摘要
源氏萤火虫，Luciola cruciata，广泛分布于日本主要岛屿（本州，四国和九州），并根据寻求伴侣的雄性的闪动间隔分为两种生态类型（4秒慢闪或2秒快闪）间隔）。生态类型的边界对应于Fossa Magna，这是一个将日本东西部分开的大断裂带。尽管已使用同工酶和线粒体DNA序列数据评估了这两种类型的遗传分化程度，但尚未使用全基因组数据对其进行评估。基于使用单端限制性酶切位点相关的DNA（RAD-Seq），主成分，基因水平的系统发育树，混合物和赖特固定指数分析获得的全基因组数据，我们确定了十字花科的三个系统发育组。：东本州，西本州和九州。该分组对应于生态类型：东本州为慢闪型，西本州和九州为快闪型。尽管在邻近或人工移植的区域周围异常观察到基因渗入，但是自然种群中几乎没有群体间的基因流动。合并模型下的系统发育树还评估了东本州，西本州和九州组之间的差异。此外，由于这三类人群的分布方式与日本列岛的地质历史相吻合，因此出现了十字花科（L. cruciata）结论。此外，我们确定了可用于区分自然保护和再生中萤火虫移植遗传管理的三个遗传群体的遗传标记。
萤火虫的奇异光芒几乎吸引了所有人。这种吸引力在日本尤为明显，萤火虫出现在日本历史最悠久的历史书《日本书》中，该书是在八世纪的奈良时代编写的。
在成人萤火虫发光是配合适配1，2，3，和种特异性和配合相关的闪光信号在生殖隔离起主要作用4。因此，可以认为闪光信号的分化和形成过程是紧密相关的。源氏萤，源氏萤，是一个物种节目同步闪烁，其闪存通信和交配行为已被深入研究5，6。该通信系统分为几个阶段：日落之后，雄性开始飞翔并寻找具有同步闪光的雌性；雌性在草地上发出单脉冲闪光（不同步）；当雄性发现雌性的闪光时，雄性接近雌性；雄性在接近雌性并在雌性周围行走时发出各种形式的闪光 此后，它们交配5，6，7。
该物种分布在日本的三个主要岛屿，即本州，四国和九州，并且根据雄性的同步闪光行为，已经识别出两种生态类型（图 1）7。在慢速闪光类型中，寻求伴侣的雄性的闪光间隔约为4秒，而在快速闪光类型中，他们的闪光间隔约为2秒。此外，快闪型雌性在一个部位聚集以产卵，而慢闪型雌性则不合群。慢闪型萤火虫分布在日本东部地区（东日本），而快闪型萤火虫分布在日本西部地区（西日本）。居住边界对应于一个称为Fossa Magna的大断裂带，该断裂带将本州岛划分为东部（东部-本州）和西部（西部-本州）区域。但是，这两种类型在形态上没有区别。
为了评估两种生态类型之间的遗传分化程度，进行了同工酶分析8。系统发育树显示出两个主要进化枝。第一个是东日本（与东本州地区一致）的人口，另一个是西日本（包括西本州，四国和九州地区）的人口；这些人口分别对应于慢闪和快闪类型。两种类型在亚种水平上进行了遗传分化（通过酶的Nei遗传距离为0.09）9。
此外，线粒体细胞色素氧化酶（CO）II基因也进行了分析10。系统发育树显示了三个主要进化枝（I，II和III）。Clade I由分布在本州东部的单体型组成，Clade II在西本州和四国，而Clade III在九州。即，克莱德I对应于慢闪类型，而克莱德II和III对应于快速闪光类型。另外，系统发育树显示枝条分支。枝条III首先分支，随后枝条II和I分支。因此，枝条I的慢闪型特征被认为是派生的。另外，作为支化顺序几乎相当于日本岛的形成11，12，一个vicariant情况得出的结论是在遗传和生态多样性L. cruciata会从日本岛的形成过程中的后续进化分离出现。
