摘要
凋亡诱导因子（AIF）已被证明是缺氧缺血（HI）后未成熟大脑神经元丢失的主要因素。实际上，具有引起AIF表达降低的亚型突变的小鼠受到了新生儿HI的保护。为了进一步研究这种神经保护作用的可能分子机制，我们通过将编码标记的AIF蛋白的潜能转基因引入Rosa26位点，然后通过遍在表达的Cre重组酶对其进行条件激活，来产生AIF敲入小鼠。这样的AIF转基因小鼠在mRNA（高5.9倍）和蛋白质水平（高2.4倍）上都表达AIF促凋亡剪接变体（AIF1），但在大脑特异性AIF剪接异构体（AIF2）上却过表达。过量的AIF对小鼠的表型或生理功能没有任何明显的影响。然而，免疫组织化学表明，过表达AIF的小鼠会加剧新生儿HI后的脑损伤（灰色和白色物质），并伴随线粒体AIF向核的易位以及某些大脑区域caspase-3活化的增强，如免疫组织化学所示。总而言之，这些发现证实了先前的研究，表明AIF在新生儿HI脑损伤中起因果作用。
缺氧缺血性脑病（HIE）是一种严重的中枢神经系统损伤，由于围生期窒息而在新生儿中表现出来。HIE是新生儿死亡和严重且毁灭性的终生残疾（例如足月和早产儿1的脑瘫，神经感觉缺陷和认知障碍）的重要原因1。在发达国家，HIE的发病率范围为每千名活产1至8名，在不发达国家中，这一数字高达每千名活产26名1。HIE占全球所有新生儿死亡的22％2。低温治疗已被广泛实施，适度提高的结果在足月儿3，4。促红细胞生成素治疗也表明在这两种术语和早产婴儿显着的神经保护5，6，7。然而，低温疗法仅限于足月婴儿，并且促红细胞生成素治疗的机会之窗仍不清楚。因此，为了发展预防和治疗新生儿脑损伤的新策略，有必要更好地了解HI后神经元细胞死亡和脑损伤的机制。
新生儿大脑特别容易受到氧化损伤，原因是耗氧率提高，抗氧化剂浓度低以及氧化还原活性铁8的可用性。因此，氧化应激，兴奋性毒性，炎性反应，以及若干不同细胞死亡途径，包括凋亡，坏死，程序性坏死，ferroptosis，和自噬激活，HI后通常发生在新生儿脑9，10，11，12。由于细胞凋亡对于正常的大脑发育至关重要，并决定了中枢神经系统的大小和形状10，所以新生大脑比成年大脑更容易受到这种细胞死亡途径的影响13。。因此，凋亡被认为是与新生儿HI 14相关的神经元细胞损失的重要部分。
AIF是位于线粒体膜间空间黄素和在控制细胞存活和死亡的双重角色15，16。自从被发现，AIF在细胞凋亡过程中的作用已被广泛研究17，18。在响应促凋亡信号时，AIF从线粒体转运到细胞核，与DNA相互作用并刺激染色质浓缩以及高分子量DNA断裂19。AIF在细胞质中合成，然后导入线粒体膜间空间，在此需要维持线粒体形态和and结构20。线粒体的形态是由细胞器裂变和融合21之间的平衡动态控制的，这种动态平衡可以被AIF缺乏22破坏。研究表明，线粒体动态可HI损伤未成熟脑，在成人大脑缺血/再灌注被打乱18，23，24，25，26，27。因此，线粒体动力学可能与HI诱导的脑损伤的病理生理过程有关。我们以前的研究表明，AIF是一个主要贡献者神经元丧失新生儿大脑HI诱导17，28。丑角小鼠，其承担的一个减效突变AIF基因造成〜减少AIF蛋白水平80％，缺血性脑损伤模型的经验显著神经保护17，29。然而，一直争论不休无论是AIF易位到细胞核的减少或占了丑角减少小鼠的神经细胞死亡的线粒体呼吸活动的下调14，17，29。的确，AIF缺乏会导致氧化磷酸化的缺陷，从理论上讲，它可能会降低HI 30的有害活性氧（ROS）的产生。。为了进一步确认AIF对神经元细胞死亡的影响，我们通过将潜伏的转基因（被Lox-Stop-Lox盒灭活）引入编码了AIF蛋白的潜能转基因进入Rosa26基因座，从而产生了AIF敲入小鼠Cre重组酶在普遍存在的肌动蛋白启动子控制下表达条件性激活。通过使用过表达AIF的转基因小鼠，我们调查了AIF对HI后新生儿脑损伤的影响和潜在的分子机制。我们发现，HI后AIF过表达加重了新生儿脑损伤。
根据是否表达了Aif基因的外显子2a或2b，已鉴定出AIF的两种同工型。AIF1（使用外显子2a）是第一个被描述的，是最丰富和普遍存在的同工型，而AIF2（使用外显子2b）仅限于中枢神经系统，因此被称为脑特异性同工型31。AIF2比AIF1更牢固地锚定在线粒体内膜上，并且我们先前表明，在新生儿HI 32模型中，AIF2的缺乏会加剧脑损伤。相反，在相同条件下，减少AIF1表达可减少神经元细胞的流失17。基于这些考虑，我们首先研究了哪种AIF亚型将在转基因小鼠中过表达。通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）测定出生后第9天WT和AIF Tg小鼠大脑中Aif1和Aif2 mRNA转录本的相对丰度。在生理条件下，在P9时，AIF Tg小鼠的Aif1 mRNA表达比野生型小鼠高5.9倍（图1b）。相比之下，WT和AIF Tg小鼠之间的Aif2 mRNA表达没有显着差异（图1c）。与野生型对照相比，在AIF Tg小鼠中检测到两个AIF蛋白条带，较高的条带是带有FLAG标签的转基因AIF（FLAG-AIF），其分子量较高，因此可以与内源性AIF区别开来。由较低的乐队代表。（图1d）。在P9时，AIF Tg的总AIF蛋白丰度比野生型小鼠高2.4倍（图1e））。其他线粒体相关蛋白，包括卷曲螺旋-螺旋-螺旋-螺旋-螺旋结构域蛋白4（CHCHD4），细胞色素C氧化酶亚基I（COX1），细胞色素C（CYTC），线粒体内膜的外周蛋白（其作为呼吸链的复合物III和复合物IV之间的必需电子穿梭，但在线粒体后半胱天冬酶激活中也起着重要作用），超氧化物歧化酶2（SOD2），电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和线粒体与生物发生有关的蛋白质，包括过氧化物酶体增殖物激活的受体γ辅激活物1-alpha（PGC1α）和转录因子A，线粒体（TFAM），在WT和AIF Tg小鼠的P9点无差异（图1d，f）。