p53的突变或其调节网络的改变是肿瘤发生的主要驱动力
摘要
尽管细胞和物理状态不同，细胞仍需要保持基因组完整性。p53是基因组的守护者，它通过触发细胞周期停滞，凋亡或衰老，在细胞对DNA损伤的反应中起关键作用。p53的突变或其调节网络的改变是肿瘤发生的主要驱动力。由于多项研究表明在人类癌症的放射或化疗过程中对高温治疗具有有益作用，因此我们旨在了解遗传毒性应激后p53的动力学如何在生理相关范围内受到温度变化的调节。为此，我们采用了时间分辨活细胞显微镜技术和计算分析技术的组合来表征成千上万单个细胞中的p53反应。我们的结果表明，电离辐射下的p53动力学与温度有关。在33°C至39°C的范围内，脉动性p53动态信号的频率受到调制。高于40°C，这在临床环境中相当于轻度的高温，我们观察到p53的持续高蓄积可逆相变，破坏了其对DNA双链断裂的规范反应。此外，我们提供的证据表明，在没有遗传毒性应激的情况下，仅轻度的高温就足以诱导p53反应。这些见解突显了p53介导的DNA损伤反应如何受到细胞物理状态变化的影响，以及如何通过适当的联合疗法时机来利用这一点以提高癌症治疗的效率。搏动性p53动力学的频率被调制。高于40°C，这在临床环境中相当于轻度的高温，我们观察到p53的持续高蓄积可逆相变，破坏了其对DNA双链断裂的规范反应。此外，我们提供的证据表明，在没有遗传毒性应激的情况下，仅轻度的高温就足以诱导p53反应。这些见解突显了p53介导的DNA损伤反应如何受到细胞物理状态变化的影响，以及如何通过适当的联合疗法时机来利用这一点以提高癌症治疗的效率。搏动性p53动力学的频率被调制。高于40°C，这在临床环境中相当于轻度的高温，我们观察到p53的持续高蓄积可逆相变，破坏了其对DNA双链断裂的规范反应。此外，我们提供的证据表明，在没有遗传毒性应激的情况下，仅轻度的高温就足以诱导p53反应。这些见解突显了p53介导的DNA损伤反应如何受到细胞物理状态变化的影响，以及如何通过适当的联合疗法时机来利用这一点以提高癌症治疗的效率。我们观察到p53持续过度积累的可逆相变，破坏了其对DNA双链断裂的经典反应。此外，我们提供的证据表明，在没有遗传毒性应激的情况下，仅轻度的高温就足以诱导p53反应。这些见解突显了p53介导的DNA损伤反应如何受到细胞物理状态变化的影响，以及如何通过适当的联合疗法时机来利用这一点以提高癌症治疗的效率。我们观察到p53持续过度积累的可逆相变，破坏了其对DNA双链断裂的经典反应。此外，我们提供的证据表明，在没有遗传毒性应激的情况下，仅轻度的高温就足以诱导p53反应。这些见解突显了p53介导的DNA损伤反应如何受到细胞物理状态变化的影响，以及如何通过适当的联合疗法时机来利用这一点以提高癌症治疗的效率。
保持基因组完整性是所有后生细胞的核心功能。因此，进化出了复杂的机制来检测和响应DNA损伤。但是，基础分子网络受到各种物理和细胞状态的限制，从而限制了其功能。温度是影响分子功能的最基本物理特性之一。先前的研究表明，某些细胞网络（如昼夜节律时钟）可以补偿温度的变化1，而另一些细胞（如NF-kB介导的对炎性细胞因子的响应）则显示出温度依赖性的动力学变化2。。为了确定温度在多大程度上影响细胞保持基因组完整性的能力，我们集中于控制肿瘤抑制因子p53的分子网络。
转录因子的p53由细胞应激如DNA损伤激活并激活下游基因介导的细胞响应范围从瞬态细胞周期停滞和损伤修复至终端细胞命运如衰老或凋亡的表达3，4。在不受压力的细胞中，Mdm2介导的泛素化和随后的蛋白酶体降解将p53蛋白保持在较低水平5。DNA损伤激活激酶（例如ATM和ATR）的翻译后修饰破坏了这种相互作用，并导致p53稳定并在细胞核中积累。P53介导的信号是一个高度动态的过程，从各种来源整合信息来调节细胞应激反应6，7。因此，p53积累的时间模式与刺激8的类型和数量相关。电离辐射（IR）具有可比较的幅度和持续时间的p53积聚的诱导均匀脉冲9，10。脉冲数与损伤剂量11正相关。这些脉动的p53动力学是由p53信号网络内的负反馈回路触发，主要通过泛素连接酶MDM2和磷酸酶PPM1D / WIP1 9，12，13。相比之下，p53仅对紫外线（UV）辐射表现出单个持续脉冲，其幅度和持续时间与剂量有关，8。使用药理和遗传扰动，我们以前曾表明，p53的动态有助于细胞命运的选择损伤后14，15。在大多数人类癌症中，p53要么通过破坏蛋白质稳定性或其结合DNA的能力的突变而直接失活，要么通过其负调控因子（如Mdm2或Wip1 16）的扩增而间接失活。p53的失活与对治疗的抵抗力增加和生存期较差17有关。
作为同热生物，人类在静止时保持大约37°C的稳定核心体温。然而，体温在周边和具体地四肢显著下降到33℃或更低，这取决于环境温度18，19。其他因素如年龄，时间，性别，生育状况和活动水平导致偏离体温以及20，21。此外，在体育锻炼过程中，核心温度的生理范围超过40°C 22。在病理环境中，甚至在血液和热量传输受到干扰的血管疾病或发烧期间，甚至观察到更高的核心温度，这与几种不同的疾病相关，包括感染，自身免疫性疾病23和癌症24。