除了的情况下L. cruciata，由于通过与窝玛格纳日本岛的形成居住区域的分割昆虫的独特遗传多样性其它实例也是已知的13，14，15，16，17。但是，包括它们在内，这些系统地理学研究是使用线粒体和核DNA水平的少量基因进行的，而不是使用全基因组DNA数据进行的。对于全基因组多态性分析，限制性位点相关的DNA测序（RAD-Seq）是一种非常有效且具有成本效益的方法18。它可以通过高通量测序，针对侧翼有目标限制性位点的数千个基因组区域，减少基因组的表达，并可以在许多个体中提供大量的全基因组多态性。该RAD-Seq的方法可以用于野外标本群体遗传学研究，并在美国萤火虫19，20。在这项研究中，我们使用了传统的单端RAD-Seq技术和限制性内切酶Eco RI所获得的全基因组多态性数据，该酶识别6个碱基对的序列，以评估十字形假单胞菌的整个种群结构和种系。整个分销范围。此外，我们确定了可用于区分的遗传标记L. cruciata种群。
本研究中使用的成年十字花科萤火虫样本是从17个地区收集的39个人，以及从5个地区的分销商购买的10个人（表 1）；样品编号和位置映射在图 1中。大部分样品是雄性的。只有两个样本，编号26和38，是雌性。50、51和52号样品分别是8、16和22号样品的技术复制品。样品在室温或-20°C下储存在乙醇中。在提取基因组DNA之前，将单个样品风干30分钟，离心1分钟，再风干1小时以完全除去乙醇。然后，使用球磨机通过冷冻研磨将除机翼以外的整个身体均质化。根据制造商的说明，使用Blood＆Cell Culture DNA Mini Kit（日本Qiagen）进行基因组DNA提取。使用QuantiFluor ONE dsDNA系统（日本Promega）评估分离的基因组DNA的浓度。
RAD-Seq的库是根据已建立的方法21创建的。Eco RI用作单一限制酶。该文库由Macrogen（韩国首尔）在Illumina HiSeq 2000（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）的一个泳道中进行了50 bp单端读取的测序。序列数据以登录号DRA007766存放在DDBJ序列读取档案（DRA）中。由于本研究中分析的所有萤火虫样品均为潜在的交叉相容性物种，因此考虑了Hardy-Weinberg原理。堆叠程序是用于通过施加哈迪-温伯格原理分析密切相关的样品的RAD-SEQ有用数据22，23。因此，我们使用Stacks程序分析了RAD-Seq数据。使用Stacks软件包（v。1.46）中的process_radtags程序对数据进行了质量过滤。此外，衔接子序列和低质量端使用cutadapt（诉1.14）和trimmomatic（诉0.36），分别进行修整24，25。补充表S1中示出了经质量过滤的读数的数目 。数据用的参照基因组对齐L. cruciata（NCBI / DDBJ BioProject数：PRJDB7197）由bowtie2带有-q-NO-UNAL -L 15分的选项26。参考基因组的数据仅用于核序列信息，而不用于线粒体DNA。使用具有默认参数的Stacks软件包的ref_map.pl脚本（v。1.47）分析对齐的数据。
Stacks程序包的填充程序用于创建带有-p 26选项27的变量调用格式（VCF）文件。此选项表明必须存在一个基因座才能处理该基因座的最小数量为26。在此分析中，由于意外读取的影响减小且可重复性提高，因此-p选项设置为一半。集群中总共有52个样本，并且提取了一半以上样本共有的基因座。使用vcftools计算每个样品的平均测序深度。使用SNPrelate程序（v.1.18.1）28基于该VCF文件进行了主成分分析（PCA）和多维缩放（MDS）分析。
通过将数据与参考基因组比对创建多重比对。Stacks程序包填充程序用于使用选项-phylip和-phylip_var在集群中创建多个比对。使用RAxML程序（版本8.2.12）29（-f = a，-x = 12,345，-p = 12,345，-N（引导值）= 1,000，构造了基于最大似然（ML）方法的系统树。和-m = GTRGAMMA）。使用MrBayes程序（版本3.2.6）30（lset nst = 6，比率= invgamma，mcmc ngen = 500,000，samplefreq = 1,000，nchains = 4，savebrlens = yes）构造了另一种基于贝叶斯推理的系统树。在每个分析中，中点均用作根。
