic场景12，13，14，15，16，17，39，由此逆行月经导致子宫内膜的植入在腹膜腔中，而这又产生一个持续的促炎环境11。其特征是通过异位月经增加铁和血红素超负荷，并通过浸润髓样吞噬细胞试图清除。尽管用于本研究的患者群体很小，并且就元数据（如BMI或周期阶段）而言无法进一步分层，这两者都可能影响表型标记，但我们的结果在子宫内膜异位症的病理生理学背景下突出了几个新方面。

首先，结果不仅证实了异位和异位内膜之间ROS和血红素途径的已知差异，而且还显着扩展和鉴定了新的成分，包括促凋亡和蛋白质修复机制。我们显示，几种代谢和氧化应激途径以及ROS /脂质过氧化产物在子宫内膜异位症相对于正常异位组织中受到差异调节和影响。铜依赖性胺氧化酶3作为异位内膜和异位内膜之间的主要区别因素的鉴定表明子宫内膜异位症病理学可能有两种作用。作为胺氧化的副产物，AOC3产生过氧化氢，可直接增加ROS水平。此外，酶32的粘附特性促进内皮白细胞粘附和转运，从而使免疫细胞浸润。因此，很容易推测子宫内膜异位病变中AOC3的过度表达有助于局部宽松的炎性环境，有利于病变的产生和植入，类似于这种促炎酶在多种人类病理学中在骨髓细胞募集转移或淋巴细胞募集中的作用。32，40，41。

对LPP进行排毒失败可能会增加子宫内膜异位症患者的疼痛感。虽然我们检测LPP解毒酶系统，例如谷胱甘肽S-转移酶或ALDH2，在异位病灶和在位内膜，与ROS和子宫内膜异位症的先前的观察一致，观察到的4-HNE加合物显著水平20，21，22。观察到的ROS和LPP衍生的氧化蛋白修饰水平升高，同时伴随GSH合成的LPP失活酶（如GCLC）或保护酶（如戊二醛毒素或过氧化物酶）的损伤水平降低。这证明了病变的特征在于一系列不平衡的保护措施，并可以解释持续升高的ROS水平，可能增加的细胞凋亡水平以及通过改变蛋白质修饰而引起的病变炎症特性变化的恶性循环。

其次，我们描述了子宫内膜异位症中氧化应激，IL-8和血管生成之间的关系，这进一步加深了我们对该疾病的病理生理学的理解。与肿瘤转移相似，子宫内膜异位植入物需要新血管形成才能扩散并侵入宿主内的异位部位。子宫内膜组织是促血管生成因子的丰富来源，其中包括VEGF，它已成为子宫内膜异位症的关键血管生成调节剂，并可能通过浸润免疫细胞表达27。升高的ROS水平已显示出触发Toll样受体，NF-κB，和HIF1α途径，这可导致增加的血管生成42，43。各种炎症因子，生长因子和氧化应激激活NF-κB，这与细胞转化，增殖，凋亡，血管生成和侵袭有关44。获得的数据表明，氧化应激和LPP改变了髓样细胞的细胞因子谱，特别是IL-8分泌，作为髓样浸润和病变血管形成的驱动力。我们证明，在4-HNE暴露的生理剂量下，人单核THP-1细胞会增加IL-8分泌，蛋白质加合物形成和细胞死亡。白介素8在调节子宫内膜异位症中的炎性细胞因子级联反应中很重要，但也似乎在ROS炎症轴上构成一个正向环。因此，作为炎性细胞因子产生剂的单核细胞和巨噬细胞可能参与子宫内膜异位症中的4-HNE氧化级联反应，并且还可以通过产生IL-8促进髓样浸润和异位病变的血管形成。人们早已认识到这种趋化因子的血管生成特性，45岁，也有子宫内膜异位症 46岁。从我们和其他人的临床数据IL-8在妇女的PF被显著升高子宫内膜异位症 31和与疼痛相关的 47，进一步支持了观察该细胞因子促进以剂量依赖性方式疾病 48，49。

有人建议，针对腹膜内ROS正常水平恢复的治疗方法可能是治疗子宫内膜异位症或减轻其症状的可能候选者26。实际上，通过在腹膜病变中鉴定出新型的前氧化损伤标记AOC3，并使用小分子抑制剂方法50知道了它对炎性疼痛的有益作用，我们在这里提供了临床前证据，证明了对前氧化损伤的操作腹膜环境中的AOC3机制导致炎症性疼痛（子宫内膜异位症的主要症状）显着减轻。

材料和方法

患者样本

根据ENDOX研究的指导原则进行了患者研究，所有实验方案均已获得当地研究伦理委员会（国家卫生服务（NHS）研究（NRES）委员会中南部牛津大学（09 / H0604 / 58））的批准。参与研究的患者提供了知情书面同意，并从位于牛津的约翰·拉德克利夫医院的腹腔镜检查患者中收集了样本。在所有情况下，均通过手术和组织学方法确诊。对于该研究的蛋白质组学和转录组学，使用了不同的患者群体，并且在SI材料中提供了进一步的收集详细信息。