为了进一步评估AIF Tg小鼠大脑中的氧化磷酸化，测量了线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）复合体I的活性。该活性表现出向AIF Tg小鼠无明显增加的趋势（图1g）。AIF Tg小鼠通常存活超过1岁，没有出现任何主要的表型或行为改变。在P9或12个月大的WT和AIF Tg小鼠中，未发现体重有显着差异（图1h，i）。在1岁的小鼠中确定了神经元增殖标志物doublecortin（DCX），它是由神经元前体细胞表达的微管相关蛋白。AIF Tg小鼠的齿状回颗粒层DCX阳性细胞密度高于WT小鼠（p = 0.006）（图1j，k）。
a整个研究的时间表，包括样品采集时间点和在不同时间点进行的实验。b 在生理条件下，在P9时，与WT小鼠相比，AIF Tg小鼠中Aif1 mRNA表达上调（5.89±0.80对1.00±0.08，n = 6 /组，*** p < 0.001）。c WT和AIF Tg小鼠在P9时Aif2 mRNA表达没有显着差异（1.00±0.11对0.93±0.09，n = 6 /组，p = 0.227）。dP9 WT和AIF Tg小鼠皮质组织线粒体部分的代表性免疫印迹。在AIF Tg小鼠中观察到比内源性AIF（AIF的下部带）更多的外源性AIF（AIF的上部带）。e与野生型WT小鼠（一条带）相比，AIF Tg小鼠（两条带）的总AIF蛋白表达显着增加（分别为2.44±0.13和1.00±0.17，n = 6 /组，*** p <0.001），但内源性AIF表达没有显着差异（分别为1.08±0.14和1.00±0.31，n = 6 /组，p = 0.5577）。F在生理条件下，WT和AIF Tg小鼠之间的某些线粒体相关蛋白（CHCHD4，COX1，CYTC和SOD2）的半定量未显示任何显着差异（n = 6 /组）。克 OXPHOS复合物I活性在P9 WT和AIF Tg小鼠的皮层组织的线粒体级分确定，并且没有显著差异（13.04±3.32 14.05对比±2.58，Ñ = 6 /组，p = 0.5677）。h WT和AIF Tg小鼠的P9小鼠幼崽体重无显着差异（分别为5.06±0.82 g和5.28±0.74 g，n = 54 /组，p = 0.1407）。一世WT和AIF Tg小鼠在1岁时的体重无显着差异（分别为40.18±8.04 g和43.61±9.13 g， WT小鼠为n = 8 ，AIF Tg小鼠为n = 13，p = 0.393 ）。j AIF Tg小鼠齿状回颗粒层中DCX阳性细胞密度在1岁时显着高于野生型小鼠（3.93±0.66细胞/mm,5.15±0.71细胞/ mm，n = 8 WT小鼠， AIF Tg小鼠中n = 6，** p <0.01）。k WT和AIF Tg小鼠在一岁时齿状回区域DCX染色的代表性图片。黑色箭头表示阳性细胞。
为了进一步研究AIF的过表达是否在生理条件下对mRNA转录组有影响，通过RNA测序确定了来自皮层的六个P9雄性小鼠脑组织的转录组。即使使用宽松的标准p <0.05，数据分析也显示，与WT小鼠相比，AIF Tg小鼠中总共21,762个基因中只有369个差异表达（图2a）。在这369个基因中，有183个上调而有186个下调。在三种本体论（分子生物学功能，细胞成分和生物学过程）中，对差异表达基因（DEG）进行了基因本体论（GO）术语分类，但在前十个分类的GO术语中未发现具体术语（图2b））。
一张火山图，显示了WT雄性小鼠和AIF Tg雄性小鼠之间的DEG（n = 6 /组）。负log10转换的调整p值（Padj）检验了WT和AIF Tg雄性小鼠之间表达水平无差异的零假设（Y轴），并针对表达的平均log2倍变化（X轴）作图）。非显着表达的基因以灰色绘制（p <0.05用于过滤器，并由与X平行的虚线表示-轴）。显着上调和下调的基因分别以红色和蓝色绘制（总共21,762个基因中的369个，上调183个基因，下调186个基因）。平行于Y轴的两条虚线表示绝对log2倍数变化等于0.2。b在三种本体中排名前十的GO分类术语。根据DEG（总共369个基因）进行GO分类。该X -轴表示DEGS的数量，和ÿ -轴表示GO术语。
HI后72小时，通过免疫组织化学染色评估脑组织中灰质（MAP2，微管相关蛋白2）和白质（MBP，髓磷脂碱性蛋白）的标记，评估HI对新生小鼠的脑损伤。如脑冠状切片的MAP2染色所示，损伤包括皮质，海马，纹状体和丘脑，AIF过表达显着增加了HI后脑损伤的严重程度（图3a）。如梗死体积所示，灰质损伤的程度增加了74.6％，从WT小鼠的7.32±6.25 mm 3到AIF Tg小鼠的12.78±8.89 mm 3（p = 0.0154）（图3b））。在雄性和雌性AIF Tg小鼠之间没有发现显着差异（分别为13.62±9.30 mm 3和11.71±8.66 mm 3，p = 0.7907）。与野生型对照相比，AIF Tg小鼠的总神经病理学评分明显更高（p <0.001）（图3c）。在所有观察到的大脑区域，特别是在皮质，海马和纹状体中，AIF过表达会增加HI诱导的脑损伤（图3d）。HI后72 h通过MBP染色观察皮层下白质的髓鞘形成（图3e）），HI后72小时与WT小鼠相比，AIF Tg小鼠同侧半球皮层下白质的总损失量更大（p = 0.0107）（图3f）。然而，在AIF Tg小鼠中，雄性和雌性之间没有发现差异。