系统发育树分析是使用软件PAUP ver。中集成的SVDquartets进行的。4.0a166使用多重比对31，32，33。用于SVD四重奏的参数如下（四重奏评估；评估所有可能的四重奏；树推断；使用QFM四重奏集合选择树；树模型；多物种合并；歧义处理；和分布）。进行的自举分析次数为1,000次重复。在RAxML和MrBayes分析中使用的相同位置被用作根。
对于掺混物分析，使用了Stacks填充程序来创建带有-p 26选项34的PLINK文件。该混合物的分析是基于用外加剂（V 1.3.0。）设定的条件下此PLINK文件进行35。
为了比较种群内部和种群之间萤火虫的遗传多样性，使用具有-fstats选项的Stacks种群程序计算了成对的F st值。
通过运行两种原始的Ruby脚本，确定了日本的十字花科植物将SNP 分为两种（东日本和西日本类型）或三种（东本州，西本州和九州类型）种群。allsnps.rb程序使用VCF文件输出了包括SNP在内的所有基因座的列表。在此计算的输出文件中，运行了第二个程序popdiff.rb来对总体进行分组。定制脚本可在GitHub网站（https://github.com/yoshinobuhayashi/RADseq_Firefly_2019）上找到。
线粒体CO II基因从用PCR引物（：ATGGCAGATTAGTGCAATGG，TK-N-3785 GTTTAAGAGACCAGTACTTG TL2-J-3037）的基因组DNA中扩增36。使用Sanger方法和BigDye 3.1进行序列分析，并将3500xL遗传分析仪（Applied Biosystems）用作DNA测序仪。序列数据保存在BioProject登录号PRJDB8812中。使用MEGA X（版本10.0.5）37进行单倍型树构建。选择最适合最大似然（ML）分析的核苷酸取代模型；使用所选参数构造ML树。引导程序分析进行了1,000次重复。密切相关的物种Luciola owadai被用作外群。
进行了萤火虫L. cruciata的全基因组SNP的比较，该SNP 由52个保藏号组成，包括49个单独的样品和三个技术重复样本（编号50-52）。使用Eco RI 从单消化的RAD-Seq获得的超过2.24亿个原始单端读数中，经过质量过滤后保留了1.87亿个读数，每个合并样本平均保留了360万个读数（补充表 S1））。该读取数目对应于萤火虫基因组上预测的靶向限制性位点的1.12％。通过使用Stacks建立目录并通过SNP调用参考基因组数据，可以在两个或多个样本（p-option =临界值的26）之间共享435,165个RAD基因座，而在所有52个样本中发现19个基因座（p-选项= 52）。这些数据用于群体遗传学和系统发育分析。
为了探索52个种质之间的关系并检查种群结构，进行了PCA；图是使用前三个组件创建的（图 2）。这三个组成部分的贡献率高达分析数据的25.2％，细分如下：第一主比例（PC1）=数据的14.7％，PC2 = 6.4％，PC3 = 4.1％。根据收集或购买的区域，分别是九州，西本州和东本州，使用绿色，蓝色和红色三种颜色绘制种质的每个样地。在图上，萤火虫种质首先根据PC1的值分为两组（簇以红色对其他两种颜色绘制）。对PC2的分析表明第二次分为另外两个组（绿色与其他两种颜色）。因此，PC1与PC2的二维图显示了三个大型簇的清晰分离， 2A）。但是，有四个例外，即第4号（红色）属于蓝色西本州组，第9号（蓝色）属于红色东本州组，而第14号（蓝色）属于绿色九州。组。从MDS分析的三维数据中可以获得有关每个萤火虫居住区的更详细的信息。东本州萤火虫（红色）的地块分布往往比其他两个集群的地窄，并集中在受限的位置（补充图 S1）。
