摘要
Aurora B激酶与Borealin，INSENP和Survivin一起形成染色体乘客复合物（CPC），以介导染色体浓缩，错误的纺锤体-线粒体附着和胞质分裂。Haspin激酶对组蛋白H3 Thr3进行磷酸化，而Bub1对组蛋白H2A Thr120进行磷酸化，将CPC集中在着丝粒上。但是，尚不清楚在有丝分裂进入时如何将CPC募集到染色体臂上。在这里，我们显示蛋白精氨酸甲基转移酶6（PRMT6）在组蛋白H3（H3R2me2a）的Arg2处的不对称二甲基化将CPC募集到染色体臂上，并促进Aurora B的组蛋白H3S10磷酸化，用于染色体浓缩。此外，体外测定表明，Aurora B优先结合含有H3R2me2a的H3肽并磷酸化H3S10。
组蛋白甲基化，表观遗传标记链接到不同的生物学过程和病理后果1，2，通过促进包装成异的调制通过松弛或基因抑制的染色质结构，以增强基因表达的3。关于组蛋白甲基化的一个基本问题是它是否作为表观遗传的静态组蛋白景观被传递，或者是否作为有丝分裂进入时染色体缩合的先前未描述的标记。组蛋白甲基化具有足够的动态性以控制时空有丝分裂进程，因为甲基化的酶促作用模式虽然不如执行磷酸化的激酶和磷酸酶好，但仍采用蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMT）或蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）作为表观遗传因子，并且赖氨酸和/或精氨酸脱甲基酶作为橡皮擦4。在PRMT中，PRMT6是一种I型甲基转移酶，在建立不对称二甲基精氨酸（aDMA）5之前，先执行单甲基精氨酸（MMA）的形成。
在进入有丝分裂染色体缩合为染色体的精确分离的先决条件，并且由集缩驱动，并且组蛋白6，7。当凝缩蛋白介导线性染色质区段中的环形成以及前期在轴向和横向方向上的压缩时，组蛋白驱动的凝结通过相邻核小体中修饰的组蛋白之间的相互作用加速局部染色体的压缩。在发芽酵母中，Aurora B介导的染色体乘客复合物（CPC）中的Aurora B介导的组蛋白H3S10磷酸化（H3S10ph）通过募集组蛋白脱乙酰基酶去除组蛋白H4中Lys16的乙酰基来实现有丝分裂染色体的超缩合，并促进与相邻核小体的相互作用8，9，10。在人类细胞中，细胞周期蛋白依赖性激酶1（对Cdk1）由吸Thr128（T128ph）的磷酸化在有丝分裂早期以产生马球盒结构域识别位点驱动单激酶活化 11，12。Polo样在T128ph和磷酸化单激酶的N-末端激酶1（Plk1的）结合，导致H3T3磷酸化（H3T3ph）为CPC的从染色体臂易位到内着丝粒 13，14。在有丝分裂的早期阶段对染色体臂经由H3S10ph实现染色体冷凝后，每次点击费用在着丝粒由单激酶介导的H3T3ph浓缩 14，15，16和中Bub1介导的组蛋白H2A Thr120磷酸化（H2AT120ph）16。虽然H3T3ph被Survivin的BIR域识别，但Shugoshin（Sgo1）读取H2AT120ph并募集Borealin。极光B活性也通过Sgo1和MPS1招募动粒的磷酸化有助于Sgo1本地化 17，18。因为粘蛋白在整个染色体臂上将姐妹染色单体保持在一起，所以在前期 19中通过姐妹蛋白5（Pds5）的粘着亚基早熟解离与Hasins结合的Haspin，在有丝分裂的早期，沿整个染色体磷酸化H3T3。因此，通过Aurora B / Cdk1介导的sororin磷酸化作用从染色体臂上去除粘附素，并伴随着粘附释放因子Wings-apart样蛋白（Wap1）的募集，促进了Haspin 20的着丝粒富集。蛋白磷酸酶1（PP1）/ Repo-Man磷酸酶复合体通过将H3T3ph在染色体臂21上去磷酸化来协同作用，将H3T3ph和CPC浓缩为着丝粒。在着丝粒处，黏附蛋白保护剂Sgo1 / Sgo2和蛋白磷酸酶2A（PP2A）通过使Sororin 20去磷酸化来保护着丝粒凝聚力。。有丝分裂激酶和磷酸酶的顺序激活操作了一个甲基/磷酸开关，因为H3S10ph将异染色质蛋白1（HP1）与组蛋白H3（H3K9me3）中的三甲基化Lys9解离，并将HP1介导的CPC转化为有丝分裂的募集模式22，23。尽管H3S10ph与所有生物体24中的有丝分裂染色体结构相关，但尚不清楚在转移到内部着丝粒之前将CPC募集到染色体臂的机制。
在这里，我们试图确定组蛋白标记，将CPC定位在染色体臂上以介导早期有丝分裂中的H3S10ph。我们的观察结果描述了H3R2me2a和H3S10ph之间的功能性串扰，为有丝分裂染色体的凝结和着丝粒凝聚力的触发提供了重要见解。
为了确定CPC募集的有丝分裂模式，我们检查了从G1-S边界同步释放的HeLa S3细胞中组蛋白H3甲基化的动力学，发现H3R2me2a从S期开始增加，并在有丝分裂退出时急剧减少（图 1a）。，补充图 1a）。此外，在有PRMT6的HeLa和MCF7细胞中，有丝分裂指数的指示物H3S10ph显着降低（图 1b，补充图 1b）。因此，我们测试了是否在相间25期间负责产生H3R2me2a的PRMT6 （补充图 1c）是有丝分裂进展所必需的。不同的有丝分裂阶段的频率和使用GFP-组蛋白H2B的细胞的时间推移图象的有丝分裂进程的定量分析表明前中期的在PRMT6缺失的细胞的延长的持续时间（补充图 1D-F ，补充影 1，2）。有趣的是，在贫PRMT6的细胞中，中期板的宽度显着增加（图 1c，补充图 1g）。），表明PRMT6参与染色体完整性方面，例如染色体浓缩，染色体排列和有丝分裂期间着丝粒凝聚。PRMT6的甲基转移酶活性对于染色体完整性是必不可少的，因为在PRMT6缺失的细胞中，野生型（WT）PRMT6的表达而不是甲基转移酶死亡（KLA）26版可以挽救中期板的宽度（补充图 2a）。因为PRMT6可以充当参与有丝分裂过程的有丝分裂调节剂的甲基转移酶，所以我们调查了H3R2me2a是否对染色体完整性负责。组蛋白H3 R2A或H3 R2K突变体在HeLa细胞中的表达引起中期平板宽度的相似增加（补充图 2b，c）。确实，染色体的免疫染色揭示了有丝分裂染色体上H3R2me2a的水平从前期到中期显着增加（图 1d，补充图 2d）。为了确定H3R2me2a介导染色体完整性的机制，我们检查了H3R2周围的组蛋白修饰，发现在稳定表达GFP-PRMT6的MCF7细胞系中，H3S10ph的增加与H3R2me2a的增加成正比（补充图 3a–c）；此外，PRMT6的消耗降低了早中期和中期的H3S10ph（图 1e，f）。