温度的变化会在多个层面上影响生物。它对酶催化反应的直接影响由Arrhenius方程表征，该方程描述了当温度升高10°C时，反应速度会翻倍，直到由于蛋白质变性而突然下降25。在细胞水平上，温度变化会影响新陈代谢，蛋白质合成和细胞周期调控26。热疗，尤其是，通过触发细胞周期停滞，衰老，凋亡或坏死性细胞死亡引起的膜，DNA和蛋白质的损害和影响细胞命运27，28，29，30，31。在生物水平上，研究表明，核心温度偏差超过4°C可能导致生理损伤和死亡32。
先前研究温度变化对DNA损伤反应（DDR）的影响的研究主要集中在损伤激活的激酶ATM和ATR及其下游效应子Chk1和Chk2，它们协调了细胞过程网络以维持基因组完整性33。已经观察到，热疗导致人类ATR的激活，诱导了在G2 / M过渡34的细胞周期停滞。此外，激活的ATR可能有助于稳定停滞的复制叉，防止染色体损伤的积累35。类似地，热疗诱导ATM的自动磷酸化和活化36，其由1-2个小时然而延迟相比ATR活化34。有趣的是，DDR的其他成分在高温下也受到抑制：Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）复合物对DNA双链断裂（DSB）激活ATM至关重要，在高温下从细胞核转移到细胞质37和的53BP1结合染色质DNA双链断裂周围防止36，38，限制以感测这种形式的DNA损伤的ATM的容量。
在临床上，将外源性热与经典的抗癌治疗相结合是针对各种人类肿瘤的既定治疗策略39。几个随机试验已经证明热疗与放疗或化疗关于肿瘤局部控制和存活率联合的益处（40-42℃下至少1小时）40，41，42。热疗还放大化疗的治疗效果43，44，45，46。临床前和临床研究表明，热疗在患有野生型p53和没有活性p53的癌症中均有效。据我们所知，癌症的p53状态被热疗没有在临床常规治疗的决定47，48。分子，显示癌细胞获得在细胞周期（S / G2或G2 / M）的不同阶段被捕，失去的能力修复的染色体损伤，从而促进细胞死亡34，49，50，51。
响应温度变化，一系列的热激因子（HSF1-4）启动了热激蛋白（HSP）的表达。最公知的家族成员是HSF1，其被组成型表达并调节HSP的表达，以及与细胞信号传导，细胞的完整性，发育，生长，生育，衰老和凋亡的其它基因52，53，54。据报道，HSF1通过支持翻译后修饰并充当转录辅因子55与p53网络发生不同程度的相互作用。此外，HSF1靶标Hsp90与p53的相互作用可防止Mdm2介导的泛素化56并调节其与CDKN1A / p21启动子的结合55。额外的热休克蛋白，例如Hsp70和Hsp40的是，以及能够稳定的p53-DNA复合物的57，58。
现在，我们旨在系统地研究温度如何影响p53信号传导。控制人类主要肿瘤抑制因子激活的分子网络是否可以补偿温度的变化，或者其对DNA损伤的反应是否取决于物理环境？为了解决这个问题，我们采用了成熟的荧光报告细胞系59然后利用时间分辨活细胞显微镜观察单细胞水平电离辐射后p53积累的动力学。计算机辅助图像和数据分析表明，搏动性p53响应的动态特征随温度在33°C至39°C范围内变化。高于40°C，我们观察到可逆的相变，从根本上不同的p53积累动力学，这可能提供新的见解，说明如何将热疗用于改善癌症治疗。
为了监测p53动态，我们采用了稳定表达融合到黄色荧光蛋白mVenus的p53和融合到青色荧光蛋白（mCerulean）的核标记物H2B的A549肺癌细胞株（图 1A）59。我们用10 Gy X射线（250 kV）照射细胞，并通过时间分辨活细胞显微镜监测其p53蛋白水平24小时。如前所述，p53蛋白在损伤诱导后以脉冲方式积累（图 1B）8。使用计算机辅助图像分析，我们追踪了成千上万个单个细胞并量化了它们的p53反应（有关详细信息，请参见方法部分）。单个细胞的轨迹证实了损伤诱导后均匀的搏动性p53动力学（图 1C））在整个种群中是异步的和异构的（图 1D）。这导致在细胞群的中位p53水平出现阻尼脉冲（图 1E）60。
单个细胞中的p53动态（A）用于监测p53动态的报告系统示意图。与黄色荧光蛋白mVenus（YFP）融合的P53在EF1A启动子的控制下稳定表达。H2B与mCerulean（CFP）融合，以在延时显微镜图像中跟踪细胞核。（B）用10 Gy照射的选定细胞的延时显微镜图像。标记H2B-CFP以红色显示，p53-YFP以绿色显示。（C）对于（B）中所示的细胞，随着时间的流逝量化了中位核p53-YFP水平。（D）在数千个细胞中定量了P53水平。为了证明响应的异质性，将10 Gy电离辐射后20条p53水平随机选取的轨迹可视化。（E）p53在群体水平在37°时的反应（黑色：未辐照的对照细胞；蓝色：辐照了10 Gy的细胞）。粗线表示p53的中位数，阴影区域表示0.25和0.75分位数之间的分位数范围。有关分析细胞的数量，请参见表 S1。