通过主成分分析（PCA）表示十字花科的种质。这三个主要成分数据由三个二维数据集显示：（A）第一和第二PCA轴，（B）第一和第三PCA轴，以及（C）第二和第三PCA轴。括号中显示每个成分的贡献率。每个绘制的种质的颜色表示样品收集区域（图 1）；本州东部为红色，本州西部为蓝色，九州为绿色。这三个类的区别在于彩色的绳钩。
我们基于ML方法和贝叶斯推断分析，在核DNA水平上构建了两种类型的基因水平系统发育树（图 3和补充图 S2）。），其中假定不存在基因内重组。对于这些分析，使用了69,314个系统发育信息位点，这些位点是使用参考基因组通过多次比对检测的。另外，中点被设置为根。值得注意的是，使用UPGMA方法将该点作为根进行估计，其中可以进行根估计。两种系统发育树的比较显示它们的拓扑结构没有差异，并且两棵树都显示了两个主要进化枝A和BC，后者进化枝分为B和C。推断的进化枝得到了bootstrap得分100的支持。属于每个进化枝的种质分别与它们的栖息地一致，分别是东本州（A类），西本州（B类）和九州（C类）。与通过PCA和MDS分析进行分组的结果相同，不同的是三种登录。进化枝B中包括本州东部地区的第4个物种，进化枝A中包括了本州西部地区的第9个物种，进化枝C中包括了本州西部地区的第14个类，而进化枝C中包括了西部本州地区的第14个类。核DNA树的长度，西本州和九州萤火虫之间的基因组相似性高于西本州和东本州萤火虫之间的基因组相似性。
利用基于最大似然（ML）重建的核DNA数据，对十字形乳酸杆菌种质的系统发育树。节点上的数字表示引导程序值（1000个重复中的百分比）。比例尺显示每个站点的取代数。每个加入物的颜色表示样品收集区域（图 1）；本州东部为红色，本州西部为蓝色，九州为绿色。右侧边栏显示了由系统发育树的分支方式划分的三个主要进化枝：（A）东本州，（B）西本州和（C）九州。最长分支的中点用作根。
使用ML方法构建了另一种使用线粒体CO II基因的系统树（图 4）。使用具有离散Gamma分布（参数= 0.1358）的ML方法选择了田村3参数核苷酸取代模型38。这棵树显示了两个主要进化枝，I-II和III，前一个进化枝分为I和II。属于每个进化枝的单倍型也与它们的栖息地一致：东本州（第I类），西本州（第II类）和九州（第III类）。除了核树的第三个例外（第4、9和14号）以外，第38和39号单倍型也很特殊，尽管它们是在本州西部收集的，但它们都包含在第I枝中。区域。进化枝的分支顺序与核树不同，西部和东部本州萤火虫之间的线粒体基因组相似性高于西部本州和九州萤火虫之间的线粒体基因组相似性，正如我们先前的论文10所发现的。
利用线粒体CO II基因基于最大似然（ML）重建的十字形乳杆菌单倍型的系统发生树。节点上的数字表示引导程序值（1000个重复中的百分比）。比例尺显示每个站点的取代数。每种单体型的颜色表示样品收集区域（图 1）；本州东部为红色，本州西部为蓝色，九州为绿色。右侧边栏显示了三个主要分支：（I）东本州，（II）西本州和（III）九州。owadai的单倍型用作外群。
与用于分析核DNA的上述两种方法相反，在诸如SVDquartets的合并模型下的方法中，假定存在基因内重组。在图1所示的分析SVDquartets。 5，L. cruciata被分解为两个主要的组，东本州和西日本，并分成两个小组，西本州和九州，这是一样的基因-在后一组ML和贝叶斯模型的水平系统发育树（图 3和补充图 S2）。推断的组得到97.6至100的bootstrap评分的支持。渗入样本（东本州组的样本数量为9，西本州组的样本数量为9，九州的组样本的数量为14）。
使用SVDquartets方法使用的核DNA数据PAUP系统树构造L. cruciata。节点上的数字表示引导程序值（1000个重复中的百分比）。每个种质的颜色表示样品采集区域（图 1）：本州东部为红色，本州西部为蓝色，九州为绿色。右侧边栏显示推断出的三个组：（A）东本州，（B）西本州和（C）九州。中点用作根。