因为H3S10ph的水平与PRMT6和H3R2me2a的水平相关，所以我们重点研究H3R2me2a和H3S10ph之间的串扰。对于H3S10ph，PRMT6的甲基转移酶活性是必需的，因为在PRMT6耗尽的细胞中，WT PRMT6的表达但不是KLA突变体，与H3R2me2a一致地拯救了H3S10ph（图 1g，补充图 2a，3d）。由于对PRMT6的竞争抑制作用，HeLa细胞中组蛋白H3 R2A或H3 R2K突变体的表达引起H3R2me2a和H3S10ph的相似降低（图 1h，补充图 3e）。在核型稳定细胞RPE1中观察到通过PRMT6耗竭而使H3R2me2a和伴随的H3S10ph降低的程度相似（图 1i）。，补充图 3f，g）。基于这些数据，我们得出结论，PRMT6介导的H3R2me2a与有丝分裂进入后的H3S10磷酸化有关。
a通过荧光激活细胞分选（FACS）和Western印迹分析来自同步HeLa S3细胞的指示蛋白水平。b用PRMT6特异性siRNA转染72小时后，收获HeLa细胞，并分析所示蛋白质的水平。c用PRMT6特异性siRNA转染后72小时，定量并绘制其中PRMT6缺失的HeLa细胞中中期板宽度增加的中期细胞。（n =来自三个独立实验的150个中期细胞）。d在固定的HeLa细胞中定量H3R2me2a的强度并作图（ 来自三个独立实验的每相n = 30个细胞）。ê，˚F的HeLa细胞用siPRMT6或MS023视为PRMT6抑制剂并用在早期前中期和中期抗H3S10ph抗体染色。量化并绘制前期细胞中H3S10ph的强度（ 来自三个独立实验的n = 30个细胞）。g定量并绘制GFP阳性细胞中H3R2me2a和H3S10ph的强度（ 来自三个独立实验的n = 30个细胞）。ħ二十八个旗组蛋白H3 WT或突变体（R2A或R2K）转染后小时，在标志阳性细胞的H3S10ph和H3R2me2a强度进行定量和作图（Ñ 来自三个独立实验= 30个细胞）。一世定量和绘制PRMT6耗尽的RPE1细胞中H3R2me2a和H3S10ph的强度（n = 30个来自三个独立实验的细胞）。比例尺，5μm。误差线，SEM。P值通过两尾学生t检验（c，d，e，h和i； * p <0.01）或双向ANOVA（g ; * p <0.01）计算。源数据作为源数据文件提供。
因为H3S10ph是酵母10中中期染色体超浓缩的代表组蛋白标记，所以我们推测H3S10的磷酸化和伴随的染色体浓缩受PRMT6调控。为了分析染色体凝聚的时空动力学，我们使用断层摄影显微镜记录了三维延时染色体数据集，该技术使用折射率27检测质量和体积（补充图 4a，b）。我们按照从早中期到后期的对照和PRMT6缺失细胞的帧进行观察，并确认在PRMT6缺失细胞中，中期板对齐的染色体密度降低了（图 2a，b；补充电影 3）。，4）。鉴于已经报道了H3S10ph在酵母中染色体过度浓缩中的作用10，我们检查了Aurora B耗尽细胞中的染色体密度，并确认了H3S10ph与哺乳动物细胞中染色体过度浓缩之间的相关性（图 2c，补充图 4c）。 。为了确定PRMT6耗尽后增加的中期平板宽度是否仅反映染色体凝集缺陷，我们利用了组蛋白H3 S10A突变体，发现其增加与PRMT6耗尽的细胞相似但不明显（图 2d，补充图 2c）。有趣的是，跨着丝粒（帧间-KT）的距离，指示姐姐动粒和着丝粒染色质的刚性之间的张力的参数28，29，30，并没有在H3S10A表达细胞（图改变 2E），这表明H3S10ph不会影响着丝粒的凝聚力。然而，在前中期和中期，PRMT6缺失的细胞的KT间距离明显长于对照细胞（分别为1.09±0.16μm和0.87±0.13μm和2.03±0.20μm和1.62±0.23μm）。 （图 2f），表明PRMT6以H3S10ph非依赖性方式参与着丝粒内聚。类似的结果通过GFP-CENPA细胞，其中，所述耗尽或PRMT6的抑制延长了-KT间距离（图的延时成像获得 2克。，补充图 4E，补充影 5 - 10）。与此结果相一致，在经历了MG132诱导的中期停滞的PRMT6贫乏细胞中，中期染色体比对的维持和适当的KT间距离显着受损（补充图 4f，g）。不出所料，Sgo1和Sgo2的水平对于保护前体通路中着丝粒的内聚性至关重要31，32，33，34，35，分别在PRMT6耗尽前中期细胞（补充图降低 5a，图5b）。相反，Bum1和Bub1介导的H2AT120ph，其他着丝粒凝聚的驱动因素，不受PRMT6消耗的影响（补充图 5c，d）。因为H3S10A突变体的表达不影响着丝粒中Sgo1和Sgo2的水平（补充图 5e），所以我们得出结论，PRMT6通过介导H3S10ph调节染色体浓缩，并通过H3R2甲基化募集Sgo1和Sgo2来控制着丝粒凝聚。
用siControl，siPRMT6或siAurora B siRNA处理a – c HeLa细胞，并通过断层扫描显微镜进行延时成像以评估有丝分裂染色体。图像显示了后期发生之前的三维有丝分裂细胞。中期染色体的密度是通过层析成像法通过折射率计算出的体积和质量得出的（ siControl中n = 22条染色体，siPRMT6-A中n = 10条染色体，siControl 和siAurora B中n = 21条染色体）。 （c））。d，e转染Flag-histone H3 WT或S10A突变体后的28小时，中期板宽度（d，n =来自三个独立实验的36个细胞）和Flag阳性前中期细胞（e， 来自三个独立实验的n = 100线粒对）的KT间距离被量化并作图。f进行siRNA处理后，确定了前中期和中期细胞（ 来自三个独立实验的n = 100个线粒对）的KT间距离。插图显示了框状区域的单个焦平面。G用siPRMT6处理HeLa / GFP-CenpA细胞，并在siRNA转染后72小时开始用共聚焦显微镜对GFP-CenpA进行延时成像。从三个独立的实验（n = 10个线粒体对）确定对照和PRMT6耗尽细胞的配对动臂之间的距离。比例尺，5μm。误差线，SEM。源数据作为源数据文件提供。（学生的t检验* p <0.01）。
