摘要
保护神经系统免受物理和化学应激的慢性影响是迫切的临床挑战。专性的变性蛋白Sarm1对Wallerian轴突变性至关重要。因此，阻断Sarm1功能正在成为一种具有治疗意义的有前途的神经保护策略。但是，仍然可以从抑制Sarm1中获得最大收益的条件尚不确定。在这里，我们结合了基因组工程，药理学和高分辨率的玻璃体内活检，以显示斑马鱼的遗传消除Sarm1会增加轴突损伤后各种化学疗法对施万细胞的毒性抵抗力。Sarm1缺陷轴突的合成降解逆转了这种效应，表明神经胶质保护是延迟的轴突变性的非自主效应。此外，Sarm1的丢失不会影响巨噬细胞募集至神经创伤性微环境，损伤消退或神经回路修复。这些发现预示着旨在抑制Sarm1的干预措施可以抵消神经胶质对化学应激源的脆弱性，并且可能是减少神经外伤的慢性后果的有效策略。
尽管频繁应力和创伤进行通信的皮肤，肌肉，以及感觉器官与大脑外周神经必须保持整个生命功能1，2，3，4，5，6。周围神经元和相关细胞（包括神经胶质）的完整性丧失是严重的神经功能障碍（包括虚弱，疼痛和感觉丧失）的常见现象7。胶质细胞损失导致神经脱髓鞘，去头皮干燥和神经元死亡。神经损伤触发轴突破碎和变性。反过来，这会引起相关神经胶质细胞的去分化，从而增强神经胶质在神经修复中的作用。然而，脱分化也使得胶质细胞易受退化长期去神经后8，9，10，11，12。受损轴突经历沃勒变性13，这是由进化古亲退行性蛋白Sarm1（含有1不育α和TIR基序）触发14，15，16，17。Sarm1是一种模块化蛋白，包含两个无菌alpha主题（SAM），一个线粒体缔合（MT）和一个TIR结构域14。神经损伤通过TIR二聚化，这是足以诱导轴突变性激活Sarm1 18，19。机械地，Sarm1活化导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）的受损轴突损失20，21，22。TIR结构域起NADase 23的作用，解释了为什么NAD +合成酶NMNAT1的过表达通过维持Sarm1下游的高水平NAD +来抑制切断的轴突的降解（参考文献24）。）。此外，Sarm1的丢失会阻止受损轴突的变性，在没有受伤的情况下，Sarm1的强制激活会导致轴突破坏。因此，Sarm1是信号传导途径的分级调节剂，对于轴突降解22来说是必需的和充分的。周围神经损伤后，神经胶质雪旺细胞具有特殊功能，可促进轴突碎片从近端残端25再生之前清除轴突碎片。。迅速的轴突再生非常重要，因为持续的雪旺氏细胞去神经支配导致长期的神经胶质终末表型丧失和最终死亡。反过来，神经胶质损失会损害再生神经的髓鞘形成和回路修复，从而将急性神经病转化为不可逆的慢性神经功能障碍。因此，抑制或延迟轴突破坏已被假设为一种有效的策略，以提高反雪旺氏细胞易受其包括代谢失衡和药物额外压力源26，27。作为轴突变性必不可少的离散层次因素，Sarm1是药物干预的理想靶点18。这个想法已经引发了激烈的努力，以查明轴突变性的特异性分子抑制剂临床应用28，29。然而，这从抑制Sarm1最受益全身尚未的条件被定义30，31。在这里，我们讨论斑马鱼的基因功能强大的上述问题，一个小的脊椎动物，其神经系统在解剖学上是简单的，但在功能上类似于哺乳动物的32，33，34。至关重要的是，斑马鱼幼虫是理想的研究雪旺细胞生物学在运行得动物的天然上下文35，36，37，38，39，40，41，42。通过表征Sarm1中的功能丧失突变，我们为轴突-胶质细胞相互作用的细胞基础提供了新颖的见解，并提供了鼓励寻找和开发用于临床应用的Sarm1抑制剂的数据。
Sarm1的氨基酸序列在15号，43号物种中非常保守。为了鉴定直向同源物Sarm1在斑马鱼中，我们扫描公共可访问的基因组数据（斑马鱼通过BLAST搜索使用TIR结构域，其存在于所有已知的蛋白质Sarm1参照基因组组件版本GRCz11）15，44。这项探索产生了15号染色体上的单个候选基因座。斑马鱼基因组的其他部分似乎都没有携带Sarm1旁系同源物。假定的斑马鱼Sarm1的基因组结构使人联想到其他物种，其中包含8个外显子，它们编码713个氨基酸的蛋白质，具有典型的N端自动抑制结构域，2个中央SAM多聚结构域和C端TIR变性域（图 1a）。类似于果蝇（Drosophilla melanogaster），但是，D。rerioSarm1缺乏明显的线粒体靶向序列（MT）。为了测试鉴定出的基因是否产生具有预期功能的蛋白质，我们使用了CRISPR / Cas9介导的基因组修饰来在Sarm1中产生功能缺失突变。通过靶向外显子1，我们获得了两个等位基因的种系传递：sarm1 hzm13和sarm1 hzm14（补充图a，b）。hzm13等位基因引入11个碱基的缺失和T / C突变，导致移码和终止密码子过早。hzm14是一个7个碱基的缺失和AG / GA突变，也会产生移码和过早的终止密码子。使用针对Sarm1的抗体通过Western blot分析野生型胚中的蛋白质提取物，发现大约80 kDa的单个条带与全长蛋白质的预期大小相符（补充图 1c）。纯合子sarm1 hzm13的蛋白质提取物中不存在该条带斑马鱼的胚胎。值得注意的是，由于该抗体识别Sarm1 C端的表位，因此无法区分缺少所有具有已知功能域的截短蛋白的表达与无义介导的mRNA诱导的Sarm1的完全缺失衰变。纯合子sarm1 hzm13突变体显示无明显的解剖缺陷（补充图 1d，e），是可行的，并发育为可育的成虫。此外，一种简单的感觉运动功能测定包括在触觉刺激后引起逃逸反应，表明野生型和Sarm1突变体之间的位移距离和平均加速度无差异（补充图 1f，g）45。