根据混合程序的结果，从K = 1到7进行假设祖先种群（K）值选择。发现将值设置为3时错误率最低（图 6和补充图 S3）。）。在K = 2处确定了第二低的错误率。样品的种质根据其居住区域东西本地区，东本州，西本州和九州而水平对齐。纵轴表示三个假设的祖先种群的祖先比率，分别以紫色，橙色和棕色上色。这三个假设的祖先种群的分布与这些种的栖息地一致，这与通过PCA和MDS分析进行的分组相同（图 2）。和补充图 S1）。通过核和线粒体DNA树进行聚类（图3和图 4以及补充图 S2））除4号，9号和14号登录号相同外，但在4号和9号萤火虫中未观察到基因混合，尽管在10号西本州和九州之间观察到了这种情况， 14、15、46、47和48个种质。10、14和15号萤火虫栖息在本州西部与九州之间的边界地区。但是，没有确定原始的居住区46和47，因为它们是由经销商购买的。在本州东部和西部地区的38号和39号中也观察到基因混合。尽管90％以上的基因组来自假定的West-Honshu种群，但其线粒体单倍型已被确认为East-Honshu型（图 4）。
根据混合和系统发育树分析的结果，本研究中的萤火虫种可合理地分为3组。东本州，西本州和九州萤火虫。为了估计三组之间和之内的遗传多样性程度，计算了两种类型的成对F st值。
First F st是三组中的值，分别计算为0.347794（东本州vs.本州西部），0.546587（东本州vs九州）和0.199462（西本州vs九州）（表 2）。在本州西部与九州萤火虫组中观察到最低值，在本州东部与九州萤火虫组中观察到最高值。这些结果表明，遗传上最接近的对是西本州和九州组，而东本州和九州组最远。此结果与使用核DNA的PCA，MDS和系统树分析相同，但与线粒体DNA分析不同。
第二F st是每组内的登录物中的值（补充表 S2）。这些成对的F st值绘制在图 7中，并且平均值分别计算为0.73559（在本州东部），0.81016（在本州西部）和0.81076（在九州）。东本州组的遗传多样性显着最低（东本州和西本州组之间的p <2.20×10 -16；东本州和九州组之间的p <2.20×10 -9）。本州西部地区和九州地区两组之间的平均值无显着差异（p = 0.9398）。
为了区分这三组，搜寻了遗传标记并鉴定了两个SNP位点（图 8）。这两个SNP位于十字形乳酸杆菌基因组的非编码区域。此外，还搜索了其他遗传标记，将其分为东日本（与东本州一致）和西日本（包括西本州，四国和九州）组。2545个SNP上的整个基因组序列的预测L. cruciata。结果示于表 3和补充表 S3中。。尽管1,964个SNP位于非编码区，其余581个SNP位于基因区。其中，有215个SNP分布在蛋白质编码序列（CDS）上，特别是发现77个SNP在翻译的蛋白质水平上特异性引起氨基酸取代。
区分三个十字花科植物（东本州，西本州和九州）的遗传标记。可以区分这三组的两个SNP位点在十字形乳杆菌基因组的非编码基因区域中鉴定。
PCA，MDS，基因水平的系统发育树和使用核DNA数据进行的混合物分析的结果表明，52 株十字花科植物被分为三类，东本州，西本州和九州类型（图 2，图3，图6和补充图 S1）。系统发育树也证实了该分组，其中考虑了基因内重组（图 5）。）。地质和地理上的群体对应于本州的东部和西部地区，由麦格纳大瀑布和九州划分。在自然种群中几乎没有群体间的基因流动。例外地，第4号和第9号登录号分别在东西本州和东西本州收集，但根据它们的核和线粒体DNA明确地分别放在了西方本州和东西本州组中。因此，推测将两个萤火虫标本人工移植到了采集区域。同时，九州组以西本州收集的登录号为特征。收集地点在地理位置上非常靠近九州，而核DNA的65％属于九州。