为了研究温度变化对p53对遗传毒性应激反应的影响，我们将细胞在33°C至41°C的温度范围内平衡了14小时，并在相应温度下对未处理和辐照的细胞进行了延时显微镜检查（图。 2A–E）。为了比较来自不同显微镜实验的p53动力学，我们在假设初始p53分布相同的情况下对所得数据进行了归一化（参见图 S1，请参见方法的详细信息）。当降低温度时，我们监测p53的脉冲的增加的持续时间和在相应群的中值轨迹降低的频率（图 2A-B ）相比，在37℃下（图受损细胞 2C，补充图。 S2A，B和Supp。电影 S1 – 6）。未经处理的细胞在33°C或35°C时未显示p53水平的明显变化（参见图 S2E，F）。当我们将温度升至39°C时，我们可以观察到相反的效果：脉冲持续时间减少，脉冲出现得更快（图 2D，Supp。图 S2C和Supp。电影 7和8）。有趣的是，在延时显微镜下，即使未经处理的细胞也显示p53水平略有增加（图 2D，黑线/阴影区域和Supp。图 S2G）。最后，当我们将温度升至41°C（这在临床环境中相当于轻度的高温）时，我们发现p53动力学发生了惊人的变化：现在，我们观察到一个持续时间很长的单个p53持续脉冲，而不是p53积累的规律性脉冲。损伤感应（图 2E，附图 S2D，I和附影 S9和10）。p53水平的最大增加值比第一个脉冲在37°C时的平均幅度高约1.5倍。即使在没有损伤诱导的情况下，在观察期间p53水平也强烈聚集在细胞核中（图 2E，黑线/阴影区域和补给。图 2H，I），在37°C时达到第一个脉冲平均幅度的60％左右。
p53动力学对温度敏感（A–E）预平衡细胞在33°C至41°C温度范围内的群体水平p53反应（黑色：未辐照，蓝色：10 Gy IR）。粗线表示中位数p53水平，阴影区域表示分位数之间的范围从0.25到0.75。在41°C时，由于强烈的持续响应取代了搏动性p53积累，p53动力学发生了巨大变化。有关分析细胞的数量，请参见表 S1。（F–G）细胞增殖表示为在指定温度下孵育的未辐照（F）和辐照（G）细胞在24小时内每个细胞的细胞分裂数。（H–I）随时间变化的控制系数（ħ）或损坏（我在示出）的细胞群（甲 - ë）。在41°C下，我们发现两种情况下的异质性都大大增加。在其他温度下，异质性主要是由于种群中p53脉冲的异步性增加所致。（J）对照和照射的细胞群的p53反应在没有事先预先平衡的情况下急剧转移至41℃。响应的幅度和动力学与我们在（E）中的观察结果不同。有关分析细胞的数量，请参见表 S1。（K）在24小时的观察期内，从33°C到41°C的温度范围内未辐照和辐照的细胞的累积p53水平。与在37°C下孵育的细胞相比，估计的变化在右侧（红点）表示；误差棒表示通过置换测试确定的95％置信区间。虚线会引导眼睛。
当我们分析未经处理的细胞在不同温度下如何增殖时，我们观察到了低于正常温升和高于正常温升的增殖速率下降（图 2F）。在41°C，大多数细胞停止分裂。辐射后，在所有测试温度下，细胞在整个实验过程中均被阻滞（图 2G）。除了动力学和增殖方面的变化外，我们还观察到在处理过的和未处理的细胞中，当从39°C移至41°C时，异质性都显着增加（图 2H，I）。在从内源基因位点表达与mVenus融合的p53的未转化二倍体乳腺上皮细胞系MCF10A中观察到了相似的结果（参见图 S3）61。有趣的是，MCF10A细胞在39°C时就倾向于显示持续的p53积累。
尽管使细胞平衡至更高的温度，但未经处理的细胞在41°C时仍会表现出强烈的反应，这使我们感到惊讶，因此我们将预先平衡至41°C的细胞中的p53反应与开始时急剧转移至较高温度的细胞进行了比较实验的 （图 2J）。在预先平衡的细胞中，我们观察到损伤后核p53水平快速而强烈地增加，在刺激后约8小时达到最大值。之后，p53水平下降直到观察期结束（图 2E））。未经辐照的细胞中p53的水平上升较慢，并达到辐照后峰值p53水平的60％处的平稳期。在直接暴露于41°C的细胞中，核p53在损伤诱导时积累得更快，照射后4 h已达到峰值水平。在剩余的20小时内，P53的水平迅速下降（图 2J）。未辐照的细胞在温度变化时表现出相似的强烈增加，在6小时后达到受损细胞峰值水平的约85％。有趣的是，然后p53水平的下降要比受辐照的细胞慢，这导致未处理细胞的p53水平平均高于受损细胞（图 2J）。
为了进一步比较在不同温度和治疗条件下p53反应的强度，我们对观察期内p53的整合核水平进行了量化。在从33°C到39°C的温度范围内，未损伤的细胞和照射后累积的p53水平仍然相似（图 2K））。在41°C，未辐照的预平衡细胞的中位整合p53水平与较低温度下受损细胞的水平相当，尽管我们观察到整个群体的分布更广泛。在41°C照射的细胞，尽管动力学差异很大，无论它们是否已经预先平衡或突然转移到更高的温度，它们的p53累积水平都相似。令人惊讶的是，急性暴露于41°C的未辐照细胞平均显示出最强的p53反应。在41°C或直接暴露于41°C的条件下进行预平衡的细胞之间的差异表明，对预平衡细胞的高温敏感性降低。