HI后72 h，来自WT和AIF Tg小鼠的海马背侧海马（左图）和纹状体（右图）水平的冠状脑切片的代表性MAP2染色。b WT和AIF Tg小鼠在HI后72小时测量梗死体积（分别为7.32±6.25 mm 3 vs. 12.78±8.89 mm 3，n = 25 /组，包括14只雄性和11只雌性。* p < 0.05 ）。c在WT和AIF Tg小鼠在HI后72小时评估总病理评分（分别为6.96±4.10和11.70±3.95，n = 25 /组，*** p <0.001）。d在WT和AIF Tg小鼠的不同大脑区域评估了病理评分，包括皮质（Cx，1.03±1.11 vs. 2.05±1.59，** p <0.01），海马（Hip，3.38±0.93 vs. 4.50）分别为±0.77，** p <0.01），纹状体（Str，2.43±1.48和3.56±1.03，分别为** p <0.01）和丘脑（Tha，分别为0.92±0.64和1.59±1.07）p = 0.1356）。e冠状脑切片的代表性MBP染色显示，HI后72 h，CL和IL半球皮层下白质中的髓磷脂结构。FHI后72小时，皮层下白质（SWM）的组织损失率的定量显示，与WT小鼠相比，AIF Tg小鼠的白质损失更多（分别为0.55±0.22 vs. 0.40±0.18，n = 25 /组，包括14位男性和11位女性（* p < 0.05）。
与成年大脑相比，未成熟脑细胞发生凋亡的倾向增强，涉及caspase依赖性和caspase依赖性途径。因此，两种途径的联合抑制作用提供了针对新生儿HI脑损伤的协同保护17。AIF是不依赖半胱天冬酶的凋亡细胞死亡途径的主要组成部分之一，在HI后24小时，AIF核易位在几个脑区域中显着增加（图4a）。AIF染色显示，AIF Tg小鼠的AIF阳性核数目在皮质中高3倍（p <0.001），在角膜氨化区1（CA1）中高1.8倍（p = 0.0368），高1.3倍在纹状体（p = 0.0299），而在ben状核 中则是野生型小鼠的3.1倍（p <0.001）（图4b–e）。为了澄清外源性AIF的核易位，用FLAG抗体，其能够识别转基因编码AIF蛋白（其标记有FLAG免疫染色®肽序列），进行（图4F）。使用AIF（绿色）/ FLAG（红色）抗体的免疫荧光染色证实，外源性AIF有助于HI诱导的核易位和凋亡细胞死亡（图4g）。
aIF 的代表性全景图显示了HI后24 h WT和AIF Tg小鼠的皮质和海马。b AIF染色图像的高倍放大显示HI后24 h WT和AIF Tg小鼠的皮质（Cx）区域（上图）和海马角膜氨化1（CA1）区域（下图）中的AIF阳性细胞核。Ç在WT和AIF Tg小鼠在第24小时在皮层AIF阳性细胞核HI后的定量（±80.4 30.7个/ mm 2对比239.2±91.8个/ mm 2，95％置信区间（CI）78.5-239.1，分别ñ = 8 /组，*** p <0.001）和CA1（101.1±54.6个/ mm 2对比186.1±78.4个/ mm 2，分别为95％CI 4.6–165.3，n = 8 /组，* p <0.05）。d高倍放大的AIF染色图像显示HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的纹状体（Str）（上图）和panels状细胞核（HN）（下图）中的AIF阳性细胞核。Ë AIF阳性核的定量在WT和AIF Tg小鼠在纹状体HI后24小时（122.8±21.8个/ mm 2对比163.7±42.6个/ mm 2，95％CI 49.9-131.8分别Ñ = 8 /组，* p <0.05）和缰核（126.6±100.0个/ mm 2对比392.7±106.6个/ mm 2，95％CI 175.3-357.0分别ñ = 8 /组，*** p <0.001）。f皮质中的FLAG染色显示外源性AIF在Tg小鼠中表达，而在WT小鼠中不表达（左图，WT-CL和Tg-CL），外源性AIF的核易位（右图，WT-IL和Tg -IL）。g AIF（绿色）和FLAG（红色）的免疫荧光染色显示在HI后24小时内源性AIF和外源性AIF的核易位（白色箭头指向受伤的细胞，红色箭头指向正常细胞）。
通过在HI后24小时对不同脑区域中的活性caspase-3进行免疫染色来研究caspase依赖性凋亡细胞死亡，这是caspase-3激活达到其峰值13时（图5a）。在观察到的大脑区域中，与野生型小鼠相比，AIF Tg小鼠的皮质和纹状体中caspase-3阳性细胞显着增加，但在CA1或or状核中未见明显变化（图5b-e）。活性Caspase-3阳性细胞的定量显示，与 WT小鼠相比，AIF Tg小鼠的皮质中的细胞（p = 0.0481）和纹状体中的细胞多1.6倍（p = 0.0012）（图5c，e）。同侧皮质中的Caspase-3活性显着增加，但在WT和AIF Tg小鼠之间未发现显着差异（图5f）。在HI后24小时通过免疫印迹法对聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）进行半定量。与对侧（CL）半球相比，劈开的PARP-1在同侧（IL）半球中显着增加（p <0.001），但在WT和AIF Tg小鼠的IL半球中没有发现显着差异（p = 0.7299） （图5g，h）。
HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠皮质和纹状体区域的代表性活性caspase-3染色。b活性caspase-3染色图像的高倍放大图显示，在HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的皮质（Cx）（上图）和海马CA1区域（下图）中的活性caspase-3阳性细胞。Ç在WT和AIF Tg小鼠活性胱天蛋白酶3阳性细胞的定量在皮质HI后24小时（156.1±50.6个/ mm 2对比254.3±106.7个/ mm 2分别，95％CI 1.0-195.4， ，n = 7 /组，* p <0.05）和CA1（1758.3±219.5格/ mm 2与1,739.8±252.7格/ mm 2，分别为95％CI −272.3–235.3，n = 8 /组）面积。d活性caspase-3染色的更高放大倍数，显示HI后24 h WT和AIF Tg小鼠的纹状体（Str）（上图）和and状核（HN）（下图）的活性caspase-3阳性细胞。È在WT和AIF Tg小鼠活性胱天蛋白酶3阳性细胞的定量在纹状体HI后24小时（770.4±85.5个/ mm 2对比938.1±80.3个/ mm 2分别，95％CI 78.8-256.7， ，ñ = 8 /组，** p <0.01）和缰核（205.7±69.6个/ mm 2对比235.5±97.9个/ mm 2，95％CI -61.4-120.9分别ñ = 8 /组）。f HI后24小时测量皮质组织中的caspase-3活性。该活性在IL半球中显着增加，但在WT和AIF Tg小鼠之间没有显着差异（n = 6 /组）。g WT和AIF Tg小鼠在HI后24小时，CL和IL半球皮层组织的核级分中PARP-1的免疫印迹和裂解的PARP-1。薄层蛋白B用作加载对照。h校正负荷对照后，对WT和AIF Tg小鼠的PARP-1和裂解的PARP-1定量没有显示任何显着差异（n = 5 /组）。
为了研究HI后AIF过表达对线粒体细胞死亡相关蛋白的影响，通过免疫印迹法在24岁时确定了皮质组织线粒体总AIF，FLAG-AIF，CHCHD4，COX1，SOD2和CYTC的蛋白表达。 HI后h（图6a）。将CL半球和IL半球进行比较，WT和AIF Tg小鼠的IL半球中AIF蛋白都减少了，并且这种减少在AIF Tg小鼠中更明显（p = 0.0284）（图6b）。AIF Tg小鼠在HI后从线粒体释放AIF。HI后24小时从线粒体中释放出约18％的转基因编码（FLAG阳性）AIF（p = 0.019）（图6c）。由于没有特异性抗体可识别这两种AIF亚型，因此我们使用RT-qPCR 在HI后24小时测量Aif1和Aif2的mRNA表达。与对照组相比，HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的Aif1 mRNA表达均显着上调（ WT小鼠p <0.001 ，AIF Tg小鼠p = 0.0160）。与之形成鲜明对比的是，WT和AIF Tg小鼠均显着下调了Aif2的表达（ WT小鼠p = 0.0031 ，AIF Tg小鼠p = 0.0352）（图6d）。定量线粒体相关蛋白CHCHD4（p = 0.5403），COX1（p = 0.1819），SOD2（p = 0.1902）和CYTC（p = 0.6159）在HI后24小时未发现WT和AIF Tg小鼠之间有任何显着差异。然而，WT和AIF Tg小鼠中，HI后，IL半球中CHCHD4表达增加（图6e）。亲环蛋白A（CYPA）是一种亲免蛋白，具有多种细胞内功能，包括信号传导，蛋白质运输和其他蛋白质的调节。CYPA参与脑缺氧缺血后神经元AIF的核易位33。WT和AIF Tg小鼠的IL半球中核部分的CYPA浓度均显着增加（p <0.001），并且CYPA在AIF Tg小鼠的核级分中的浓度显着高于WT小鼠（p = 0.0488）（图6f）。
HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的CL和IL半球皮质组织线粒体部分的AIF，FLAG，CHCHD4，COX1，SOD2和CYTC 的代表性免疫印迹。b在HI后24 h对WT和AIF Tg小鼠的CL和IL半球线粒体部分中的AIF蛋白进行定量分析（n = 6 /组）。在AIF Tg小鼠的IL中，线粒体的AIF降低更大。c HI后24小时，对AIF Tg小鼠的CL和IL半球线粒体部分中的FLAG-AIF蛋白进行定量分析（n = 6 /组）。FLAG-AIF在AIF Tg小鼠的IL中从线粒体中明显释放。d Aif1的mRNA表达HI后24小时，通过RT-qPCR在WT和AIF Tg小鼠的皮层组织中确定Aif2和Aif2。AIF1表达在WT和AIF Tg小鼠增加，但Aif2在WT和AIF的Tg小鼠（表达减少Ñ = 6 /组）。e HI后24小时，线粒体相关蛋白（CHCHD4，COX1，SOD2和CYTC）的定量未显示WT和AIF Tg之间有任何显着差异，但WT和AIF Tg小鼠的IL中CHCHD4表达增加（n = 6 /组）。FHI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的IL半球中皮质组织核部分的CYPA显着增加。在AIF Tg小鼠中增加更为明显（n = 6 /组）。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