因此，推测萤火虫标本是西本州和九州萤火虫杂交的后代。但是，样品是否来自人工移植或自然迁移尚不清楚。尽管很少观察到各组之间的核DNA渗入，但在10、15、38、39、46、47和48号这7个保藏号中有可能在自然界或通过人工移植的标本在交叉区域进行交叉交配的可能性（图7和图9）。 图3和图6以及补充图 S2）。值得注意的是，伊豆种群（第38号和第39号）在核DNA水平上被包括在本州西部组中，而在线粒体DNA水平上被包括在本州东部组中（图4中的第 I条 ）。该结果意味着东本州的雌性和西本州的雄性在第一个孝子代（F1）中可能会回交父系特征39。合并模型下的树显示了两个主要类别，东本州和西日本，后者分为西本州和九州两个子组（图 5）。）。由于东本州和西日本的组分别对应于生态类型，即慢闪和快闪类型，因此通过合并模型分析来区分主要的两个组。生态，这是由我们的实地观察认识到，不仅队友寻求男性，而且其飞行速度和活动时间，女性的群居产卵行为的闪光间隔被日本东部和西部地区之间的差异7，40。此外，男性对人工闪光灯的优先蜂群活动也有所不同，其中慢速闪光种群的男性优先响应较长的闪光间隔（4秒和5秒），而快闪闪光种群的男性优先响应较短的闪光间隔。闪烁间隔（2和4秒）；建议进行交配隔离41。染色体多态性也是在两个群体观察到的是，在东本州（神奈川县）和西日本（爱媛县，四国）染色体的数目为2n = 20和18，分别42，43。有必要进行进一步的研究以阐明两种染色体类型之间的染色体分化和育性。至少考虑到自然种群中几乎没有这三类之间的基因流动，并且该分组对应于两种生态类型（闪光信号分化），所以在日本群岛上，十字花乳杆菌似乎正在形成物种。
这三类种群的分布方式与日本列岛的地质结构之间的一致性暗示了该物种的维多利亚时代的物种形成情况。根据日本小岛形成的地质历史，该岛的古代大陆与欧亚大陆的东部外围分离，并在大约一千六百万年（MY）前的福萨麦格纳形成早期分为东西大陆。11，12。日本群岛目前东部地区的相当一部分是岛状的，大部分在海底，并且是由随后的地壳隆升形成的（13 MY年前）。从0.1到0.5年前建立了当前日本岛屿（北海道，本州，四国和九州）的轮廓。通过核DNA分析，所有树木均显示出三组的分支顺序：首先是本州东部和本州西部-九州的分支，然后是本州西部和九州的分支（图 3和5以及补充图 S2）。因此，这种分裂似乎更有可能首先发生在东日本和西日本的人口之间，然后发生在西本州和九州之间。PCA和MDS也支持东西方优先方案（图 2）。和补充图 S1），核ML树的分支长度（导致中点根）（图 3和补充图 S2）和K = 2混合分析（补充图 S3）。此外，由于在东本州人口中，各组种之间的F st值均显着最低，因此可能由于沉降和隆升形成岛而受到了瓶颈效应（图 7和附表 S2）。）。因此，总而言之，我们认为首先出现的东西方差异更可能得到数据的支持，并且得到更好的支持。另一方面，不存在核DNA外基团意味着不能正确地重建分支顺序。生根的线粒体树甚至暗示了不同的分支顺序，这可能暗示着线粒体DNA的不同进化史（图 4）。这两个隔离分化的情况（东西或本州九州第一）已经从其他昆虫报13。生态类型的演化过程并非是结论性的，因为慢速或快闪类型都是祖先，需要相同数量的演化步骤。另外，L。owadai的闪光类型是否是模棱两可的东方乳杆菌（L. cruciata）的近缘种，用作线粒体DNA树制备的外群，是一种东部慢速或西部快闪型。
最后，在图8，表 3和补充表 S3中介绍了SNP标记 。L. cruciata是日本流行的萤火虫，被用作自然保护和再生的象征性昆虫。在这一努力中，通过线粒体CO II基因分析观察了三组之间的人工移植44。核DNA的SNP标记也将可用于萤火虫移植的自然保存和再生的遗传管理。
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