为了更好地了解单细胞水平上p53动力学的温度依赖性，我们采用了平均幅度差函数（AMDF）62来估计单细胞轨迹中p53脉冲的音高。前三个脉冲的位置在不同温度之间基本变化（图 3A）。在33°C下，第一个p53峰平均比在37°C下晚1.5 h出现。相反，尽管第一节距位置的分布在35°C至39°C的范围内重叠，但39°C的电池平均响应速度比37°C的电池快。我们对第二个和第三个脉冲测量了相同的趋势（图 3A）。此外，我们观察到俯仰位置的可变性随温度升高而增加。脉冲时序和同步的温度相关变化导致温度升高时脉冲间间隔的中值减小，而相应分布的宽度增加（图 3B）。可视化搏动性p53动态的另一种方法是绘制细胞群中不同时间点的核p53水平的自相关系数。产生的热图清楚地显示了规则的p53积累在33°C至39°C范围内的温度依赖性变化（图 3C，左图和Supp。图 4）。相反，在41°C受损的细胞中没有观察到周期性（图 3C）。， 对）。取而代之的是，p53反应在延长的时间段内是相关的，这表明与早期反应较弱的细胞相比，具有较强即时反应的细胞在较晚的时间点反应也更强烈。
p53响应的动态特征的量化（A）在33°C至37°C的温度范围内，对受辐射细胞（10 Gy）的平均幅度差函数估计的前3个基音位置的量化。红线表示分布的中位数；方框中包含介于25％和75％之间的数据；晶须延伸至1.5×四分位间距范围内的最大值。与在37°C下孵育的细胞相比，估算的变化显示在下面（红色点）；误差棒表示通过置换测试确定的95％置信区间。虚线会引导眼睛。（B）在33°C至37°C的温度范围内对辐照过的电池（10 Gy）的音调间隔进行量化。在较低的温度下，间隔的长度增加，而分布范围减小。与在37°C下孵育的细胞相比，估算的变化显示在下面（红色点）；误差棒表示通过置换测试确定的95％置信区间。虚线会引导眼睛。（C）在37°C和41°C下受辐照的细胞之间的自相关。该图中的每个点代表在两个不同时间点（沿主对角线除外）的总体p53水平之间的相关系数。我们在37°C下检测到重复脉冲，但在41°C下仅检测到一个长时间的均匀响应。（D）在33°C至41°C的温度范围内，受辐照的细胞（10 Gy）在给定的时间点处于特定脉冲状态的可能性。使用基于本地动态时间规整的方法检测脉冲。脉冲频率与温度在33°C至39°C之间的范围呈正相关。在41°C时，脉冲动力学完全消失，并被持续响应所取代。（E-F ）定量的持续时间（ë）和振幅（˚F第一3个脉冲相对于温度的）。与在37°C下孵育的细胞相比，估算的变化显示在下面（红色点）；误差棒表示通过置换测试确定的95％置信区间。虚线会引导眼睛。
量化温度敏感性的一个好方法是Q 10温度系数1，它反映了温度升高10°C时生物系统的变化速率，假设反应速率与温度成指数关系。对于p53的系统中，我们确定的Q- 10基于所述3的位置的1.53±0.24系数RD螺距，这是通常在生物学观察系数的下端（Q 10〜2-3）63。
由于基于自相关的基音检测旨在识别整个轨迹上的重复模式，因此，我们采用了一种基于局部动态时间扭曲64的特征检测方法，该方法受Smith-Waterman算法65的启发来表征各个p53脉冲（参见图 S5A– C，有关详细信息，请参见方法）。我们首先确定了在单个轨迹的给定时间点检测特定特征的概率，并再次观察到了预期的温度依赖性从33°C到39°C的时间变化（图 3D和Supp。图 S5D–G）。在41°C时，搏动动力学破裂，我们在大多数细胞中仅观察到一个扩展特征（图 3D和 Supp。S5H））。除了脉冲频率的变化，该分析还证实了特征与温度同步性的变化。我们观察到MCF10A细胞中动态特征对温度的依赖性类似，尽管它们显示在39°C时脉动动力学已广泛分解（参见图 S5I）。接下来，我们分析了A549细胞中前三个脉冲的长度。随着温度从37°C降低到33°C，第一个脉冲的长度从大约4.5 h增加到6.5 h（图 3E））。随后的脉冲通常更短，但是，中值持续时间随着温度的降低而再次增加。在39°C，后面的脉冲的平均长度与37°C相似，尽管分布明显变宽。在低于37°C的温度下，对于第一个脉冲，衰减了定义为脉冲内最大p53水平与最小p53水平之间的差异的脉冲幅度（图 3F）。在39°C时，它们保持等于常温。有趣的是，这些差异在以后的脉冲中减小了。
如以前的报道表明，p53的动力学影响DNA损伤反应的细胞的结果14，66，我们的目的是确定是否的p53靶基因在损伤诱导的表达依赖于温度为好。为此，我们集中于一组有助于不同细胞应答途径的高可信度靶基因，包括CDKN1A / p21，GADD45（两种细胞周期阻滞），XPC（DNA损伤修复）和BAX（凋亡），并进行了测量。通过qPCR在未经处理和辐照的细胞中在不同时间点和温度下相应的RNA水平3。对于p21，GADD45和较小程度的XPC，我们观察到在较低温度（35°C）下表达升高，而p53则显示了较长且较不频繁的累积脉冲（Supp。Fig。 S6A–D）。但是，这些靶基因也仅受温度变化的影响，表明p53动态变化和温度诱导的基因表达变化共同作用。有趣的是，我们观察到损伤后后期在较高温度（39°C）下BAX的表达增加，表明在这些条件下诱导凋亡的趋势增加。在41°C下，CDKN1A和GADD45的表达减弱，而BAX和XPC的表达则略有增加，遵循在39°C下观察到的趋势（参见图 S6E–H）。我们还检测到在41°C照射后24 h和48 h在G2中停滞的细胞更少，并且凋亡细胞略有增加（ Supp。Fig S6I，J）。