线粒体的形态由细胞器融合与裂变之间的动态平衡决定，HI损伤会影响新生小鼠大脑中线粒体的动态27。为了研究AIF过表达对线粒体动力学的影响，裂变和融合相关蛋白磷酸动力蛋白相关蛋白1（P-DRP1），线粒体裂变1（FIS1），OPA1线粒体动力蛋白如GTPase（OPA1）的表达，在生理条件下，分别在P9 WT和AIF Tg小鼠中测定了丝裂霉素1和MFF1。发现这两种基因型之间没有显著变化（p = 0.3854用于P-DRP1，p = 0.6708为FIS1，p = 0.1313为OPA1，长形式p 对于简短形式的OPA1 = 0.4922，对于MFN1 ，p = 0.9470）（图7a，b）。在HI后24小时进一步确定裂变蛋白P-DRP1和FIS1的表达（图7c）。WT和AIF Tg小鼠的IL半球中P-DRP1的丰度降低，但这种差异并不明显。HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠体内的长形OPA1均减少，而AIF Tg小鼠中OPA1的丰富度大大降低。相反，两种基因型在HI后24小时，OPA1的短型和切割带显着增加（ WT和p的p = 0.0003 = 0.0206（对于AIF Tg）。比较CL和IL半球，HI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的MFN1表达也显着降低（WT的p = 0.0029 ，AIF Tg的p = 0.0025）。OPA1的短形式和裂解产物增加，而MFN1减少，这表明HI损伤后线粒体融合受到损害。但是，WT和AIF Tg小鼠在OPA1裂解和MFN1耗竭方面没有差异（图7d）。
在生理条件下，来自P9 WT和AIF Tg小鼠皮质组织的线粒体裂变蛋白（P-DRP1和FIS1）的代表性免疫印迹。P-DRP1和FIS1的定量在WT和AIF Tg小鼠之间未显示出显着差异（n = 6 /组）。b在生理条件下，来自P9 WT和AIF Tg小鼠皮质组织的线粒体级分中的线粒体融合蛋白（OPA1和MFN1）的代表性免疫印迹。OPA1和MFN1的定量在WT和AIF Tg小鼠之间未显示任何显着差异（n = 6 /组）。CHI后24小时，WT和AIF Tg小鼠的CL和IL半球皮质组织的线粒体部分中的P-DRP1和FIS1进行了免疫印迹。P-DRP1和FIS1的定量在WT和AIF Tg小鼠之间，在CL和IL半球中未显示任何显着差异（n = 6 /组）。dWT和AIF Tg小鼠在HI后24小时，CL和IL半球皮质组织线粒体组分中OPA1和MFN1的免疫印迹。WT和AIF Tg小鼠在HI后24 h MFN1的表达均显着降低，而HI后24 h的短型（82 kDa）和OPA1切割带显着增加。老鼠。OPA1和MFN1的定量在WT和AIF Tg小鼠之间，在CL和IL半球中未显示任何显着差异（n = 6 /组）。
AIF是一种线粒体氧化还原酶，如果存在于线粒体中，则起抗凋亡氧化还原酶的作用34。AIF还调节呼吸系统复合物的组装和维护，从而影响代谢途径和表观遗传过程35。缺乏在AIF导致严重的线粒体功能障碍，引起肌肉萎缩和神经退行性疾病模式生物，以及人类的36，37，38。的丑角小鼠与来自在X连接的原病毒插入衍生的突变AIFM1轨迹具有减少80％AIFM1mRNA表达。由于AIF缺乏，成年Harlequin小鼠的神经元遭受更大的氧化应激，增强的细胞周期再进入和进行性小脑变性39。在凋亡期间，从线粒体到细胞核AIF易位充当促凋亡因子40，41。AIF的促凋亡活性似乎支配在新生小鼠神经保护功能，这意味着丑角小鼠清单响应于HI相比正常WT对照减少的神经元细胞损失17。
但是，体内尚未报道过AIF过表达的作用。该AIF Tg小鼠人员在这里表现出较高的5.9倍AIF1表达（但无显著变化Aif2的mRNA）。尽管有Aif1过度表达，我们观察到在生理条件下线粒体细胞死亡相关蛋白或线粒体生物发生相关蛋白的表达没有变化。比较WT小鼠的体重增加和死亡率，在P9 AIF Tg小鼠中未观察到特定的表型，但1岁AIF Tg小鼠齿状回颗粒层中DCX阳性细胞数量的增加表明：长期而言，过量的AIF可能会增加神经元的增殖，但不会影响大脑发育的早期阶段。转录组分析显示，即使使用相对宽松的标准定义DEG，P9小鼠大脑中的DEG也少于2％。所有这些结果表明，过量的AIF对生理功能没有任何重大影响。
凋亡对于未成熟的大脑中枢神经系统的发育至关重要，许多参与凋亡的蛋白质在大脑发育10期间均被上调。我们先前的研究表明，HI 28后AIF易位至新生儿脑核，AIF表达下调使小鼠不易遭受HI损伤17。此外，阻断AIF易位或下调AIF伙伴蛋白减少神经元细胞死亡和脑损伤15，18，33，42，表明AIF在细胞死亡中起因果作用。与具有正常AIF蛋白表达的WT小鼠相比，在HI后，AIF Tg小鼠的AIF蛋白增加了两倍以上，并且AIF核移位更加明显，导致了更严重的脑损伤。在AIF Tg小鼠的核中发现了更多的CYPA，表明该胞质蛋白参与过量AIF的核易位。这些结果与我们先前的发现一致，在这些发现中，AIF降低或阻断AIF易位导致损伤减少，这表明HI 17后AIF蛋白表达与脑损伤呈正相关。相反，外显子2的选择性敲除（消除了AIF2的表达，但不消除AIF1的表达）加重了HI损伤后的脑损伤图32表明，HI后AIF1和AIF2在新生儿脑中的作用不同。
半胱天冬酶具有蛋白水解活性，并能够在天冬氨酸残基处裂解蛋白质。Caspase-3是最重要的执行者caspase。在AIF Tg新生小鼠大脑中，仅在HI后24小时才在皮质和纹状体区域发现活跃的caspase3阳性细胞显着增加，而在CA1或ha状核中则没有，这在成分上有所不同。神经元亚群43。海马在记忆巩固和空间导航中发挥作用。海马和其他大脑区域之间的细胞类型不同，海马主要部分的神经元密度低于皮质44。种群和类型的差异可能导致细胞在不同的大脑区域经历不同的细胞死亡途径45。我们目前的结果表明，海马中不依赖caspase3的细胞死亡途径比依赖caspase3的细胞途径更为明显。