一个结构Sarm1，指示来自不同物种的Sarm1功能域的对齐方式（未按比例）。b野生型和Sarm1-/-标记有线粒体mCherry的轴突线粒体共聚焦图像。红色箭头指向轴突中明显的线粒体群。c上图，通过视频显微镜记录的野生型（H）（左图）和Sarm1-/-（I）（右图）的轴突线粒体的运动记录仪。下面板显示了从上面板显示的运动记录仪中沿顺行（绿色）和逆行（红色）方向移动的线粒体的颜色编码迹线。d 5 dpf野生型和Sarm1-/-中线粒体的密度，误差线= SEM。ns =不重要，来自学生t的p值-test，n = 25（WT），n = 19（Sarm1-/-）。e 5 dpf野生型和Sarm1-/-中线粒体的活动性。圆圈表示顺行，三角形表示线粒体的逆行。p从单向ANOVA，野生型值Ñ = 26，Sarm1 - / - ñ = 26 ˚F在野生型（左）和Sarm1 GFP标记的外侧的感觉神经元的轴突变性的延时图像- / -幼虫（对）。hpi =受伤后一小时，比例尺= 50μm，白色星号表示从近端残端长出的轴突。g量化从轴突横断到野生型（n = 13）和Sarm1-/-（n = 13）。h显示了一种实验，其中与野生型鱼（左侧面板）相似，在Sarm1突变鱼类（右侧面板）的感觉神经元中功能性Sarm1的表达足以降解切断的轴突。中间面板显示不可降解的Sarm1缺陷型轴突。
尽管已经在果蝇和小鼠的神经元中对Sarm1进行了广泛研究，但我们认为有必要评估Sarm1对幼虫斑马鱼的神经元和非神经元细胞的全身性丧失的影响。这是因为没有一项单独的研究通过活体高分辨率显微镜对单个生物中的Sarm1功能进行全面研究。为此，我们使用神经系统的结构和功能的几个参数通过组合sarm1 hzm13用表达在机械感觉侧线的感觉神经元的荧光标记物的转基因，以及在它们相关的许旺细胞46，47。对于正常和变化条件下的体内研究，侧线系统是理想的选择48，49，50，51。它结合一个典型的脊椎动物的感官系统的与顺从用于受控实验干预，包括显微学，药理学，和光遗传学组织41，42，52，53。我们发现，Sarm1的丢失不会影响侧线感觉通路的发育和结构（补充图 1h–n）。为了进行更详细的分析，我们通过表达与mCherry 54融合的细胞色素C氧化酶亚基8A 的线粒体靶向序列，对感觉神经元中的线粒体进行了荧光标记。。我们选择研究线粒体是因为它们是动态的细胞器，通过沿着微管轨道移动的分子马达介导的主动转运在整个神经元中分布。在轴突中，微管被极化，使得它们的正端指向轴突末端，从而使不同的分子马达在前后方向55上定向运动。轴突内的运动方向反映线粒体健身，因为强调的细胞器是在逆行方向偏置56，57。因此，轴突线粒体代表神经元极化，细胞内动力学和整体健康的最佳代理。我们在野生型和Sarm1突变动物的外周轴突中发现线粒体的数量，密度和分布在质量上相似。运动学分析表明，大部分静态大的线粒体基团，以及一些较小的碎片在恒速和逆行方向上以恒定的速度移动了相当长的距离（图 1b，c）。重要的是，定量显示轴突线粒体的数量和空间分布（图1d），或野生型和Sarm1突变标本之间的移动速度和方向（图 1e）没有显着差异 。
接下来，我们讨论Sarm1的功能保守性在斑马鱼使用神经外伤体内先前建立的生物测定，其使用激光介导的使用单神经元荧光蛋白的表达和高分辨率显微术个体化轴突切断41，58。为了精确地切割轴突，我们将紫外线激光束聚焦到周围神经的离散区域。切断后，在野生型标本中，远端轴突节快速退化，而与神经元周围核保持联系的近端节仍然可行（图 1f）。动力学分析表明，Sarm1缺陷型轴突在5天内保持稳定，而野生型轴突则在8小时内降解（图 1g）。）。通过将荧光标记的全长Sarm1转基因导入突变神经元中来消除Sarm1突变体的抗退化表型（图 1h），这表明了斑马鱼Sarm1的功能保守性。