在MCF10A细胞中，p21蛋白也从内源基因座表达了带有红色荧光蛋白mCherry的p21蛋白，我们类似地观察到在33°C时约8 h的即时p21反应最强，并且随温度升高幅度降低（Supp。图 S3E–H）。有趣的是，p21在随后的12h和24h之间持续积累在37°C下最为明显。
当我们在不同温度下照射细胞时观察到p53动力学具有很强的温度依赖性，因此我们接下来研究了在对遗传毒性胁迫的持续响应过程中温度变化对动力学特征的影响。为此，我们平衡细胞在37℃下，通过照射10Gy的X射线和改变的温度范围内，在12小时的3之后进行时间推移显微镜从33至41°C大约RD p53的脉冲（图 4A）。即使p53已经以规则的脉动方式积累，降低温度也会导致p53脉冲的频率降低，这是从温度变化时开始的特征分析所表明的（图 4B））。相应地，将温度提高到39°C会增加脉冲频率以及异质性。将细胞移至41°C会引起强烈的立即但短暂的p53反应，而无需进一步脉冲。
温度变化会改变正在进行的p53反应（A）温度变化会改变正在进行的p53反应的动力学。将细胞在37°C下孵育，并暴露于遗传毒性应激（10 Gy IR）。损伤诱导后12小时，将3后大约RD预期规范应答的脉冲，我们改变该范围中的温度从33℃至41℃，并随后细胞额外36小时。显示了细胞群的中位p53水平。有关分析细胞的数量，请参见表 S1。（B）在12 h温度变化后处于特定脉冲中的概率。
观察到的温度变化对p53动力学的直接影响促使我们进一步研究仅由热疗引起的p53诱导。在预先平衡至41°C的未损坏细胞中观察到的p53水平升高，使我们特别困惑。我们假设辐照期间的短期温度变化足以通过诱导蛋白质的折叠，回复与HSP的潜在相互作用并诱导Mdm2的表达来重置p53系统的状态。为了检验该假设，我们将细胞平衡至41°C的温度，并对未处理和辐照的细胞进行了延时显微镜检查。在开始的6小时内将温度保持在41°C，然后在37°C降至常温。由于我们的孵化系统的技术能力，温度下降大约需要30分钟。如先前观察到的，经辐照和未处理的细胞对热疗条件具有很强的初始p53反应。然而，一旦温度开始恢复到正常温度，p53水平就会降低，并且受辐照的细胞在损伤后约9小时开始表现出搏动动力学（图5b）。 图5A，上部曲线图）。出人意料的是，在对热疗的p53反应减弱之后，我们还在未辐照的细胞中检测到了脉冲。未经处理的细胞在41°C时停止增殖（图 5A，下图）。然而，它们恢复正常温育后不久仍继续分裂，其分裂速率与在37°C下连续孵育的细胞相似。辐照的细胞与温度无关地保持停滞48小时。
对热疗的p53反应是可逆的（A）追踪在41°C下预平衡的细胞（见图 2）48 h。6小时后，温度降低至37℃。我们观察到p53水平立即下降，随后是搏动动力学。显示了细胞群的中位p53水平。有关分析细胞的数量，请参见表 S1。下图表示随着时间推移而划分的相应的细胞累积分数。（B）通过动态时间规整方法对（A）中显示的细胞群体检测的前6个脉冲的幅度进行量化。第一个特征对应于对热疗的急性p53反应。在降低温度后主要检测到的后续脉冲在被辐照的（空心框）和未辐照的单元格（实心框）之间没有差异。红线表示分布的中位数；方框中包含介于25％和75％之间的数据；晶须延伸至1.5×四分位间距范围内的最大值。照射的细胞和未照射的细胞之间的估计变化如下所示（红点）；误差棒表示通过置换测试确定的95％置信区间。虚线会引导眼睛。（C–D）未辐照（C）和照射的（D）细胞群，按温度设置为37°C（6 h）后出现的第一个新特征的位置进行排序。使用图像处理技术调整显示的数据，以增强脉动动力学的可视化（请参见“方法”部分）。（E）在给定的时间点，受辐照和未经辐照的细胞处于特定特征的概率。对于辐射细胞，诱导的脉冲异质性较小。未辐照的细胞平均具有较少的脉冲。
为了量化瞬态温度变化后观察到的脉冲，我们应用了特征检测方法。不出所料，对热疗的即时反应在幅度上与先前的观察结果相似。有趣的是，后来的p53累积脉冲在受辐照的细胞和未受损的细胞中都具有可比的幅度（图 5B）。但是，p53脉冲的时序和同步性却大不相同（图 5C–E）。在辐照的细胞中，我们观察到与在37°C下持续孵育的辐照的细胞相似的相对均匀的动态模式。相比之下，仅由高热引起的p53反应更加异质，p53峰出现延迟和异步出现，这是由于在没有辐射诱导的激酶活性的情况下，存在着控制p53积累的另一种分子机制。