AIF为PARP-1依赖性细胞死亡（parthanatos）临界46，47，48。PARP-1的过度活化会导致聚（ADP-核糖）聚合物的形成，该聚合物会从核转移到线粒体，从而导致AIF的释放和NAD +的过度消耗，从而导致ATP产量降低49。PARP-1是半胱天冬酶的底物之一，胱天蛋白酶对PARP-1的切割被认为是凋亡的标志50。在这项研究中，HI损伤在24 h诱导caspase-3活化和PARP-1裂解，但WT和Tg组之间没有发现显着差异。众所周知，不同的细胞死亡途径可能被常见的上游引发剂激活，甚至可能在复杂的串扰中共享相交的信号转导级联。但是，这种串扰的具体方式以及对一种或另一种（对caspase依赖，与caspase无关）途径的偏爱可能在不同的大脑区域甚至以性别偏见的方式有所不同，具体取决于病理状况51，52，53。这表明对多个细胞死亡效应子的多管靶向可能比仅作用于单个分子更有效地抑制细胞死亡。
在活细胞中，线粒体通过裂变和融合事件不断重塑。这些拮抗作用将线粒体动力学与能量需求和营养供应之间的平衡联系起来54。高度融合的线粒体可在营养缺乏时或暴露于某些形式的压力时有效形成，以优化线粒体功能，从而最大化ATP的合成。相比之下，线粒体裂变经常在营养过剩的环境中观察到，例如在肥胖症中。这些动态变化意味着维持或促进线粒体融合或抑制线粒体裂变可能对HI诱导的损伤具有保护作用。据报道，AIF缺乏会破坏线粒体动力学22。但是，在当前的研究中，在生理条件下，AIF的过表达对线粒体融合蛋白或裂变相关蛋白的表达没有任何影响。HI损伤可能会减少线粒体融合，如融合蛋白MFN1的表达降低和长形式的OPA1所示，并可能增加线粒体的裂变，如P-DRP1的下调所示。事实上，公布的结果表明，HI降低线粒体融合和增加线粒体分裂加重新生儿脑损伤23，24，55，56。然而，在HI后WT和AIF Tg小鼠之间未发现调节线粒体融合或裂变的蛋白质的显着差异，这表明由于过量AIF表达引起的新生儿脑HI损伤的加剧与线粒体动力学变化的可能性不大。 。
当前的研究存在一些局限性。首先，由于小鼠基因型复杂，我们限制了从每种基因型获得的小鼠数量，这使我们无法从更多时间点（例如HI后6或12小时）获得样品。其次，即使包括了一些未受伤小鼠的长期研究数据，我们也没有HI损伤后的长期神经行为功能数据。我们发现，AIF过表达会加剧HI后的脑损伤，但是如果可以进行长期的行为分析，这将更有说服力。
总而言之，我们的研究表明过量的AIF不会引发明显的表型改变或任何生理功能的改变。然而，过量的AIF蛋白表达确实会加剧HI诱导的损伤，主要是在新生儿大脑中，这与AIF从线粒体释放到脑细胞核的更明显转运有关，以及脑区域Caspase-特异性升高3激活。总而言之，这项研究表明AIF在新生儿HI脑损伤中具有重要作用。未来的研究应集中于防止HI损伤后AIF从线粒体释放和随后的核易位的策略。
使用Rosa26基因座基因定位在C57 / Bl6背景中构建AIF过表达转基因小鼠（AIF-Tg flox / flox），并通过Cre重组酶调节AIF过表达。浮选的小鼠与β-肌动蛋白-cre小鼠杂交。AIF-Tg 亚麻/ +-肌动蛋白-cre（AIF过表达，AIF Tg）和AIF-Tg + / +-肌动蛋白-cre（野生型，WT）小鼠在P9时体重合理（4.0–5.5 g）在本研究中使用了5-8只幼仔。由于手术或缺氧期间的死亡，总共排除了15只幼仔，总共使用了114只小鼠幼仔进行分析。没有采用统计方法来确定样本量，相反，我们的实验设计基于先前研究中报道的数字11，18。将所有幼崽按基因型分组，这意味着AIF Tg小鼠属于实验组，WT小鼠属于对照组。所有实验方案均获批准。所有符合瑞典农业委员会（SJVFS 2019：10）制定的指南的实验程序均已获得哥德堡动物伦理委员会（112/2014）的批准。动物实验是在哥德堡大学实验生物医学实验室中进行的，并据报道符合ARRIVE（动物研究：体内实验报告）准则。样品采集时间如图 1a所示。。从尾巴样品（Qiagen，Hilden，德国； 69506）中分离基因组DNA，并在Biometra T3热循环仪（Biometra GmbH，德国哥廷根）上进行PCR。AIF转基因flox基因的引物是5'-GAGTTCTCTGCTGCCTCCTG-3'（正向），5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'（flox带反向，215 bp）和5'-CGAGGCGGATACAAGCAATA-3'（野生型反向） β-肌动蛋白-cre基因的条带（322bp），并且引物对是5'-CTGCCACGACCAAGTGACAGCAATG-3'（正向）和5'-GCCTTCTCTACACCTGCGGTGCTAA-3'（反向）以产生326bp的扩增子。使用1.5％琼脂糖凝胶电泳系统（美国加利福尼亚的Bio-Rad）和LAS 3000冷却的CCD相机（日本东京的Fujifilm）进行基因型检测。
用异氟烷在空气和氧气的1：1混合物中麻醉异性烷（5％诱导，1.5-2.0％维持）麻醉产后第9天的小鼠，麻醉和手术时间<5分钟。在两次结扎之间切开右颈总动脉。外科手术后，用卡洛卡因浸润伤口。将幼犬放回坝中1小时，然后将其置于充满湿气混合物（氮气中10％±0.01％氧气）的室内，在36°C下放置40分钟。在低氧暴露后，幼崽返回其母坝直到处死。对照幼犬除HI外均接受所有程序。