身体伤害通常会导致炎症反应，从而将免疫细胞募集到伤口。神经损伤后，由损伤介导的活性氧（ROS）产生以及雪旺氏细胞产生的趋化因子会募集包括巨噬细胞在内的炎症细胞。使用哺乳动物培养的神经元进行的离体研究表明，Sarm1在线粒体ROS产生的下游起作用。因此，我们决定在体内测试Sarm1的缺失或雪旺细胞的缺失是否会影响巨噬细胞募集到损伤部位。为此，我们在巨噬细胞特异性启动子Mfap4的控制下生成了表达膜靶向EGFP的转基因株系。我们将此行与Tg [SILL：mCherry]和Sarm1或Erbb2中的突变结合在一起。53，59。我们用激光伤害了神经，并以高分辨率评估了巨噬细胞的行为。我们发现，招募的发生和在伤口巨噬细胞的数量没有野生型试样和Sarm1或ErbB2的突变体（图之间不同 2A和补充影 1 - 3）。巨噬细胞从不同的位置到达，并在野生型和突变型标本中沿轴突的近端和远端以定性的方式无法区分。定量成像显示，在Sarm1或Erbb2突变体中，巨噬细胞在伤口近端的保留时间没有改变，尽管在没有雪旺氏细胞的情况下平均保留时间略有延长（图 2b）。）。在野生型，Sarm1，和ErbB2突变体，巨噬细胞在损伤部位吞噬碎片本地，并没有出现参与分割后的轴突（补充电影的远端部分降解 1 - 3）。然而，我们发现，Erbb2突变动物中巨噬细胞吞噬的碎片的大小显着增加（图 2c）。这些结果表明，Sarm1的丢失不会影响巨噬细胞对局灶性损害的解决。同样，重要的是，它们表明巨噬细胞独立于雪旺氏细胞被募集到伤口。我们确实注意到在野生型和Erbb2突变型动物中，与EGFP（+）细胞无关的离散且高度移动的轴突片段，但在Sarm1缺陷型鱼类中却没有。
a量化募集到损伤部位和邻近轴突节段的巨噬细胞的数量。b定量时间巨噬细胞与轴突节段的相互作用。c量化巨噬细胞内碎片的大小。首先进行单向方差分析，然后在两组之间进行T检验的p值。
神经元中的钙（Ca 2+）调节对于体内平衡至关重要，因为胞质钙的持续升高会导致轴突和神经元变性。通常，这是因为线粒体以钙依赖的方式释放凋亡诱导因子和蛋白酶60。已经在体外和斑马鱼的哺乳动物神经元中的研究表明，神经元损伤触发轴浆钙（Ca的标高的两个波2+）21，52。前者在受伤后几乎立即发生并迅速衰减，而后者则起病和衰变较慢。Sarm1的丧失可防止切断的轴突中Ca 2+升高21。我们试图通过在损伤前后以高分辨率监测外侧感觉轴突中Ca 2+的动力学，从而进一步测试斑马鱼体内Sarm1的功能保守性。我们使用遗传编码的超敏Ca 2+传感器GCaMP7a 在轴突损伤前后高分辨率下测量了Ca 2+的动态变化，发现完整的野生型和Sarm1突变轴突在背景以上显示出无法检测到的轴质荧光水平（图 3a）。 。切断后，野生型轴突远端节段中的荧光信号立即增加，随后以接近恒定的斜率衰减，而在Sarm1缺失的远端轴突节段中荧光仍然几乎检测不到（图 3b）。）。接下来，我们分别使用遗传编码的生命感应器Mito-RGECO和ER-GCaMP3 检查了线粒体和内质网（ER）中的Ca 2+水平（图 3c–f）。我们选择这些细胞器，因为CA 2+从ER轴索释放激活线粒体通透性转换孔，以触发的轴突变性61，62。我们发现，在切断的野生型和Sarm1-/-轴突中，轴突切断后线粒体和网状Ca 2+的含量均等增加。这些结果表明，Sarm1的丧失减弱了钙向轴质的内流，但线粒体或ER中的Ca 2+吸收却没有。
在野生型（左列）和Sarm1-/-鱼（右列）中表达绿色荧光钙传感器GCaMP7a的单个外侧感觉轴突的共聚焦图像。行显示相同的样品在激光介导的横切之前（顶部），横切之后立即（中间）和横切之后60 s（底部）。在a，c和e中，白色箭头指示轴突的位置，特别是在背景信号低的情况下。比例尺20μm。b显示了第一波轴质钙的定量。数据显示为平均值±SEM；p从单向ANOVA，野生型ñ / - - 16 = 16，Sarm1 Ç显示了在野生型（左列）和Sarm1-/-鱼（右列）中表达红色荧光钙传感器RGECO的外侧感觉轴突的共聚焦图像。行显示了在激光介导的横切之前（顶部），横切之后（中间）和横切之后60 s（底部）的相同样品。d线切割后，线粒体钙内流的定量显示在野生型和Sarm1-/-中强而几乎相同的升高和衰减。数据显示为平均值±SEM；p从单向ANOVA，野生型ñ / - - 16 = 16，Sarm1 È在野生型（左列）和Sarm1-/-鱼（右列）中，显示了表达针对内质网（ER）的绿色荧光钙传感器CCaMP3的外侧感觉轴突的共聚焦图像。行显示了在激光介导的横切之前（顶部），横切之后（中间）和横切之后60 s（底部）的相同样品。f定量切割后，野生型和Sarm1-/-中的ER钙流入量显示出强烈且统计学上相等的升高和下降。数据显示为平均值±SEM；来自单向方差分析的p，野生型n = 16，Sarm1-/-16。
因为第二个Ca 2+波负责丝氨酸-苏氨酸蛋白酶Calpain的激活，而后者又通过裂解微管和神经丝63促进轴突断裂，所以我们决定监测外侧感觉轴突2、4、8的Ca 2+水平。 ，以及受伤后12小时（hpi）。在切断的野生型轴突中，第二次轴质Ca 2+的波开始于轴突断裂的同时发生4 hpi，并一直保持在轴突碎片中直至8 hpi（图 4a）。请注意，这些图像的时间分辨率无法解决轴突再生之前的退化。相比之下，第二次轴质Ca 2+在Sarm1突变型轴突中不会发生（图 4b）。因此，我们假设强迫持续的轴质Ca 2+升高将足以触发切断的Sarm1缺陷轴突的降解。为了验证这一预测，我们在Sarm1突变斑马鱼的侧耳传入神经元中转基因表达了与tagRFP融合的大鼠瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）。mCherry单独在神经元中的表达作为对照。