通过p53途径进行可靠的信息处理对于在动态变化的环境中确保适当的细胞对遗传毒性胁迫的响应至关重要。p53信号的扰动导致单个细胞的转化和随后的肿瘤发生。为了了解电离辐射时温度变化对p53网络动力学的影响，我们监测了暴露于33°C至41°C生理相关温度范围的数千个基因相同的细胞的p53蛋白水平。使用组合的计算和实验单细胞方法，我们已经表明，编码DNA损伤的p53积累脉冲的频率与高达39°C的温度呈正相关。有趣的是，p53动力学的异质性也随温度而增加。这些结果表明，尽管p53网络对于维持基因组稳定性很重要，但在p53积累动力学水平上并未进行温度补偿。NF-kB网络最近也有类似的报道。2。在此，信息被编码在转录因子RelA的胞质至核易位的振荡中，该振荡的频率也随温度而增加。结果表明，温度依赖性途径的动力学是由反馈表达的不同时机引起的，并且在早期时间点仅影响靶基因的一个子集。进一步的研究将显示类似的原理是否也适用于p53信号，或者观察到的变化是否反映了整个网络的综合特性。有趣的是，我们还观察到靶基因表达中依赖温度的变化主要限于损伤诱导后的早期时间点，这可能表明在更长的时间内，在靶基因水平上实现了温度补偿。
令我们惊讶的是，我们在41°C的温度下观察到从典型搏动动力学到强烈的初始反应的相变，随后是持续的核p53水平，这在恢复常温后是可逆的。在暴露于轻度高温的非辐射细胞中检测到类似的p53反应。有趣的是，未辐照的细胞恢复正常体温会诱导异质但持续的p53脉冲数小时。迄今为止尚不清楚这种相变的分子机理。我们推测这是基于p53和Mdm2的结构特性以及它们与HSP的相互作用。众所周知，p53折叠在生理温度下略微稳定。这是通过癌症相关的p53突变体经常表现出温度敏感性表型的突出67，68。在41°C下展开的大部分p53分子可阻止其与Mdm2的相互作用以及随后的蛋白酶体降解。未折叠的p53在转录上是无活性的，打破了在正常温度条件下限制p53反应持续时间的反馈回路。此外，在增加热疗Hsp90的水平可以有助于p53稳定，作为分子伴侣p53的稳定构象的是反对MDM2结合，并有助于降解的Mdm2 57，69，70。有趣的是，在41°C下预温育的细胞对高温的p53反应降低，这表明p53信号传导获得了对热休克的耐受性。HSF-HSP系统的基本机制和作用将在进一步研究中阐明。
观察到的温度依赖性p53动力学对遗传毒性胁迫的生理后果是什么？由于其对于保护基因组完整性至关重要，因此必须在整个生理温度范围内确保适当的p53功能。低温期间延长的p53积累脉冲可能有助于抵消合成速率的普遍降低，并确保关键靶基因（如p21）的充分表达。以此方式，类似于NF-kB系统2，将对p53功能而非其动力学进行温度补偿。高温期间持续的p53积累可能具有不同的目的。众所周知，体温过高会导致有丝分裂表型和基因组不稳定71以及受损反应减弱35。因此，持续但可逆的p53积累可以确保细胞在热疗期间诱导短暂的细胞周期停滞，并且仅在物理条件允许的情况下才进入有丝分裂。
在过去的几十年，热疗与放射和/或化疗的组合已经被证明是人类癌症的治疗有益，并已获得了特别关注，因为可以忽略不计的副作用72，73。热疗如何通过调节细胞和分子途径在分子水平上影响癌症治疗的结果尚未得到很好的研究，这仍然是一个悬而未决的问题47。一些使用组织培养和动物模型进行的研究表明，野生型p53可能对放疗和热疗联合治疗的效率产生积极影响。此外，一些临床研究表明，肿瘤的p53状态可能是基于热疗的治疗取得成功的重要预测48，74。其他的研究表明，细胞凋亡率，而不是p53状态是临床结果的更好的预测47，75。在这方面，我们在研究中获得的分子见解尚无定论：虽然瞬时诱导细胞周期阻滞可保护主动循环的细胞在非允许温度下进入有丝分裂状态，否则可通过有丝分裂灾难导致有效的细胞杀伤，而在高于41°C的温度表明p53野生型癌细胞可能在这些条件下更易诱导凋亡或衰老。这在肉瘤中经常观察到p53功能通过其负调控因子Mdm2的扩增而被禁用的情况下尤其重要。76，77。此外，Hsp90在p53网络中的多种功能可能有助于癌症治疗中的积极作用：热疗过程中积累的Hsp90在恢复常温后可能会促进不稳定的突变体p53的重折叠，从而弥补癌细胞的功能缺陷。在未来的研究中确定突变p53响应不同温度下的辐射的动力学，并系统比较具有和不具有活性p53的细胞中联合治疗的结果将是有趣的。无论如何，观察到的热疗对p53动力学的即时和可逆作用以及p53信号网络对热暴露的适应性提供了分子证据，表明放射疗法和热疗的精确时机是成功联合疗法的关键参数78，79。使用我们的组合计算和实验性单细胞方法进行的进一步研究将使我们能够更深入地了解各种物理状态和细胞状态如何影响p53网络的功能以及如何利用它来设计更有效的肿瘤疗法。
表达p53-mVenus的人肺癌细胞系A549在59之前已有描述。简而言之，其表达在人EF1A启动子的控制下与mVenus编码序列融合的p53 cDNA，以及在人泛素C启动子的控制下与mCerulean编码序列融合的组蛋白H2B cDNA。我们在补充了10％胎牛血清（FCS；德国达姆施塔特的赛默飞世尔科技公司）以及青霉素和链霉素的McCoy's 5 A（GE Healthcare Life Sciences，德国弗莱堡）中维护了这些细胞。加入选择性抗生素G418（400μg/ ml，卡尔·罗斯，德国卡尔斯鲁厄）和潮霉素（50μg/ ml，Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）以维持转基因表达。