鉴于H3S10在中期染色体的hypercondensation一个很好的基板极光激酶B和中共招募Sgo1和集缩我赋予刚性，着丝粒的凝聚力28，36，37，我们推测，中共招募由H3R2me2a介导的。因为CPC在募集前期被募集到染色体臂，然后募集到着丝粒，所以我们分析了PRMT6耗尽后，着丝粒中CPC亚基的水平。PRMT耗尽的前中期细胞的着丝粒中所有CPC亚基的水平都降低了，但是通过WT PRMT6的过表达将它们挽救了（图 3a，b；补充图 6a）。）。在具有PRMT6耗尽或抑制作用的中期细胞的着丝粒中也观察到了类似的减少（图 3c-e，补充图 6b，c），表明H3R2me2a将CPC募集到有丝分裂早期的着丝粒。染色体上CPC的这种定量减少不是由CPC亚基的蛋白质水平降低引起的，因为PRMT6耗竭和PRMT6抑制都不会影响CPC亚基的整体表达水平（补充图 6d）。我们一致发现，PRMT6的消耗显着降低了RPE1细胞中的Aurora B（图 3f，g；补充图 6e）。）。为了确定PRMT6活性是否有助于有丝分裂内部着丝粒的CPC稳态水平或仅导致有丝分裂进入时其在着丝粒的积累，我们使用PRMT6抑制剂对PRMT6抑制剂对被诺考达唑阻滞的有丝分裂细胞进行了短暂处理，发现H3R2me2a和Aurora B的水平显着降低（图 3h，补充图 6f）。由于HP1通过将CPC集中在G2 38中的异染色质上来诱导H3S10ph ，我们接下来分析了PRMT6缺失的G2细胞中HP1病灶处的Aurora B和H3S10ph的水平，并没有观察到明显的减少（补充图 7a–c）。为了进一步证实PRMT6介导H3R2me2a在中共招募的作用，我们转染的的LacI（一Lac抑制） - GFP-PRMT6融合蛋白进入LACO / TRE U2OS细胞39，40和一致发现，极光激酶B被拴在LACO /含有WT LacI-GFP-PRMT6的TRE阵列，但不包含前中期含有KLA突变体的类似阵列（图 3i，补充图 7d）。尽管LacI-GFP-PRMT6生成了H3R2me2a，但极光B在相间的LacO / TRE阵列中并未富集（补充图 7e）），表明H3R2me2a在有丝分裂环境下募集了CPC。因此，我们推断PRMT6在整个有丝分裂期间在着丝粒处都保持足够的CPC水平。尽管在H3R2A或R2K突变体转染的细胞中H3T3ph的水平略有降低，这是因为抗H3T3ph抗体的表位发生了突变，并且伴随着H3R2A或R2K突变蛋白中磷酸化H3T3的亲和力下降（补充图。 8a，b），H3R2突变不影响Haspin的H3T3ph（补充图 8a）。因此，通过将组蛋白H3 R2K突变体转染到HeLa细胞中，前中期和中期的所有CPC成分都发生类似的脱位，表明PRMT6通过H3R2me2a定位CPC，但在有丝分裂过程中不是通过其他蛋白质的甲基化来定位CPC（图 3j，k ;补充图 8c，d）。
a，b用siRNA去除PRMT6后，将细胞用指定的质粒转染，并从10个前中期细胞的着丝点处测定PRMT6耗尽的前中期HeLa细胞中CPC成分的强度（ 来自三个独立实验的n = 100中心）。c，d在10个有丝分裂细胞的着丝点处测定了PRMT6耗尽的中期HeLa细胞中CPC成分的强度（ 三个独立实验的n = 150个着丝点）。Ë用MS023作为PRMT6抑制剂和/或CHR-6494作为Haspin激酶抑制剂处理细胞。CPC成分的强度通过免疫荧光显微镜测定并作图（n = 100个着丝粒，来自三个独立的实验）。f，g在siRNA耗尽PRMT6后，前中期RPE1细胞用所示抗体染色（f）。在从10层有丝分裂的细胞（着丝粒确定的极光B在PRMT6耗尽RPE1细胞强度克，Ñ 来自三个独立实验= 100点的着丝粒）。H诺考达唑停药后十八小时，用PRMT6抑制剂处理HeLa细胞一小时，分析并绘制H3R2me2a和Aurora B的荧光强度（n =来自三个独立实验的30个前期细胞）。我 LACO / TRE U2OS细胞用的LacI-GFP-PRMT6 WT或KLA突变体转染。转染28小时后将细胞固定。使用针对内源性Aurora B的抗体评估Aurora B的存在，分析并绘制Aurora B的平均强度（n =来自三个独立实验的30个前中期细胞）。插图显示了框状区域的单个焦平面。Ĵ，ķ转染Flag-histone H3 WT或R2K突变体后，确定CPC成分的强度（ 来自三个独立实验的n = 100着丝粒）。比例尺，5μm。误差线，SEM。P值通过两尾Student t检验（d，e，g，h，I和k； * p <0.01）或双向方差分析（b ; * p <0.01）计算。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步描述H3R2me2a在CPC定位中的作用，我们检查了PRMT6或Haspin激酶抑制后CPC的染色体定位。实际上，使用小分子干扰RNA（siRNA）或抑制剂破坏PRMT6活性会导致染色体臂和着丝粒的CPC水平降低（图 4a，b，补充图 9a），而抑制Haspin激酶导致着丝粒的CPC水平降低，但CPC在染色体臂14上的积累（图 4c，d）。因此，通过抑制PRMT6可以显着降低染色体级分中所有CPC亚基的水平，而不能通过抑制Haspin激酶来降低（图 4e））。令人惊讶的是，PRMT6的耗竭或抑制而不是Haspin激酶抑制14实质上减少了染色体臂上的H3S10ph（图 4f，g），表明H3R2me2a对于CPC募集和H3S10ph在染色体臂上必不可少，并同时充当H3T3ph在染色体上的上游组蛋白标记调解着丝点的CPC本地化。
a – d用siPRMT6，MS023作为PRMT6抑制剂或CHR-6494作为Haspin激酶抑制剂处理细胞。CPC / CREST强度比是通过免疫荧光显微镜法测定的，这是通过三个独立实验的每个条件在100个着丝粒和100个染色体臂上捕获的诺考达唑阻滞的HeLa染色体扩展而得到的。e通过离心从用Haspin或PRMT6抑制剂处理的有丝分裂HeLa细胞中分离细胞质和染色体级分，并通过Western blot检测所指示的蛋白质进行分析。组蛋白H3和微管蛋白分别用作染色体和细胞质组分的上样对照。˚F，克用siPRMT6，PRMT6抑制剂或Haspin激酶抑制剂处理细胞。如（b）所示，用Nocodazole抑制的HeLa染色体扩散的免疫荧光显微镜法测定单个染色体中H3S10ph的平均强度，并作图（g，n =来自三个独立实验的100条染色体）。比例尺，5μm。误差线，SEM。P值通过两尾学生t检验（b和c； * p <0.01）或双向ANOVA（g ; * p <0.01）计算。源数据作为源数据文件提供。