TRPV1是非选择性阳离子通道，具有很高的二价选择性，并且其激活会导致Ca 2+流入细胞64。温度高于43°C或类香草素辣椒素可激活大鼠TRPV1。重要的是，该TRPV1在用于维持斑马鱼的温度（28°C）下是无活性的，并且斑马鱼TRPV1直系同源物对辣椒素65不敏感。因此，在斑马鱼中表达的大鼠TRPV1提供了一种可调节的工具，可以以优异的时间分辨率提高轴质Ca 2+的水平。我们切断了表达TRPV1和表达mCherry的外侧轴突，并在2小时后将一种溶媒溶液或溶媒+辣椒素添加到了装满鱼的水中（补充图 2a，b）。90分钟后检查样品。不存在TRPV1的严重Sarm1缺失轴突在辣椒素或沐浴在乙醇溶液中的表达TRPV1的轴突中不会断裂。如假设的那样，我们发现在辣椒素存在下，表达Sarm1缺陷的TRPV1轴突片段容易降解（补充图 2c-f）。这些结果首次在体内证明了Sarm1下游轴质Ca 2+的升高足以触发轴突降解。
在野生型鱼中表达mCherry（红色）和绿色荧光钙传感器GCaMP7a（绿色）的外侧感觉轴突的共聚焦图像。在横断后2、4、8和12小时，行显示相同的轴突（受伤后的小时数= hpi）。b在Sarm1-/-鱼中表达mCherry（红色）和绿色荧光钙传感器GCaMP7a（绿色）的外侧感觉轴突的共聚焦图像。比例尺20μm。
雪旺氏细胞在脊椎动物中支持，簇生和髓鞘状的感觉轴突66。我们认为，由于Sarm1缺失而导致的轴突变性延迟可能会影响轴突与Schwann细胞之间的相互作用。为了评估这种体内相互作用，我们将sarm1 hzm13等位基因与三重转基因品系Tg [gSAGFF202A; UAS-GFP；SILL：mCherry的]突出雪旺氏细胞与绿色荧光和外侧传入神经元与红色荧光53，67。使用高分辨率的活体显微镜检查，我们确定在Sarm1缺陷型斑马鱼中，雪旺细胞正常发育，并形成感觉轴突（图 5a）。）。切断后，野生型轴突通过吞没轴突片段和细胞内碎片降解迅速被雪旺氏细胞清除（图 5b，补充影片 4）。因此，我们问是否通过产生同时缺失Erbb2和Sarm1的双突变斑马鱼品系，维旺细胞是否对于维持严重的Sarm1缺陷轴突是必需的。在缺乏Erbb2的标本中，切断的轴突的远端部分破碎并被清除（图 6a-d），但与野生型标本相比有明显的延迟（图 6a-d）。相比之下，在Erbb2 / Sarm1双重突变体中，切断的轴突没有破碎或降解，与仅缺少Sarm1的鱼类相同（图 6c，d）。因此，Sarm1突变体中的轴突维持独立于雪旺氏细胞发生。
a双转基因5dpf幼虫的共聚焦图像，显示在Tg [gSAGFF202A] Gal4驱动程序的控制下以GFP（绿色）表达标记的雪旺细胞和在SILL增强剂控制下的mCherry表达标记的侧入神经元（红色）。野生型（顶部），Sarm1突变体（底部）。比例尺20μm。b图像显示了野生型和Sarm1-/-的雪旺氏细胞（绿色）及其与轴突（红色）的交互作用的视频显微镜记录的轴突横切后指示的时间点（受伤后的小时数= hpi）。白色箭头指示雪旺细胞吞噬野生型轴突碎片。白色箭头指示Sarm1-/-中的抗降解轴突片段。请注意，在这些图像中看不到Sarm1-/-中的近端轴突残端，因为它位于焦平面之外。
当损伤在神经胶质中产生缺口时，与伤口相邻的雪旺氏细胞会主动移动并延伸类似于丝状伪足的细胞突起，从而迅速重建连续的神经胶质支架53。虽然连续的神经胶质细胞是没有必要的近端轴突残端的再生长，它可以防止飘游再生生长锥，反过来促进终末器官从头神经支配和重构电路39，41。因此，我们决定在切断轴突后和结合Tg [gSAGFF202A; UAS-GFP;的轴突再生过程中立即询问雪旺细胞的行为。SILL：mCherry]具有Sarm1突变的双转基因。如预期的那样，我们发现在野生型动物中，与伤口相邻的雪旺氏细胞迅速扩展了丝状伪足，从而在轴突再生之前闭合了神经胶质支架中的间隙（补充电影 5）。然后，再生纤维跟随这些亚细胞的神经胶质桥而重建神经，遭受轻度去角质，仅限于损伤内的一小部分（图 6e，补充图 3）。与之形成鲜明对比的是，与损伤相邻的雪旺氏细胞在Sarm1突变体中并未迁移或产生丝状伪足样投射（补充电影 6）。然而，再生的轴突最终协商出持续的较大间隙，以沿着神经胶质远端支架生长。然而，重整神经表现出更明显的局部去纤毛（图 6f，补充图 4）。