用过量的戊巴比妥钠深度麻醉动物，并在心内灌注PBS和5％缓冲甲醛（Histofix； Histolab，哥德堡，瑞典）。将大脑在5％的甲醛缓冲液中于4°C固定过夜。用梯度乙醇脱水后，将大脑包埋在石蜡中，切成5 µm厚的冠状切片，将其在二甲苯中脱蜡并在梯度乙醇中再水化。通过在10 mM沸腾的柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中加热切片10分钟来进行抗原回收。一抗如下，并在4°C下与切片孵育过夜：小鼠抗MAP2（1：1000稀释度，克隆HM-2，Sigma，M4403），小鼠抗MBP（1：500稀释度，克隆SMI94） ，BioLegend，836504），兔裂解的半胱天冬酶3（1：200稀释，Asp175，Cell Signaling，9661），兔抗AIF（1：500稀释度，E20，Abcam，ab32516）和山羊抗DCX（1：500稀释度，C-18，Santa Cruz，sc-8066）。洗涤后，在室温下，将适当的生物素化二抗（1：200稀释；全部来自Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）在每个切片中加入60分钟。使用Vectastain Elite ABC辣根过氧化物酶（HRP）试剂盒（Vector Laboratories，PK-6100）将切片可视化。
为了进行免疫荧光染色，将兔抗AIF（1：500稀释度，E20，Abcam，ab32516）和小鼠ANTI-FLAG（1：500稀释度，M2，Sigma，F1804）的混合一抗与切片在90℃下孵育过夜。 4°C。洗涤后，将驴抗兔Alexa Fluor488（1：500稀释，Life Technology，A21206）和驴抗小鼠Alexa Fluor555（1：500稀释，Life Technology，A31570）的混合二级抗体添加到每个切片中120在室温下分钟。洗涤后，将切片用含有DAPI的ProLong TM Gold抗褪色试剂（Invitrogen，P36931）固定在盖玻片上。
根据MAP2和MBP免疫染色评估脑损伤。使用Micro Image（日本奥林巴斯）测量每个切片的两个半球。MAP2阳性和阴性以及MBP阳性组织体积计算以及来自不同大脑区域的灰质的神经病理学评分如先前所述11进行了评估。在IL半球中，梗死体积等于MAP2阴性体积。MBP组织损失率的计算公式为：（（CL半球-IL半球）/ CL半球）×100％。所有评估均由对小组分配不知情的调查员进行。
在第50个区域中绘制并测量具有固定位置的区域轮廓。在皮质（100×），纹状体（200×），CA1（200×）和and状核（200×）的定义区域（一个视野）内对活跃的caspase-3阳性细胞和AIF阳性核进行计数。 ）。用100倍放大倍数对1岁小鼠的齿状回颗粒层中的DCX阳性细胞进行计数。从每个大脑以250μm的间隔计数三个切片。所有计数均由对小组分配不知情的调查员进行。
在HI后24小时通过断头处死幼崽。将两半球的顶叶皮层（包括海马）组织迅速切开，并使用2 ml Dounce组织研磨机（Sigma，D8938）在冰上立即匀浆，并添加分离缓冲液（15 mM Tris-HCl，pH 7.6） ，320 mM蔗糖，1 mM二硫苏糖醇，1 mM MgCl 2，3 mM EDTA-K和0.5％蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，P8340）。将一半的匀浆等分并保存在-80°C，另一半在4°C 以800× g离心 10分钟。将沉淀级分用分离缓冲液洗涤，以相同的程序再离心，并保存为核级分。将上清液进一步以9200× g离心 在4°C下放置15分钟，在沉淀中产生富集的线粒体级分，在上清液中产生粗胞质级分。洗涤沉淀并再次离心，然后用分离缓冲液重悬。所有馏分均保持在-80℃。
使用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度。将样品（65 µl）与25 µl NuPAGE LDS 4x样品缓冲液（ThermoFisher Scientific，NP0007）和10 µl还原剂（ThermoFisher Scientific，NP0004）混合，并在70°C下加热10分钟。样品在4–12％NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上运行，并转移到增强的硝酸纤维素膜（Bio-Rad）上。在室温下用5％的无脂牛奶在TBST缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl和0.1％Tween 20，pH 7.6）中封闭60分钟后，将膜与以下一级抗体孵育：兔抗AIF（1：1000稀释度，E20，Abcam，ab32516），小鼠ANTI-FLAG（1：1000稀释度，M2，Sigma，F1804），小鼠抗CHCHD4（1：200稀释度，C-12，圣克鲁斯，sc- 365137），兔抗COX1（1：1000稀释度，EPR19628，Abcam，ab203912），兔抗PGC1α（1：1000稀释，ThermoFisher，PA5-38021），兔抗TFAM（1：1000稀释，ABclonal，A13552），兔抗SOD2（1：1000稀释，ABclonal，A1340），小鼠抗细胞色素c（1：500稀释） ，6H2，Santa Cruz，sc-13561），兔抗磷酸DRP1（1：1000稀释度，Ser637，Cell Signaling，4867），小鼠抗OPA1（1：1000稀释度，BD bioscience，612606），小鼠抗MFN1（1：500稀释度，11E9-1H12，Novus Biologicals，NBP1-71775），兔抗FIS1（1：500稀释度，FL-152，Santa Cruz，sc-98900），兔抗PARP-1（1： 1000倍稀释，E102，Abcam，ab32138），兔抗切割的PARP-1（1：1000稀释，E51，Abcam，ab32064），山羊抗Lamin B（1：200稀释，M-20，Santa Cruz，sc-小鼠抗VDAC1（1：500稀释，B-6，圣克鲁斯（Santa Cruz），sc-390996）和过夜。