作为组蛋白修饰往往会影响邻近残基和H3T3ph所需的着丝粒中共针对14，15，我们研究H3R2me2a和H3T3ph之间的相互关系。我们用生化测试了H3R2me2a和H3T3ph在相同组蛋白上对H3修饰的影响。因为据报道，H3R2me2a会中断12-aa肽41中的H3T3ph和H3S10ph （补充图 10a，b），而不是21-aa肽中的H3T3ph和H3S10ph （图 5a–c，补充图 10c，d），我们认为12-aa肽太短而无法反映生理条件，并且含有H3R2me2a的肽不仅充当了Aurora B的停靠位点，而且还充当了良好的底物。此外，21-aa肽的H3T3ph也没有通过PRMT6减少R2甲基化（图 5d）。为了进一步阐明H3R2me2a和H3T3ph的相互影响，我们确认了H3R2me2a在有丝分裂染色体上的分布，并在染色体臂上观察到H3R2me2a染色，而H3T3ph主要在着丝粒16处观察到（图 5e，g）。与生化结果一致，PRMT6耗竭和Haspin抑制均不会影响有丝分裂染色体上H3T3ph和H3R2me2a的分布（图 5f，h）。去除PRMT6或抑制Haspin的细胞的免疫染色也显示这两个修饰不会互相影响（补充图 10e-j），并且用过量的GFP-PRMT6增强H3R2me2a不能恢复由着丝粒引起的CPC募集的减少哈斯平抑制（图 5i）。因此，尽管H3T3ph和H3R2me2a彼此独立出现，但是这两个修饰并不相互影响，而是在CPC着丝粒定位时相互配合。
a修饰的组蛋白H3肽的氨基酸序列。b用21-aa肽进行体外Haspin激酶测定。c使用21-aa肽进行磷酸化的体外Aurora B激酶测定。d体外PRMT6甲基转移酶测定。e – h用siPRMT6，PRMT6抑制剂MS023或Haspin激酶抑制剂CHR-6494处理细胞。通过免疫荧光显微镜对诺考达唑停滞的HeLa染色体扩散进行了免疫荧光显微镜分析，并绘制了染色体臂和着丝粒中H3R2me2a（f）和H3T3ph（h）的强度，并作了绘制（n =来自三个独立实验的100条染色体）。一世转染了指定的质粒后，将HeLa细胞用Haspin激酶抑制剂CHR-6494处理5小时，并通过三个独立的实验分析了100个着丝粒的CPC成分强度。j将重组CPC蛋白与生物素化的组蛋白肽一起孵育，并用抗生蛋白链菌素-琼脂糖小珠拉下，并通过免疫印迹观察结合。ķTN停滞的Aurora B缺失细胞的裂解液补充有重组Survivin和Borealin蛋白，有或没有重组Aurora B蛋白。将裂解物与针对INCENP和H3R2me2a肽的抗体孵育，并用琼脂糖A珠进行下拉。通过免疫印迹观察结合。星号表示抗体的轻链。l将被TN捕获的有丝分裂HeLa细胞的裂解物与生物素化的组蛋白肽一起孵育，并用抗生蛋白链菌素-琼脂糖小珠拉下来，并通过免疫印迹观察结合。用图像处理软件（Image Studio ver5.0）测量带的相对带强度。误差线，SEM。比例尺，5μm。源数据作为源数据文件提供。（学生的t检验*p <0.01）。
然后，我们确定了CPC的哪个组件在位于染色体臂上的过程中识别H3R2me2a。在体外下拉实验中引入了对应于具有H3R2me2a或H3T3ph的H3（1-21）N末端尾巴的生物素化肽。据报道，Survivin与含有H3T3ph 15的H3（1-21）肽结合，但发现Aurora B在体外优先与H3R2me2a肽结合（图 5j）。为了确定极光B是否读取H3R2me2a招募CPC到染色体臂，我们试图重建而不极光B.中共复杂鉴于任何CPC部件的耗尽导致其他CPC部件codepletion 42，43，44，我们用重组Survivin和Borealin补充了Aurora B耗尽的细胞裂解液。不出所料，CPC复合体在不存在Aurora B的情况下不与H3R2me2a结合（图 5k），表明Aurora B读取H3R2me2a作为CPC募集的停靠位点。因此，H3R2me2a和H3T3ph肽均富集了有丝分裂HeLa细胞裂解物的CPC成分（图 5l）。令人惊讶的是，尽管存活蛋白在体外与双重修饰的H3（H3R2me2aT3ph）牢固结合（图 5j），但H3R2me2aT3ph显着降低了CPC成分与肽的缔合（图 5l）。因为Haspin的激酶活性仅限于着丝粒对着丝粒凝聚45，并且在着丝粒中未检测到PRMT6，而是在有丝分裂期间分散分布（补充图 11a），H3R2me2aT3ph似乎存在于着丝粒周围，并通过其对CPC的弱结合亲和力促进了CPC在着丝粒中向H3T3ph的转运。因此，我们得出的结论是PRMT6介导的H3R2me2a将CPC定位在染色体臂上，而Haspin的H3T3ph随后将CPC集中在着丝粒上。
在后期，CPC从染色体解离并转移到中心纺锤体8，这一过程对于随后的切割沟形成和胞质分裂至关重要46。在中央主轴着丝粒和有丝分裂驱动蛋白样蛋白2（MKLP2）两者H3T3ph的去磷酸化使CPC移居从内着丝粒的中心轴，赤道皮层，和船体中部加速正确和时间胞质21，47，48岁。因为H3T3ph和H3R2me2a会在后期发作时降低（图 1a，6a），我们调查了PRMT6活性的破坏是否影响晚期有丝分裂中的CPC水平。PRMT6耗尽或抑制在中心心轴和船体中部显著减少CPC信号，并最终导致双核或多核细胞（图 6B-E ，补充图 12，13）。为了进一步确认该缺陷是否是由于H3R2me2a不足引起的，我们转染了H3 R2A或R2K突变体，发现在PRMT6耗尽的细胞中观察到相同的细胞动力学缺陷（图 6f）。），表明H3R2me2a在早期有丝分裂中充当CPC的停靠位点，并且其耗竭导致染色体上CPC的水平降低，因此在有丝分裂晚期也是如此。因此，PRMT6的耗尽会导致有丝分裂进程的严重缺陷，例如多极纺锤体，未对齐的染色体，染色体滞后，双核的形成以及纺锤体装配检查点蛋白（包括Mad2和BubR1）的减少（补充图 14a– ë），这是令人想起CPC缺陷细胞的表型的49，50（补充图 15A，b ）。