去神经的雪旺氏细胞从由终端表型标记物，包括髓鞘和髓磷脂相关蛋白的表达的缺失所揭示髓鞘到祖样状态经历去分化部分25，68，69。末端表型的丧失促进雪旺细胞增殖和迁移，从而增强其再生功能70。我们假设，由于在Sarm1突变体中不会发生雪旺细胞失神经，远端雪旺细胞可能不会去分化。这可以解释他们在轴突横断后缺乏吞噬和突出活动。在此之后的理由，我们进行免疫染色样品与抗体紧密连接蛋白K，这定位于成熟雪旺氏细胞之间的接合处和在去神经胶质细胞中下调41，71。在野生型标本中，克劳丁-k在神经损伤后（hpi）直至6 h一直在侧支传入神经的整个长度上强烈表达，这表明在远端轴突破碎过程中，远端Schwann细胞保持成熟（图 7a，b）。然而，从10 hpi开始，施旺远侧细胞的Claudin-k明显少于近侧细胞。最后，即使在轴突再生开始后，远端施旺细胞中也明显缺乏24 hpi Claudin-k。相比之下，在同一时间段的Sarm1突变动物中，轴突切断后Claudin-k仍然强烈表达，位于伤口两侧的Schwann细胞之间没有明显差异（图 7a-c）。接下来，我们使用6D2单克隆抗体，其识别在鱼P0状髓鞘糖蛋白IP1和IP2（参考文献碳水化合物表位评估髓鞘形成72，73）。与克劳丁-k一样，野生型标本中远端损伤的施旺细胞中的6D2标记消失了（图 8a））。然而，在Sarm1突变体中6D2标记保持不变（图 8b）。当在髓鞘结合蛋白（Mbp：EGFP-CAAX，绿色）的控制下，使用表达膜靶向EGFP的转基因品系直接解决活体标本中的髓鞘形成时，我们获得了一致的结果（图 8c，d）74。有趣的是，辣椒素处理后，表达大鼠TRPV1通道的Sarm1缺陷型切断轴突的强制降解诱导相关的雪旺细胞去分化（补充图 2g）。）。在一起，这些结果表明，Sarm1缺陷的感觉轴突独立于雪旺细胞的支持而得以维持，并且切断的轴突的清除对于再生轴突的生长，寻路，髓鞘化和感觉神经的重新支配不是必需的。此外，他们揭示了损伤远端的Schwann细胞在Sarm1突变体样本中不会去分化。
a – c切断的轴突上共焦成像位置的示意图模型（a）。在6、10和24hpi中，野生型（b）和Sarm1-（-）（c）标本的共聚焦图像。伤后小时。标本是Tg [gSAGFF202A; UAS：EGFP; SILL：mCherry]品系，并用Claudin-k（洋红色）抗体染色。比例尺50μm。
a，b野生型（a）和Sarm1-/-（b）标本在侧线感觉神经元中表达EGFP的共聚焦图像（绿色），并用单克隆抗体6D2染色。在轴突切断（hpi）后的指定时间点进行染色。箭头指向切割位置。比例尺为50μm。c Tg [Mbp-EGFP的实时成像；SILL：mCherry]。箭头表示轴突破碎，箭头表示髓磷脂破碎。比例尺20μm。d Tg [Mbp-EGFP中 Sarm1-/-的实时成像；SILL：mCherry]切断后。箭头指示生长的轴突，箭头指示生长的轴突之间的并置。比例尺20μm。
许多化学治疗剂总是导致外周神经毒性，导致永久性神经元功能障碍75，76，77，78，79。在去神经的条件下，雪旺细胞变得对化学毒性高度敏感80。我们想知道Sarm1突变体中轴突的长期维持能否抑制胶质细胞的脆弱性。为了验证这一想法，我们用几种化学化合物治疗了野生型和Sarm1突变斑马鱼，这些化合物正在临床试验中或用作人类常见癌症的一线治疗。首先，我们使用了10-羟基喜树碱（10-HCT），它对失神经的神经胶质有极高的毒性81，并使用荧光转基因标记Tg [gSAGFF202A; UAS：EGFP]，此实验非常理想，因为在去神经支配的雪旺细胞中绿色荧光强度没有变化，因此与这些神经胶质细胞的成熟无关41。我们证实10-HCT不会影响与存活轴突相关的雪旺细胞（图 9a，b）。但是，它在轴突切断后显着减少了10-HCT处理的野生型动物中的雪旺细胞数量。相比之下，在Sarm1突变样本中，远端施旺细胞的数量仅受到少量影响（图 9b））。铂基，紫杉烷类和一些生物碱是有效的化学治疗剂，可作为各种人类恶性肿瘤的护理标准，尽管它们具有包括破坏神经胶质在内的严重神经病变作用82。为了解决它们对Schwann细胞的影响，我们用顺铂，奥沙利铂，紫杉醇，多西他赛和长春新碱处理了野生型或Sarm1突变斑马鱼。我们发现，在神经横切后，所有这些药物均会杀死野生型标本中的损伤远端雪旺氏细胞，但不会杀死Sarm1突变体（图 9c）。）。重要的是，这些药物均未影响与完整轴突相关的雪旺细胞，这表明轴突可保护雪旺细胞免受化学应激。为了证实这一预测，我们在用10-HCT或长春新碱处理的Sarm1缺陷斑马鱼中强迫切断的轴突降解。为此，我们重复使用辣椒素激活在纯合突变鱼中侧脑神经元亚组中表达的大鼠TRPV1，其中每个细胞（包括雪旺氏细胞）都没有Sarm1。该实验表明，一旦切断的轴突被合成消除，缺乏Sarm1的Schwann细胞再次变得容易受到化学毒性的影响（图 9d），这证实了Sarm1介导的神经胶质保护是非自主的，并取决于不可降解轴突的存在。
a共聚焦图像显示对照标本（轴突未横切），轴突横切后48小时以及10-HCT（10-羟基喜树碱）处理的标本中的雪旺氏细胞（绿色）和外侧感觉轴突（红色） ）。左列是野生型，右列显示Sarm1-/-。在所有情况下，水中的10-HCT浓度均为40μm。比例尺100μm。b定量的雪旺细胞从一个。数据显示为平均值±SEM。** p <0.01，双向ANOVA，n = 8（每组），然后对两组进行T检验。Ç Quantifi Ç用所示化合物处理48小时后，WT的雪旺细胞分裂，WT切断，Sarm1-/-和Sarm1-/-切断。浓度：紫杉醇40μm，多西紫杉醇0.1μm，奥沙利铂500μm，顺铂50μm，长春新碱50μm。数据显示为平均值±SEM。* p <0.05；** p <0.01，三项方差分析，n = 8（每组），然后对两组进行T检验。d在用10-HCT或长春新碱处理的标本中，轴突切断后雪旺氏细胞的定量。左栏组为野生型。右栏组是Sarm1-/-和Sarm1-/-具有合成消除的轴突片段。双向ANOVA，然后对两个独立组进行T检验。