表达p53-mVenus和p21-mCherry的女性人类未转化乳腺上皮细胞系MCF10A在61之前已有描述。简而言之，使用Cas9介导的基因组工程将荧光蛋白的编码序列插入内源基因位点。染色质相关蛋白Cbx5用mCerulean标记以用作核标记。将细胞维持在具有5％马血清，20ng / ml EGF，0.5mg / ml氢化可的松，100mg / ml霍乱毒素和10mg / ml胰岛素的DMEM / F12中。所有培养基均包含2 mM Glutamax，100 U / ml青霉素和100 mg / ml链霉素。如果没有另外说明，将所有细胞系在37℃和5％CO 2的饱和湿度下培养。
我们播种了1×10 5实验前2天，在ibiTreat聚合物底部平板（ibidi，Martinsried，德国）中的细胞。当指示时，将细胞在给定温度下平衡14小时。实验当天，将培养基替换为缺少酚红和核黄素的FluoroBrite培养基（Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）。用X射线辐射以1 Gy / 26 s（250 KeV，10 mA）的剂量率处理细胞。我们使用尼康DS-Qi2相机和20×Plan Apo物镜（数值孔径0.75）在尼康Ti倒置荧光显微镜（尼康，德国杜塞尔多夫，德国）上使用适当的滤光片组（金星：500 / 20-nm激发[ EX]，515 nm二向色分束器[BS]，535/30 nm发射[EM]； CFP：436/20 nm EM，455 nm BS，480/40 nm EX）。如图所示，显微镜用孵育箱封闭，该孵育箱的温度设置为33°C至41°C。气氛保持在5％CO2浓度和饱和湿度。使用Nikon Elements软件59在实验过程中每15分钟对细胞成像一次。
在整个实验过程中，使用基于Alon实验室80和CellProfiler项目81开发的自定义编写的MATLAB（MathWorks）脚本跟踪细胞。。简而言之，我们在使用阈值和种子分水岭算法从核标记图像分割单个核之前，对原始图像应用了平场校正和背景减法。然后使用贪婪匹配算法将分段的单元格分配给后续图像中的相应单元格。仅考虑从第一个到最后一个时间点跟踪的单元。为了进行分析，我们从第一个时间点到最后一个时间点向前跟踪了单元格。分割后，我们跟随最接近母亲最后一个位置的子细胞，并合并了来自母亲和后代的足迹。使用来自核标记图像的二元掩模，我们量化了p53 / mVenus通道中的平均核荧光强度。
在分析之前，我们使用定制的过滤器对数据进行预处理，以去除与诱导反应无关的生物事件中的技术噪声和信号。为了消除由分割和跟踪误差引起的尖峰和持续强度变化，我们基于由处理轨迹的标准偏差定义的特定于细胞的阈值，识别了这些特征，并用线性插值代替了它们。尖峰和持续移动的定义是，减小后加一或增加后减一均大于加工轨迹的标准偏差。消除峰值和持续变化的过程是反复进行的。由于局部平滑，这导致信噪比增加，强调了较慢变化的生物学响应。由于在有丝分裂期间核被膜破裂，并且形态变化导致自发荧光增加，因此我们忽略了细胞分裂期间测得的信号，并通过插值将其从轨迹中移除。为了识别细胞分裂，我们将每个细胞的核面积和核标记的整合荧光强度归一化为它们各自的平均值，通过上述方法对其进行平滑处理，并通过求平均来合并两个轨迹。然后，我们将1D Prewitt滤波器（长度为75分钟）应用于组合轨迹，以放大与细胞分裂相对应的信号不连续性。细胞分裂事件对应于基于数百个视觉检测到的细胞分裂的Prewitt滤波轨迹的值超过手动选择的阈值82。
结合不同的延时显微镜实验并非易事，因为存在多种可变性，即使在相同的实验环境中，荧光强度的分布也不同。这些包括生物来源，例如细胞系用途的不同传代数，以及技术来源，例如不同的光源。为了克服比较不同实验的局限性，我们提出了一种旨在通过使所有实验适合一个参考实验来减少实验间偏差的方法。我们的方法基于以下中心假设：对于具有可比较的测量分布的所有实验，我们拥有一组恒定的测量。在这种情况下，度量的所有偏差都可以直接与数据采集中其他非生物异质性来源相关。在我们的实验设置中，我们为每个实验在37°C下孵育的细胞在第一个时间点都没有施加辐射，因此我们假设它们具有相似的分布。在以下示例中，我们还假设所有实验中的单元格数量均相等。在我们的数据集中情况并非如此，这要求我们采用其他内插或外推步骤。
设E ijk为我们的实验度量集，其中i为实验，j为时间点和单元格k。我们假设所有实验在时间点j = 1时都具有相同的实验条件，并将一个实验x设置为参考。为了使另一个实验y适应实验x，我们使用以下计算。核心部分是系数权重的估计。我们从权重 = sort（E（x，1，：））./ sort（E（y，1，:)）开始计算系数。在接下来的步骤中，我们使用权重将实验y拟合到通过将系数应用于每个时间点来x。