a图像是z堆代表性细胞的最大投影，这些细胞已染色H3R2me2a（红色）和DNA（蓝色）。箭头和箭头分别指向中期和后期染色体。b – d用siRNA或PRMT6抑制剂处理HeLa细胞，并量化了三个独立实验的后期阶段CPC成分的水平（n = 30个后期阶段细胞）。CPC（绿色），β-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）。e计数并绘制出耗尽PRMT6的HeLa细胞中双核或多核细胞的比例（n =来自三个独立实验的300个间期细胞）。F计数并绘制转染Flag-histone H3 WT或突变体的HeLa细胞中双核或多核细胞的比例（n =来自三个独立实验的300个间期细胞）。误差线，SEM。比例尺，5μm。源数据作为源数据文件提供。（学生的t检验* p <0.01）。
为了检查H3R2me2a的病理生理意义，我们使用组织微阵列（TMA）评估了人类乳腺癌患者组织中H3R2me2a的修饰（补充图 16a）。尽管两组H3R2me2a水平高或低的非三阴性乳腺癌组织（non-TNBC）均无统计学差异，但高H3R2me2a组的TNBC患者的总生存率高于低H3R2me2a TNBC患者组（图 7a）。此外，高H3R2me2a组在TNBC和非TNBC队列中均显示出较高的无病生存率（图 7b）。由于CPC中的Aurora B已被证明可在许多生物中赋予H3S10磷酸化有丝分裂染色体完整性36，49，51，52，53，H3S10ph水平可以作为CPC的功能的读出。与我们的细胞生物学数据一致，在低H3R2me2a TNBC组中观察到H3S10ph水平降低，而在相应的非TNBC组中则未观察到（图 7c–e），这表明PRMT6介导的H3R2me2a与染色体完整性相关以及TNBC的临床攻击性。
a，b 对高（染色评分为2-3）和低（染色评分为0-1）组中人乳腺癌患者组织（n = 405）的TMA的临床病理特征进行定量和绘图。c – e在410例人类乳腺癌患者组织和正常相邻组织中对H3S10ph进行免疫组织化学染色。量化并绘制中期细胞中的H3S10ph强度（ 对于TNBC 中的低H3R2me2a组织，n = 327个中期细胞;对于TNBC中的高H3R2me2a组织，n = 627个中期细胞; 对于低H3R2me2a和n，n = 245个中期细胞） =非TNBC中高H3R2me2a组织的366个中期细胞）。箭头指向中期细胞。误差线，SEM。f建议的CPC定位和染色体缩合的组蛋白标记之间的串扰模型。比例尺，50μm。源数据作为源数据文件提供。（学生的t检验* p <0.01）。
CPC通过在整个细胞周期54中基于组蛋白标记改变其在不同停靠位点的定位，从而将Aurora B的激酶活性限制在及时和适当的底物上。在分裂间期，HP1结合到相邻的H3K9me3并在近着丝粒异染色质募集INCENP 55，56。在早期的有丝分裂，Plk1的活化诱导单激酶介导的H3T3ph，这反过来，浓缩物在CPC经由直接存活的结合着丝粒14，15。中共从染色体经由H3T3的去磷酸化释放的后期发作和经由INCENP和Aurora B的相互作用与MKLP2传递到中心轴21，47，48。然而，在着丝粒定位之前在有丝分裂染色体臂上募集CPC的潜在机制尚未完全阐明。此外，还不清楚CPC是如何从染色体臂转移到着丝粒的，以及CPC是如何从H3R2me2a释放并转移到着丝粒的H3T3ph的。尽管存活蛋白在体外显示出对H3T3ph和H3R2me2aT3ph的强结合亲和力（图 5j），但是CPC复合物在体内有效地与H3R2me2a和H3T3ph结合而不与H3R2me2aT3ph结合（图 5l）。H3R2me2a均匀分布在整个染色体臂上，而H3T3ph则集中在着丝粒上。此外，Haspin通过与Pds5B 31的相互作用仅限于着丝粒并且其抑制作用会导致CPC积累在染色体臂14上（图 4a，d），似乎会产生从着丝粒到染色体臂的H3T3ph梯度。根据我们的体外分析结果，PRMT6和Haspin均从H3T3ph和H3R2me2a生成H3R2me2aT3ph（图 5b，d）， 分别。在这方面，H3R2me2aT3ph可能存在于着丝粒周围，并促进CPC从染色体臂到着丝粒的重新定位。我们还发现PRMT6介导的H3R2me2a将CPC定位在H3S10ph的染色体臂上，然后在后期开始时被脱甲基，以将CPC迁移到中心纺锤体。因此，我们的发现表明PRMT6介导的H3R2me2a在CPC靶向染色体臂以及随后转移至着丝粒和中心纺锤体中起着关键作用（图 7f）。因为时空复杂性和染色体缩合的机械冗余的，这种现象仍会发生在没有CPC在若干物种的36，49，57，58。
多年以来，人们一直认为蛋白质甲基化是不可逆的，因为组蛋白的半衰期和其中的甲基化残基大约相等59。然而，一些蛋白质赖氨酸脱甲基酶，包括赖氨酸-特异性脱甲基酶-1（KDM1）和家族含有-domain-，一直是十文字C（JmjC结构）发现60，61。精氨酸脱甲基酶的存在是仍存在争议，因为推定的精氨酸脱甲基酶，JMJD6，被证明是一个赖氨酸羟化酶5，62。最近，还显示某些赖氨酸脱甲基酶，例如KDM3A，KDM4E和KDM5C在体外具有蛋白质精氨酸脱甲基酶活性63。这些发现表明，蛋白质甲基化是动态调节的，并且可逆地调节蛋白质功能。我们的结果也暗示了精氨酸甲基化是一种动态修饰的概念，因为H3R2me2a在后期开始时会大大降低。与可逆翻译后修饰（PTM）通常与其他类型的PTM相互作用以修饰细胞景观的方式相似，H3R2me2a通过与H3S10ph和H3T3ph结合起作用，实现了忠实的染色体分离。
我们的研究表明，Aurora B在染色体臂上读取PRMT6介导的H3R2me2a，在其中磷酸化H3S10以完成染色体缩合，而Survivin与Haspin介导的着丝粒H3T3ph结合，将CPC集中在着丝粒上（图 7f）。这些结果为PRMT6活性的及时和及时调节通过组蛋白精氨酸甲基化赋予有丝分裂染色体精确的遗传遗传机制提供了分子方面的见识。
GFP标记的PRMT6质粒购自MT Bedford，Flag标记的组蛋白H3表达载体购自OriGene（Rockville，MD）。根据制造商的规程，使用Muta-direct TM定点诱变试剂盒（iNtRON BIOTECHNOLOGY，韩国城南市）生成组蛋白H3的点突变体（R2A，R2K或S10A）或PRMT6甲基转移酶致死型（KLA）26。。为了产生GFP-LacI-PRMT6载体，将人PRMT6基因的PCR产物克隆到GFP-LacI载体（pKG215，Addgene，Watertown，MA）中。