洗涤后，将膜与过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体孵育（1：2000稀释度，Vector，PI-1000）或过氧化物酶标记的马抗小鼠IgG抗体（1：4000稀释，Vector，PI-2000）或马抗山羊IgG抗体（1：2000稀释，Vector，PI-9500） 。使用SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物（ThermoFisher Scientific，34580）和LAS 3000冷却CCD相机（日本Fujifilm）可以观察到免疫反应性物种。
线粒体级分用于复合物I酶活性测定（Abcam，ab109721）。按照制造商的说明制备样品，并在孵育溶液中稀释至所需浓度。将样品（200微升）添加到预涂的微孔板中（添加200微升孵育溶液以测量背景信号），并将微孔板在21°C下孵育3小时。洗涤后，将200 µl分析溶液（1x稀释缓冲液，20x NADH和100x染料）添加到每个孔中。以动力学模式读取板，并在21℃下测量450nm处的OD。结果表示为mOD / min / 100 µg蛋白。
按照制造商的说明，将核部分用于CYPA测量（Abbexa，abx585050）。将样品和标准溶液添加到预涂板上，并在37°C下孵育90分钟。孵育后，加入生物素结合的抗体。在37°C下孵育后，添加100 µl HRP溶液，并在37°C下孵育30分钟。洗涤后，加入90μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物，并在37℃下温育20分钟。在最后的温育之后，添加硫酸终止溶液，并立即测量在450nm的吸光度。结果表示为pg / mg蛋白。
将总共25μl匀浆与75μl提取缓冲液混合，该提取缓冲液在微量滴定板上包含50 mM Tris-HCl（pH 7.3），100 mM NaCl，5 mM EDTA，1 mM EGTA，1 mM PMSF和1％蛋白酶抑制剂混合物。在室温下孵育15分钟后，添加在100μl分析缓冲液中的25μMcaspase-3-底物（Ac-DEVD-AMC，肽研究所，670613）。使用Spectramax Gemini微孔板荧光计（在37°C下每2分钟激发/发射波长380/460 nm持续2 h）测量Caspase-3活性，并表示为每分钟pmol AMC / mg蛋白28。
制备来自P9 WT和AIF Tg小鼠的皮质样品用于RNA测序。使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，74104）提取每个样品的总RNA，并按照制造商的说明，使用MGI Easy™mRNA库制备试剂盒（BGI，中国武汉）进行文库制备。测序文库用于在BGISEQ-500系统（BGI）57上进行簇生成和测序。重复测序十次，并使用DESeq方法根据p <0.05 的标准在两组之间进行筛选。使用群集Profiler R程序包58执行GO术语分类。
使用Nanodrop分光光度计（Nanodrop Technologies，Wilmington，USA）测定总RNA浓度和纯度。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen，205311）对一微克总RNA进行逆转录。根据生产商的说明，使用LightCycler 480仪器（Roche Diagnostics，曼海姆，德国）和SYBR green（ThermoFisher Scientific，0253）技术进行RT-qPCR。qPCR反应中使用的引物由Beacon Designer软件（PREMIER Biosoft）设计，其引物如下：普通Aif（正义：5'-TATTTCCAGCCACCTTCTTTTTC-3'，反义：5'-TTCACCATGTTGCCTCTTAC-3'），Aif1（义：5'-AGTCCTTATTGTGGGCTTATC-3'，反义：5'-GCAATGGCTCTTCTCTGTGTT-3'），Aif2（义：5′-TTCTTAATTGTAGGAGCAACAGT-3′，反义：5′-CCCATCACTCTTTCATTGTAT CT-3′）和Sdha（参考基因）（义：5′-TTGCCTTGCCAGGACTTA-3′，反义：5′-CACCTTGACTGTTGATATGAGAAT- 3′）。根据2- （ΔΔCT）的公式计算mRNA的相对表达水平。
所有分析均使用GraphPad Prism 6软件（GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。各组之间的比较通过Student's t检验进行，方差不等的数据与Mann-Whitney U检验进行比较。使用双向ANOVA和Sidak事后检验对来自两组以上的数据进行多次比较。结果表示为平均值±标准偏差，并且p <0.05被认为具有统计学意义。
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