支配皮肤，感觉受体，关节和肌肉的感觉神经元将外围信息传达给大脑，使动物能够执行日常生活中的基本活动。使用斑马鱼和一系列测试，包括感觉神经元和相关雪旺细胞的亚细胞结构表征，神经元功能和行为测定，我们提供了对损伤的神经元和神经胶质反应以及阻塞后果的全面综合分析轴突变性。已经公认的是在不存在Sarm1的果蝇和小鼠防止损坏轴突的退化15，83。尽管我们并未预测斑马鱼中Sarm1直系同源物的任何差异，但在我们的实验性神经元途径中测定功能保守性并不是必不可少的，因为某些神经创伤性疾病会导致在缺少Sarm1的情况下导致神经元丢失。Sarm1的损失提高了创伤性脑损伤小鼠，抑制长春新碱介导的神经功能恢复84，85。Sarm1缺陷小鼠可存活19，86。我们发现Sarm1的慢性和全身性丢失与斑马鱼的生存能力和感觉神经功能兼容，并证明长期维持不可降解的轴突片段对感觉电路的修复没有不利影响。而且，再生的轴突正常地絮状和髓鞘形成，表明它们不与不可降解的轴突片段竞争离开胶质细胞。因此，我们得出的结论是，轴突破坏和神经重建过程并行发生。此外，这些数据表明，轴突降解和再生之间的竞争平衡似乎并未影响Sarm1的进化，甚至不影响Wallerian的退化。
着眼于雪旺氏细胞，我们显示在Sarm1突变体中与神经损伤相邻的神经胶质细胞的行为与野生型标本有显着差异。具体而言，Sarm1突变体中的许旺细胞不会迁移或延伸投射来弥合胶质支架中的间隙，这表明这些细胞不会直接感觉到缺失的细胞间接触或胶质间断。相反，我们的发现提出了替代方案。一种是轴突的降解释放出信号，这些信号诱导雪旺氏细胞改变行为。例如，在小鼠中，神经损伤会通过TGF-β信号传导促进伤口周围雪旺细胞的间充质行为，从而推动雪旺细胞在整个伤口中的迁移[ 87]。尽管我们没有观察到雪旺氏细胞的迁移，但来自受损轴突的信号可能会促进伤口附近的雪旺氏细胞以类似的方式将突起延伸至88弥合间隙。有趣的是，我们观察到野生型动物在损伤的两侧都从雪旺氏细胞中出现了丝状伪足样结构，这表明修复诱导信号可能会扩散，从而独立于它们与轴突的结合而影响神经胶质细胞。此类信号的来源是否是受损的轴突，失神经的雪旺氏细胞或伤口微环境中的其他细胞，尚待确定。
神经损伤后，活化的巨噬细胞在伤口周围迅速积聚，并导致Wallerian变性和轴突再生。具体来说，经典的促炎性M1型吞噬巨噬细胞可去除轴突和髓鞘碎片，而消炎型M2型巨噬细胞可调节雪旺细胞活性并促进轴突再生89。神经损伤后，许旺细胞立即释放趋化因子，这些趋化因子在轴突断裂之前在伤口处吸引或保留巨噬细胞。重要的是，药理学激活巨噬细胞募集到伤口微环境可增强轴突再生，而减少巨噬细胞浸润则可抑制轴突再生。ROS是跨物种保守的早期伤口信号。损伤介导的ROS产生募集包括巨噬细胞在内的炎性细胞。神经损伤后ROS的主要来源是线粒体和细胞NADPH氧化酶。离体培养的神经元的研究表明，Sarm1在线粒体ROS产生的下游起作用。此外，先前的研究已将Wallerian轴突变性和Erbb2突变标本的再生特征化，90，91。因此，在体内测试了Sarm1的丢失以及雪旺细胞的缺失是否会影响巨噬细胞的募集，发现野生型标本和伤口之间的募集开始，伤口处巨噬细胞的保留时间和数量没有差异。 Sarm1或Erbb2突变体。同样，与野生型标本一样，Sarm1和Erbb2突变体中的巨噬细胞会吞噬碎片，这些碎片在Ebbr2突变体中的巨噬细胞中更大。因此，Sarm1的丢失不会影响巨噬细胞对局灶性损伤的解决，巨噬细胞的募集和激活独立于雪旺氏细胞。上述发现表明，除了巨噬细胞和雪旺氏细胞外，吞噬细胞被激活，可能是嗜中性粒细胞 92损伤后吞噬并清除远端轴突碎片，并且在Sarm1缺陷动物中不会发生此过程。
总之，有关Sarm1功能的当前机制细节来自独立的观察结果，这些观察结果是从各种各样的实验系统中推断出来的。这使得难以综合发现和调和一些矛盾的观察结果。在这里，我们已经开发了一个强大的体内遗传系统，可以全面研究单个脊椎动物系统中Sarm1从亚细胞到机体水平的系统性丧失的后果。通过生成在Sarm1中携带功能丧失突变的斑马鱼，我们证实并加深了果蝇的先前发现，小鼠和培养的细胞。从这里介绍的工作中可以得出一些新颖的见解。首先，动物对Sarm1的丢失有很好的耐受性。第二，神经回路的修复并不取决于受损轴突的快速清除。第三，Schwann细胞对于维持体内切断的轴突不是必需的。第四，在轴切开后，切割部位远端的雪旺氏细胞在体内的Sarm1突变体中不会去分化。第五，横断轴突的长期维持显着提高了神经损伤后神经损伤后雪旺氏细胞对化学毒性的耐受性。由于神经外伤是外科手术，不可避免的慢性代谢功能障碍（包括糖尿病，82。因此，这些发现具有明显的病理生理意义。至关重要的是，这些数据为系统地抑制轴突降解的直接干预是减少神经创伤的慢性后果的有前途的策略提供了有力的支持。因为TIR域二聚化对于降解NAD +是必需的，而且足以降解NAD +，所以它使Sarm1易于被小分子抑制（如针对TLR2的TIR域所证明的那样）（参考资料 93）。我们的研究结果鼓励Sarm1抑制剂的治疗应用的发展 18，29。