先前已产生兔抗GFP抗体64。对于Western印迹，使用了针对以下抗体的抗体（克隆名称，稀释度，制造商和目录号在括号中）：Flag（M2，1：1000，Sigma Inc，F1804），β-actin（AC-15，1：1000， Sigma Inc.，A5441），α-微管蛋白（B-5-1-2，1：1000，Sigma Inc.，T6074），H3T3ph（EP1702Y，1：10000，Abcam，ab78351），H3S10ph（E173，1：10000 ，Abcam，ab32107），INCENP（1：1000，Abcam，ab12183），Survivin（EP2880Y，1：1000，Abcam，ab78351），H4K16ac（EPR1004，1：10000，Abcam，ab109463），H3S28ph（E191，1：10000 ，Abcam，ab32388），Hsp90（4F10，1：1000，圣克鲁斯生物技术有限公司，sc-69703），极光B（H-75，1：1000，圣克鲁斯生物技术有限公司，sc-25426），p38 MAPK（ N-20，1：1000，圣克鲁斯生物技术有限公司，sc-728），细胞周期蛋白A（B-8，1：1000，圣克鲁斯生物技术有限公司，sc-271682），细胞周期素B（H-20，1：1000 ，圣克鲁斯生物技术有限公司（sc-594），细胞周期蛋白E（HE12，1：1000，GTX213111-01）。未经处理的污点和凝胶原始扫描作为Source Data PDF文件提供。为了进行免疫染色，使用了针对以下抗体的抗体（克隆名称，稀释度，制造商和目录号在括号中）：标志（M2，1：100，Sigma Inc，F1804），H3T3ph（EP1702Y，1：1000，Abcam，ab78351）， H3S10ph（E173，1：500，Abcam，ab32107），INCENP（1：100，Abcam，ab12183）和Survivin（EP2880Y，1：100，Abcam，ab78351），Aurora B（H-75，1：100，圣克鲁斯Biotechnology Inc.，sc-25426），H3R2me2a（1：200，Merck Millipore，07-585），Hec1（9G3.23，1：100，GeneTex Inc，GTX70268），Mad2（1：100，Thermo Scientific Pierce抗体， PA5-21594），Sgo1（1：50，Thermo Scientific Pierce抗体，PA5-30869），Sgo2（1：50，Atlas抗体，HPA035163），Bub1（1：100，Invitrogen，MA1-5755），组蛋白H2A T120ph（ 1：100，Active Motif，39391），CENP-C（1:50，
对照siRNA是5'-CGTACGCGGAATACTTCGATT-3'。使用了以下PRMT6 siRNA序列：PRMT6-A：5'GGAUACAGCGUGCUUAUUAUUU 3'和PRMT6-B：5'GUGUGAAUCUUGUUAUCAAUU 3'。siPRMT6-A通常用作siPRMT6。人Aurora B激酶的siRNA序列如下：5'UAACUGUUCCCUUAUCUGUUUUCTA 3'。INCENP siRNA序列如下：5'GAGGAUAUCUUCAAGAAGAUU 3'。补充表1提供了本研究中使用的引物的详细信息 。
HeLa和MCF7细胞获自ATCC，并在补充有10％胎牛血清（FBS，Invitrogen），100单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素（Invitrogen）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，WelGENE Inc.）中培养。将电池保持在37°C的含5％CO 2的潮湿气氛中。通过PCR检测所有细胞系支原体污染为阴性。使用DharmaFect 1（Dharmacon，Inc.）将siRNA转染到HeLa细胞中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）进行DNA转染。为了进行抑制实验，将细胞与Haspin激酶抑制剂CHR-6494（10 nM）（Calbiochem），Aurora B抑制剂橙皮苷（2μM）（Selleckchem），Cdk1抑制剂RO3306（1μM）（Enzo Life Sciences）一起孵育，蛋白酶体抑制剂MG132（0.5μM）（Sigma-Aldrich）和PRMT6抑制剂MS023（20μM）（Sigma-Aldrich）。
将盖玻片上的HeLa细胞在-20°C下用甲醇固定30分钟。或者，用BRB80-T缓冲液（80 mM PIPES，pH 6.8，1 mM MgCl 2，5 mM EGTA和0.5％Triton X-100），然后在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。固定的细胞在室温下用PBS-BT（1×PBS，3％BSA和0.1％Triton X-100）渗透和封闭30分钟。然后将盖玻片与在PBS-BT中稀释的一抗和二抗一起孵育。使用ZEN2软件（德国卡尔·蔡司）在Zeiss Axiovert 200 M显微镜下，使用1.4 NA plan-Apo×100油浸镜头和HRm CCD相机获取图像。使用AutoDeblur v9.1和AutoVisualizer v9.1（AutoQuant Imaging）获得解卷积图像并进行分析。插图显示了框状区域的单个焦平面。在所有通道的恒定曝光时间下采集面板中的所有图像。为了消除每个标记区域的大小差异，从所选区域获得平均强度。在扣除背景后，将所需通道的平均强度相对于相应CREST的平均强度进行归一化。对于未用着丝粒标记染色的细胞，使用AutoDeblur软件通过在最大投影图像上的CPC强度周围画圈来量化CPC强度，并减去平均背景强度值。对于荧光强度图，所有强度均通过对照进行归一化，并绘制为相对强度。通过使用AutoDeblur软件在最大投影图像上的CPC强度上画圈来量化CPC强度，然后减去平均背景强度值。对于荧光强度图，所有强度均通过对照进行归一化，并绘制为相对强度。通过使用AutoDeblur软件在最大投影图像上的CPC强度上画圈来量化CPC强度，然后减去平均背景强度值。对于荧光强度图，所有强度均通过对照进行归一化，并绘制为相对强度。