这个想法是，非生物误差会随时间变化，并且我们可以在假设相同条件的时间点估计误差。在补编图 1中，我们介绍了此归一化方法的一些结果。所提供的数据表明，在不同实验条件之间进行归一化后，时间动态和响应强度的差异得以保留。这种方法使我们有机会直接比较细胞群体中p53丰度的标准化测量。
在不同的音高检测算法中，AMDF是最常用的。RossF 等人提出了自相关分析的一种变体AMDF 。在1974年62，它用于实时应用，因为它涉及较少的计算量83。我们使用的窗口长度在4.5 h-7 h之间，并假设音调周期下限为2 h。为了鲁棒性，我们针对不同的窗口尺寸计算了不同的间距位置，并针对某个间距位置使用了总窗口尺寸的平均值。
特征检测的目的是识别时间序列数据中的模式。通常，我们的目标是在数据中找到脉冲。但是，我们的方法并不局限于我们想要在数据中识别的模式类型，该模式可以具有或多或少的复杂形式。
所提出的方法分两步进行。首先，我们使用基于局部最小值和最大值的波段（图2B，C）对每个轨迹进行归一化 ，然后基于像动态时间规整64方法那样的Smith-Waterman 65进行检测。在下文中，我们将详细描述这两个步骤。
频带归一化基于用于在每个轨迹周围生成频带的时间序列数据在开始常数处进行计算。这些常数定义频带的不同属性，例如宽度，下限的最大值和上限的最小值。使用这些常量和过去和将来的锚点，我们为每个轨迹估计一个波段，如Suppl所示。图 2B。锚点是轨迹的简单扩展。然后，我们使用频段通过对每个时间点从测量值和上限减去下限，然后将测量值的减小值除以上限的减小值，来对轨迹进行归一化。这会将轨迹归一化为介于0到1之间的固定范围（图 2C）。）。频带归一化的思想是强调数据中较长时间尺度上的波动，这对于下一步正常工作是必需的。
在下面的特征检测步骤中，我们应用调整后的动态时间扭曲方法来查找长度为4 h的0-1范围内的对称峰模式。在该方法的其他应用中，该图案可以具有完全适合特定需求的形状。为了找到定义的模式，首先我们启动了评分矩阵，如文献64所述除了图案可以在轨迹的每个位置开始和结束的事实之外。这可以简单地通过在开始步骤将零放在得分矩阵的第一列上并将无穷大放入上一行（假定各列对应于模式中的值）来实现。填写评分矩阵后，我们通过从最后一列中的局部最小值进行回溯来找到模式出现的起点和终点。为了提高结果，我们随后过滤重叠的事件。
有了脉冲的起点和终点，我们可以直接提取不同模式的几个特征（图 2A）。补充 图 2D以假色表示示出了所识别的脉冲，其按照第一检测到的脉冲结束的时间长度进行分类。
为了增强小脉冲，特别是在非辐射情况下，我们已经应用了图像处理技术。首先我们根据温度从最短到最长降低后第一个检测到的脉冲的长度对轨迹进行排序。然后，我们对排序的时间序列数据的数据矩阵应用了高斯滤波器（11×11）。在过滤结果上，我们应用了一个附加的中值过滤器（31×31）。我们使用了两个滤波后的数据矩阵之间的差异来增强数据中的脉冲，如图 5C，D所示。
我们使用高纯度RNA分离试剂盒（Roche，曼海姆，德国）提取了mRNA。使用ProtoScript逆转录酶（NEB，伊普斯威奇，MA）和oligo-dT引物生成cDNA。使用SYBR Green试剂（Roche，巴塞尔）在StepOnePlus PCR仪（Thermo Fisher Scientific，Darmstadt）上进行三次定量PCR。引物序列如下：BAX正向，CTG ACG GCA ACT TCA ACT GG；BAX反向，GAT CAG TTC CGG CAC CTT GG；GADD45前进，GCA ATA TGA CTT TGG AGG AAT TCT C；GADD45反向，TGA CTC AGG GCT TTG CTG；XPC前进，GTC TCT ACA GCC AAT TCC TCT G；XPC反向，CCT TTG CTG GTC TTT GGT TTG ；p21向前，TGG ACC TGT CAC TGT CTT GT，p21反向，TCC TGT GGG CGG ATT AG。
实验前两天将细胞铺在6厘米的培养皿中。使细胞暴露于10 Gy X射线辐射，在指定的时间点通过胰蛋白酶消化收集细胞，用1xPBS洗涤，用冰冷的80％乙醇/ 20％1xPBS固定，并保存在-20°C下直至收集所有样品。对于流式细胞仪分析，将细胞用1xPBS洗涤，在0.1％Triton 1xPBS和0.2mg / ml RNase A中的25mg / ml PI染色，并在Cytomics FC500细胞仪（Beckman Coulter）上进行分析。根据FlowJo软件（FlowJo，LLC）中的DNA含量确定细胞周期阶段。
Matlab（Mathworks）用于分析和处理数据。所有跟踪的单元的时间序列数据以及数据分析脚本都可以在线获得（https://doi.org/10.25534/tudatalib-34）。根据合理的要求，原始图像数据和图像分析脚本可从相应的作者处获得。
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