斑马鱼（D. rerio）根据Helmholtz ZentrumMünchen动物实验伦理委员会（德国动物福利法Tierschutzgesetz§11，Abs）的指导方针，存放在集中设施中。1，Nr。1，Haltungserlaubnis，代表欧盟动物福利，并遵守协议编号Gz.:55.2-1-54-2532-202-2014和Gz.:55.2-2532.Vet_02-17-187，来自德国“ Regierung von Oberbayern” 。转基因品系Tg [UAS：EGFP]，Tg [HGn39D]和Tg [SILL：mCherry] 67，Tg [gSAGFF202A] 41，Tg [UAS：GCaMP7a] 94，Tg [mbpa：tgRFP-CAAX] tum102Tg（也称为Tg为MBP：tgRFP]）95个ErbB2突变体41，59以前已经发表过。通过CRISPR / Cas9介导的诱变产生Tg [Sarm1-/-]。
我们使用CRISPR / Cas9介导的基因组修饰在Sarm1的外显子1中产生突变。将Cas9 mRNA和sgRNA共注射到单细胞阶段的胚胎中。使用Ambion TM mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒从Pme I线性化CAS9载体（pMLM3613）体外产生Cas9 mRNA 。用RNA easy试剂盒（Qiagen）纯化mRNA。为了生成sgRNA，使用在线工具“ ZiFiT Targeter软件包”（http://zifit.partners.org/），对目标外显子进行了测序，并将序列信息用于设计sgRNA指导载体（pDR274）的寡核苷酸。）96。Sarm1外显子1的sgRNA序列为5'-GGGACTTGGAAGAGACCCGC-3'。将退火的寡核苷酸克隆到Bsa中使用T4连接酶（NEB M0202）对I消化的pDR274载体进行了消化。对得到的克隆进行测序以验证其正确性，然后用Dra I 线性化。使用T7 MEGAscript试剂盒（Ambion TM）将纯化的线性化DNA片段用于生成sgRNA 。通过注射产生的成鱼杂交，我们获得了两个独立的等位基因的种系传递：sarm1 hzm13和sarm1 hzm14。对于基因型突变载体，我们使用了引物：正向：5'-GATTTGCCGTTATCTCTCCA-3'，反向：5'-TCAAGCAGTTTGGCAGACTC-3'。
先前已经描述了DNA构建体SILL：mCherry，SILL：Gal4（参考文献67），UAS：Synapsin1-GFP 53和mbp：EGFP-CAAX。载体pMLM3613（42251）和pDR272（42250）购自Addgene。质粒UAS：TRPV1-tagRFP，即含有与tagRFP融合的E600K突变的大鼠TRPV1的编码序列，由Genecat合成，并使用Tol2试剂盒生成表达构建体。使用Tol2试剂盒生成SILL：mito-mCherry，SILL：Sarm1-v2a-mCherry，SILL：Kaede，SILL：mitoRGECO和SILL：erGCaMP3的构建体。通过表达融合到mCherry 的细胞色素C氧化酶亚基8A 的线粒体靶向序列来标记外侧神经元的线粒体。含有mito-RGECO和er-GCaMP3的质粒（参考资料97）是DW Raible（华盛顿大学）的礼物。
如下进行整个安装的免疫染色。首先，将斑马鱼胚胎或幼虫样品浸入冰冷的4％多聚甲醛中，固定在稀释于含0.2％Tween-20（PBST）的磷酸盐缓冲的盐水缓冲液中，并在4°C孵育过夜。然后，将样品在室温（RT）下用PBST洗涤3次，每次洗涤10分钟，然后在10％的牛血清白蛋白（BSA）中封闭，同样在室温下放置1 h。接下来，将样品在一抗中于4°C孵育过夜。接下来，将样品在PBST中洗涤2小时，每30分钟更换为新鲜缓冲液。最后，将它们与二抗在4°C下孵育过夜。一抗和浓度：小鼠抗乙酰微管蛋白，1：1000（Sigma T7251）; 大鼠抗Claudin-k，1：500（来自英国爱丁堡大学的T. Becker的礼物）71 ; 小鼠6D2，1：5（来自德国奥斯纳布吕克大学G. Jeserich博士的礼物） 73。使用的二抗浓度如下：驴抗小鼠555，1：200，Abcam ab150106; 预先吸附的驴抗大鼠IgG H＆L（AlexaFluor®647），1：200，Abcam ab150155）。在显微镜检查之前1天，将样品在PBST中洗涤30分钟并固定在Vectashield中。固定样品的成像是通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM 510，卡尔·蔡司）进行的。