为了进行延时显微镜，将稳定表达GFP-H2B的HeLa细胞培养在Leibovitz的L-15培养基（Invitrogen）中，该培养基中添加了10％FBS（Invitrogen）和2 mM L-谷氨酰胺（Invitrogen）。将细胞置于加热至37°C的密封生长室中，并使用带有×20透镜的Zeiss Axiovert 200 M显微镜进行观察。使用AxioVision 4.8.2（Carl Zeiss），每三分钟采集一次图像，持续5 h。测量了前中期（从核包膜破裂（NEB）到中期板最初形成）和中期（从中期板最初形成到后期开始）的持续时间。
对于共聚焦延时显微镜，将稳定表达GFP-CenpA的HeLa细胞用对照siRNA或siPRMT6转染，并置于加热至37°C的密封生长室中。在带有×63油浸透镜的LSM 700共焦显微镜（Carl Zeiss）下，使用ZEN软件（Carl Zeiss）以1秒的间隔60秒获取图像。
使用商业化的全息照相显微镜（HT-1S，Tomocube Inc.，韩国）重建单个有丝分裂细胞的三维（3-D）折射率（RI）分布，该显微镜采用光学衍射层析成像（ODT）。马赫曾德尔干涉仪用于测量样品中的复杂光场。准直激光束（λ 532 nm）被2×2光纤耦合器分成两个臂。一只手臂用作参考光束。另一只手臂以各种照明角度照亮了舞台上的有丝分裂细胞。数字微镜设备（DMD）可以精确控制照明光束的角度。来自样品的衍射光束通过物镜（NA = 0.8）和套筒镜收集。样品臂和参考臂在相机平面处发生干涉，以生成空间调制的全息图，并由高速相机记录下来。记录的全息图用于从各种入射角检索样品的复杂光学场。根据实测光场，使用基于傅里叶绕射定理65的ODT算法重建样品的3-D RI分布。有关实验装置和ODT的详细信息，请参见其他地方66。
单个细胞的重建3-D RI分布提供了定量的生化和结构参数，包括细胞以及亚细胞器的体积，浓度和干重。为了分别测量有丝分裂细胞内的细胞质和染色体的定量生物学参数，通过RI阈值对细胞质和染色体进行目测检查。通过整合分割区域中的所有体素来计算细胞质和染色体的体积。在生物样品中，RI值与生物样品中材料的浓度成线性比例，即n（x，y，z） = n m + αC（x，y，z），其中n（x，y，z）是样品的3-D RI分布，n m是周围介质的RI值（ 在λ = 532 nm处，n m = 1.337 ），α是RI增量（ 对于蛋白质砂核酸，α = 0.190 ml / g ），C（x，y，z）是材料的浓度。因此，从样品的测量的3-D RI分布直接计算出细胞质和染色体的浓度，并且还通过对计算出的浓度进行积分来计算细胞质和染色体的干质量。
对于体外肽下拉试验，将1μg的每种H3肽（未修饰的H3R2me2a，H3T3ph或H3R2me2aT3ph）与20μl的抗生蛋白链菌素-琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）孵育2小时。 4°C。用结合缓冲液（50 mM Tris（pH 7.5），150 mM NaCl，0.1％NP-40）洗涤3次后，将肽珠复合物分别与200 ng重组Aurora B，Survivin或Borealin蛋白一起孵育， 300μl结合缓冲液。用结合缓冲液洗涤3次后，通过添加Laemmli样品缓冲液使珠粒变性，并在95°C下煮沸5分钟。通过蛋白质印迹分析样品。为了进行体内分析，将HeLa细胞用100 ng / ml诺考达唑处理24 h，然后收获。如上所述，将细胞裂解液（约500μg总蛋白）与等量的每种H3肽-珠复合物温育。或者，在使用siRNA耗尽Aurora B 72小时后，将HeLa细胞用100 ng / ml诺考达唑处理24 h。然后，在4°C过夜，向细胞裂解液中补充100 ng重组Borealin和Survivin蛋白，并结合或不结合100 ng重组Aurora B蛋白。将混合物用抗INCENP抗体免疫沉淀，然后将沉淀的微珠与50μlTBS-T（0.1％Tween 20 / TBS）中的1μgH3R2me2a肽在4°C下孵育2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 使用siRNA耗尽Aurora B 72小时后，将HeLa细胞用100 ng / ml诺考达唑处理24 h。然后，在4°C过夜，向细胞裂解液中补充100 ng重组Borealin和Survivin蛋白，并结合或不结合100 ng重组Aurora B蛋白。将混合物用抗INCENP抗体免疫沉淀，然后将沉淀的微珠与50μlTBS-T（0.1％Tween 20 / TBS）中的1μgH3R2me2a肽在4°C下孵育2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 使用siRNA耗尽Aurora B 72小时后，将HeLa细胞用100 ng / ml诺考达唑处理24 h。然后，在4°C过夜，向细胞裂解液中补充100 ng重组Borealin和Survivin蛋白，并结合或不结合100 ng重组Aurora B蛋白。将混合物用抗INCENP抗体免疫沉淀，然后将沉淀的微珠与50μlTBS-T（0.1％Tween 20 / TBS）中的1μgH3R2me2a肽在4°C下孵育2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 在4°C过夜，向细胞裂解液中补充100 ng重组Borealin和Survivin蛋白，并结合或不结合100 ng重组Aurora B蛋白。将混合物用抗INCENP抗体免疫沉淀，然后将沉淀的微珠与50μlTBS-T（0.1％Tween 20 / TBS）中的1μgH3R2me2a肽在4°C下孵育2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 在4°C过夜，向细胞裂解液中补充100 ng重组Borealin和Survivin蛋白，并结合或不结合100 ng重组Aurora B蛋白。