对于视频显微镜，将幼虫在Danieau's中用MS-222（0.013％M / V）麻醉，并安装在35毫米玻璃底培养皿上的0.8％低熔点琼脂糖中。如前所述，使用粘贴在玻璃移液器尖端的发圈将样品轻轻压在玻璃上。将琼脂糖圆顶与MS-222一起浸入Danieau的圆顶中。使用具有40倍物镜的旋转圆盘显微镜在28.5°C下58获取细胞图像。Z堆栈的间隔设置为0.8-1.2 µm。每个堆栈的时间间隔为10分钟或15分钟。使用ImageJ对所得的原始数据进行处理，组合和分析。
受精后5天麻醉野生型和突变幼虫并杀死。将样品在冰冷的RIPA缓冲液（带有Roche的蛋白酶抑制剂混合物，Cat.04693159001）中匀浆。匀浆后，将样品在冰上温育30分钟以进一步裂解，将裂解液在1200 rpm下于4°C离心。然后，将上清液用于BCA分析，将上清液在加样缓冲液中稀释并在99°C下煮沸5分钟，然后将样品在SDS-PAGE中运行并转移到PVDF膜上。 5％脱脂牛奶（在PBST中稀释）1 h，将膜与第一抗体（兔抗-Sarm1，1：500，ANASPEC 55381;小鼠抗-β-Tubulin，1：2000，Sigma T5168）一起孵育过夜。第二天，清洗膜并与HRP标记的二抗（过氧化物酶-阿菲尼纯山羊抗小鼠IgG（H + L），1：10000，Jackson Immuno Research 115035003;过氧化物酶-阿菲尼纯山羊抗兔IgG（H + L） ），1：10000，Jackson ImmunoResearch 115035144）1小时。通过用ECL冲洗膜来获取图像（Pierce™ECL Western Blotting底物，Thermo Fisher，32109）。
为了分别标记外侧感觉神经元，将SILL：mCherry构建体的DNA注射到Tg [HGn39D]，Tg [HGn39D]的卵中。Sarm1-/-]，Tg [SILL：mCherry; gSAGFF202A；UAS：EGFP]或Tg [SILL：mCherry; gSAGFF202A；UAS：EGFP；Sarm1-/-]斑马鱼。根据外侧肌神经元的红色荧光选择幼虫。如上所述，将选择的样品安装在琼脂糖中，并使用iLasPulse系统（Roper Scientific AS，Evry，法国）将它们的周围轴突靶向紫外激光（350 nm）。的激光束是使用63×水浸物镜递送50，53，58。校准激光脉冲并将其施加到目标区域，直到可以看到轴突中有清晰的间隙。1 hpi再次观察样品，以确认完整的轴突横切。
为了分析感觉轴突中的线粒体，我们使用斐济软件（http://fiji.sc）的Multi-Kymograph工具生成了mito-mCherry荧光斑点的运动图。线粒体的运动由随时间变化的线的斜率确定，运动方向由运动的线粒体与运动图中的时间线（垂直）交叉确定。使用Python脚本和Graphpad Prism软件分析了数据。
对于外侧神经元的钙成像，Tg [SILL：Gal4; 将UAS：GCaMP7a]双转基因幼虫麻醉并将其安装在35毫米玻璃底培养皿中的0.8％低熔点琼脂糖中。通过×63水浸物镜以400毫秒的曝光时间进行成像。在时间序列的第四次成像后进行激光介导的轴突横切。接下来，在28.5°C下以400 ms的帧速率进行实时视频显微镜检查2分钟。使用ImageJ分析原始数据。为了量化钙信号，将图像处理为ImageJ。选择感兴趣区域（ROI）并随时间点测量值。GCaMP或RGECO强度变化的计算公式如下：∆ F / F 0 =（F – F 0）/ F0，其中，F 0是轴突横切之前的荧光信号的值，F是轴突切断后具有时间点的荧光信号的值97。
对于化学实验，我们将SILL：Gal4与UAS：mCherry或UAS：ratTRPV1-tagRFP共注入到Tg [UAS：GCaMP7a]或Tg [HGn39D; Sarm1-/-]。SILL：Gal4阳性幼虫；UAS：ratTRPV1-tagRFP; 通过在5μM辣椒素（Sigma，M2028）中孵育并随后对已安装并麻醉的胚胎进行1 h实时成像，使用UAS：GCaMP7a表达激活斑马鱼中的TRPV1通道。通过×63水浸物镜以400毫秒的曝光时间获取图像。对于用Sarm1突变幼虫进行的实验，将带有SILL：mCherry或ratTRPV1-tagRFP阳性动物的HGn39D激光切除。横切后2小时，用10μM辣椒素或乙醇（1：1000，v / v）处理幼虫。辣椒素处理后1.5小时，通过旋转圆盘显微镜拍摄图像。
对于触摸介导的逃避反应，将2个dpf胚胎轻轻去绒毛，并在28°C的Danieau's溶液中保存至少1 h。将胚放入含有Danieau的未盖平皿中，并用高速相机（NX4系列，成像解决方案，GmbH）记录。开始录像，用钝的玻璃针触摸随机选择的胚胎，直到引起反应。在白光照射下以200帧/秒（fps）的速度在150秒内进行记录。使用3D粒子跟踪器插件ImageJ软件获得游泳轨迹。进一步的量化和统计是使用Python。
|
|