将混合物用抗INCENP抗体免疫沉淀，然后将沉淀的微珠与50μlTBS-T（0.1％Tween 20 / TBS）中的1μgH3R2me2a肽在4°C下孵育2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 1％Tween 20 / TBS）在4°C下放置2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH 1％Tween 20 / TBS）在4°C下放置2小时。用TBS-T洗涤3次后，对磁珠进行蛋白质印迹分析。组蛋白H3肽具有以下序列：H3，ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（Biotin）-NH2; H3R2me2a，A-Rme2a-TKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（生物素）-NH 2 ; H3T3ph，AR-Tph-KQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（生物素）-NH 2；H3R2me2aT3ph，A-Rme2a-Tph-KQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK（生物素）-NH 2。
通过抗GFP免疫沉淀从转染的293 T细胞中纯化出GFP-PRMT6。然后将PRMT6与50μl反应缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.5），150 mM NaCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF和1 mM二硫苏糖醇（DTT））孵育，并补充1μg生物素化的H3肽和1μCi的3 [H]标记的AdoMet（55-85 Ci / mmol，PerkinElmer）在37°C下放置1 h。将生物素化的肽在十二烷基硫酸钠（SDS）-Tricine凝胶上分离，然后转移到PVDF膜上。通过用EN 3 HANCE（PerkinElmer）处理膜增强了signal信号。将膜在-80°C下暴露于放射自显影胶片至少1周。
对于Aurora B激酶测定，根据制造商的说明，使用改良的Aurora B激酶系统（Promega，Madison，WI）确定Aurora B激酶活性。用水（30 ng和100 ng）稀释Aurora B酶；添加到组蛋白H3肽（未修饰的H3或H3R2me2a），10μMATP和1 mM DTT的激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 7.5），5 mMβ-甘油磷酸，0.1 mM Na 3 VO 4和10 mM中MgCl 2），然后在室温下孵育60分钟。将样品在Laemmli样品缓冲液中煮沸3分钟，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）解析。
在单激酶激酶测定，人重组单激酶激酶（每个反应40纳克）用1μg生物素化H3肽和1微居里[γ孵育32 P] -ATP（3000次/毫摩尔）在50微升激酶缓冲液（的25mM的Tris-HCl（pH为7.5），2mM的DTT，10毫摩尔MgCl 2，5mM的β甘油磷酸，和0.1mM的Na 3 VO 4）中30分钟，在37℃。掺入32峰值到H3肽通过SDS-PAGE和放射自显影显示。
使用双胸腺嘧啶阻断法使细胞在G1期晚期同步化。简而言之，将胸苷以2 mM的终浓度添加至贴壁细胞，并将细胞培养18小时。除去胸腺嘧啶核苷并在新鲜培养基中温育9小时后，再将胸苷加入终浓度为2 mM的溶液中保持17小时。除去胸腺嘧啶核苷后，将同步细胞在新鲜培养基中培养，并在不同时间点收集细胞周期和蛋白质印迹分析。备选地，通过诺考达唑处理16小时使细胞在前中期同步，然后通过在新鲜培养基中温育来释放该阻断。
从诺考达唑处理的有丝分裂细胞中分离出有丝分裂染色体67。简言之，将细胞再悬浮（3.2×10 6个细胞）在缓冲液A（10mM的HEPES，[pH值7.9]，10mM的氯化钾，1.5毫摩尔MgCl 2，0.34M的蔗糖，10％甘油，1mM DTT，5μg/ ml的亮肽素，1μg/ ml胃抑素A，1μg/ ml PMSF，10μg/ ml抑肽酶，0.5μM微环蛋白）。加入Triton X-100（0.1％），并将细胞在冰上温育8分钟。通过离心（4分钟，1300× g，4°C）收集沉淀中的核 。用缓冲液A洗涤一次后，将核在缓冲液B（如上所述的3mM EDTA，0.2mM EGTA和1mM DTT，蛋白酶抑制剂）中裂解。离心收集不溶性染色体部分（4分钟，1700× g），4°C）并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。
从首尔国立大学Boramae医学中心（韩国）获得了包含420个人类乳腺癌患者组织样本和匹配的正常相邻组织样本的乳腺癌组织阵列。根据制造商的指示，使用Ventana Ultra自动免疫组织化学玻片染色系统（Ventana，图森，亚利桑那州，美国）对福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学分析，以检测PRMT6，H3R2me2a和H3S10ph。用于检测PRMT6的一抗的浓度为1：3000。免疫染色的组织得分为_ENREF_30_ENREF_72 68。如下将染强度指定为4分制（强度得分）的任意值：未染（0），弱染（1），中染（2），强染（3）。为了分析总生存期和无病生存期，将每种疾病的持续时间分别定义为因任何原因从手术到死亡的时间以及任何类型的从手术到复发的时间。Kaplan-Meier估计器用于分析生存率，对数秩检验用于确定两条生存曲线之间差异的显着性。所有统计分析都是使用IBM SPSS Statistics版本20.0（IBM Inc.，Armonk，NY，美国）进行的。小于0.05 的双面p值被认为具有统计学意义。
如图所示，使用GraphPad Prism软件使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较检验或两尾t检验进行统计分析。误差棒代表几个独立实验的平均值（SEM）的标准误差。甲p的<0.05（双尾）值被认为是统计学显著。
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